De células T isolamento da população Side em Myc induzida por leucemia linfoblástica aguda no peixe-zebra

O objetivo geral deste procedimento é isolar células da população lateral a partir de um modelo de peixe-zebra de leucemia linfoblástica aguda de células T induzida por myc. O ensaio de população lateral tem sido utilizado para identificar populações de células-tronco e progenitoras em diversos tecidos normais e tumorais. No entanto, ainda não foi aplicado a nenhum modelo de câncer em peixe-zebra.

A principal vantagem desta técnica é que ela permite o isolamento prospectivo de uma população de células em T-ALL de peixe-zebra que pode estar enriquecida para atividade de células-tronco cancerígenas. Embora o método que descrevemos aqui tenha amplas aplicações na pesquisa de leucemia em peixe-zebra, ele também pode ser aplicável a outros tipos celulares malignos e não malignos desse organismo. Indivíduos novos nesta técnica podem ter dificuldades, pois o método é sensível a alterações sutis.

Embora o método pareça simples, é necessária uma otimização para cada tipo de célula testado. Prepare 20 mililitros de FBS a 10 por cento inativado pelo calor em PBS 0,9x. Adicione um mililitro da solução de FBS/PBS a um frasco de sal de heparina sódica contendo 300 unidades do anticoagulante.

Em seguida, utilizando um microscópio epifluorescente, selecione peixes nos quais as células tumorais tenham invadido 50 por cento do corpo, ou peixes identificados com dificuldade para se alimentar ou nadar. Eutanazie o peixe transferindo-o para uma solução de um a dois miligramas por mililitro de tricaina em água para peixes. Observe o animal quanto ao movimento das brânquias e batimento cardíaco para confirmar a eutanásia.

Após remover a cabeça do peixe, injete com uma pipeta 100 microlitros de solução de heparina na sua cavidade corporal para remover os glóbulos vermelhos em excesso. Aspire todo o líquido que sair e pipete-o para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Em seguida, utilizando ponteiras de pipeta novas, lave a cavidade corporal mais duas vezes ou até que a solução de lavagem não contenha mais sangue, e descarte o líquido coletado de todas as lavagens.

Para coletar células leucêmicas, injete 100 microlitros de solução FBS/PBS na cavidade corporal pré-lavada. Sob um microscópio estereoscópico, aplique pressão suave ao corpo do peixe com a ponteira de uma pipeta para expelir as células tumorais. Colete o líquido liberado em um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro.

Repita o isolamento até que a maioria das células tumorais seja coletada. Reúna todas as células no mesmo tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro e mantenha a suspensão obtida em temperatura ambiente. Em seguida, misture as células tumorais isoladas pipetando suavemente para dissociar agregados celulares.

Filtre a suspensão celular através de um filtro de malha de 40 micrômetros. E lave o filtro uma a duas vezes com 100 microlitros de FBS/PBS. Após a filtração, mantenha as células à temperatura ambiente.

Por fim, em um novo tubo, misture dois microlitros da suspensão celular com 18 microlitros de solução estéril de Azul de Tripano a 0,04 por cento. Carregue 10 microlitros da suspensão obtida em um hemocitômetro e conte as células tumorais fluorescentes viáveis. É importante coletar uma amostra limpa de células de LLA-T.

A concentração do Hoechst três três três quatro dois utilizada aqui baseia-se no número de células tumorais vivas coletadas. Detritos celulares adicionais ou células não tumorais podem interferir no ensaio. Antes da coloração celular, dilua o corante Hoechst em água livre de nucleases para obter uma solução de trabalho de um miligrama por mililitro.

Armazene a solução preparada coberta com folha de alumínio a quatro graus Celsius. Em seguida, dissolva 49,1 miligramas de verapamil em um mililitro de DMSO para obter uma solução inibidora de 100 micromolar. A seguir, prepare a amostra adicionando FBS/PBS, 2,5 microlitros de DMSO, 15 microlitros de corante Hoechst a um miligrama por mililitro e 10⁶ células tumorais a um tubo fax com volume final de um mililitro.

Para preparar o controle, adicione FBS/PBS, 2,5 microlitros de verapamil 100 milimolar, 15 microlitros de corante Hoechst a 1 miligrama por mililitro e adicione a 10⁶ células tumorais com um volume final de 1 mililitro. Incube a amostra e o controle em banho-maria a 28 graus Celsius, no escuro, por 120 minutos. Após a incubação, coloque as células imediatamente no gelo e mantenha-as no escuro.

Centrifugue as células a 300 vezes G a quatro graus Celsius por seis minutos. Em seguida, remova o sobrenadante e lave as células com um mililitro de FBS/PBS. Centrifugue as células novamente a 300 vezes G a quatro graus Celsius por seis minutos.

Uma vez que as células estejam em pelota, remova o sobrenadante e re-suspenda as células em um mililitro de FBS/PBS. Mantenha as amostras a quatro graus Celsius até a separação celular. Quinze minutos antes da separação celular, adicione dois microlitros de solução estoque de iodo de propídio a um miligrama por mililitro para cada um mililitro da suspensão celular.

Em seguida, agite bem as amostras em vórtex. Analise as suspensões de células de LLA-T de peixe-zebra coradas utilizando um citômetro de fluxo ativado por fluorescência. Excite as amostras com um laser UV para análise do corante Hoechst e com um laser de 488 nanômetros para detecção de células de LLA-T positivas para iodeto de propídio ou GFP.

O número de células, a concentração do corante, a temperatura de incubação e o tempo de incubação podem precisar ser otimizados para cada tipo celular diferente utilizado. E alterações em cada uma dessas condições podem modificar drasticamente os resultados do ensaio. Para identificar a população lateral entre células de LLA-T isoladas de peixe-zebra, primeiramente os detritos celulares e agregados celulares são excluídos.

A captação de iodeto de propídio e a expressão de GFP em uma única população celular são então analisadas para identificar células tumorais viáveis. Para visualizar a população lateral, as emissões azul e vermelha do corante Hoechst são comparadas. A população lateral aparece como uma cauda tênue de células estendendo-se do lado esquerdo da população celular principal em direção ao eixo da fluorescência azul.

Apresentam-se aqui os resultados da análise da população lateral realizada em duas amostras diferentes de células tumorais. Uma população lateral foi identificada em ambos os espécimes. No entanto, diferentes amostras tumorais continham números variados de células da população lateral.

Independentemente da amostra de tumor analisada, o tratamento da amostra com um inibidor de efluxo como a verapamil resultou no desaparecimento do sinal observado para as células previamente identificadas, confirmando ainda mais o fenótipo de população lateral. Uma vez dominada, a técnica de população lateral em um T-ALL de peixe-zebra pode ser realizada em menos de quatro horas, se for executada corretamente e conforme apresentamos aqui. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar as etapas que foram otimizadas para o T-ALL de peixe-zebra, como temperatura e tempo de incubação, concentração do corante e inibidor de efluxo.

Esses podem precisar ser alterados para diferentes sistemas experimentais. Após este procedimento, outros métodos, como isolamento de RNA ou ensaios de transplante in vivo, podem ser realizados com células da população lateral classificadas para abordar questões relacionadas à funcionalidade e à regulação gênica das células da população lateral. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar a população lateral de células de leucemia linfoblástica aguda de células T de peixe-zebra.