Name: Transplante de Tumores Cerebrais Pediátricos de Zebrafish em Hospedeiros Imune-competentes para Estudo a Longo Prazo do Comportamento de Células Tumorais e Resposta a Medicamentos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Aprenda a transplantar células tumorais cerebrais pediátricas em embriões de zebrafish imunocompetentes para análise de longo prazo do comportamento tumoral e resposta a fármacos in vivo.

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Agradecemos aos dois revisores por excelentes sugestões e melhorias ao manuscrito. Agradecemos também Huntsman Cancer Institute / Universidade de Utah para a pecuária e manutenção. Este trabalho foi financiado pela American Cancer Society (# 124250-RSG-13-025-01-CSM), um NIH subvenção (P30 CA042014 CRR programa), a Universidade de Utah Seed Grant, e Huntsman Cancer Foundation.

Todos os procedimentos com animais foram aprovados e seguiram as diretrizes de cuidados com animais do Comitê de Uso e Cuidados de Animais Institucionais da Universidade de Utah (IACUC # 16-03019). 1. Preparação do equipamento para a microinjecção <ol><li> Preparação da placa de injecção. <ol><li> Preparar uma solução de 50 mL de agarose a 1,2% dissolvido em água de ovo (0,6 g / L de sal de aquário em água de osmose inversa + 0,01 mg / L de azul de metileno). Ferva a solução até que a agarose se dissolva e, em seguida, suplementar adicionando 0,05 mg / L de azul de metileno. Despeje 25 mL da solução final em uma placa de Petri de 10 cm e deixe solidificar. Colocar os restantes 25 ml de solução de agarose num banho de água a 42 ° C até à fase 1.1.2. </li><li> Coloque um copo de 2 polegadas de diâmetro no centro da superfície solidificada e despeje os 25 ml restantes de agarose a 1,2%. NOTA: Isto cria uma superfície de injeção na periferia da placa e um núcleo no centro, queFornece uma área para testar o tamanho da agulha e a consistência da suspensão do tumor. <ol><li> Manter a placa de injecção a 28 ° C durante pelo menos 30 minutos antes da injecção ou a 4 ° C para armazenamento a longo prazo. </li></ol></li></ol></li><li> Preparação de agulhas para injecção. <ol><li> Faça as agulhas puxando capilares de 10 cm com uma dimensão exterior de 1,2 mm e uma dimensão interna de 0,9 mm (sem filamento) em duas agulhas num extrator de agulha. NOTA: Cada agulha deve medir 6 cm de comprimento total, onde aproximadamente 1,5 cm da extremidade é afilada. </li><li> Coloque cuidadosamente a agulha em uma lâmina de microscópio envolto em filme de parafina de plástico. Use uma lâmina de barbear para cortar a ponta da agulha em um ângulo de 45 ° para criar uma agulha com uma abertura na ponta. NOTA: Normalmente, são retirados 0,1 mm a 0,3 mm da extremidade da agulha. Não é necessária uma ponta chanfrada para efectuar as injecções. </li></ol></li><li> Prepare a configuração de microinjeção. <ol> &lt;&gt; Disponha uma configuração padrão de microinjeção, incluindo um estereomicroscópio, um manipulador e um microinjetor para o transplante. </li></ol></li></ol> 2. Preparação de Embriões para Transplante <ol><li> Recolher até 500 mitfa w2 embriões 44 (ou embriões de qualquer outro zebra peixe genótipos como definido pelo usuário) como descrito 45 e manter em um 28 ° C incubadora. </li><li> Dechorionate os embriões em 24 hpf, adicionando 100 μL de 10 mg / mL solução de cocktail de protease diluído em água de ovo e suavemente rock por aproximadamente 20 min. Enxaguar os embriões 3 vezes com água fresca de ovo para remover a protease residual. </li><li> Tela os embriões em 48 hpf para o estágio de desenvolvimento apropriado, como definido pelos critérios padrão da série de estadiamento 45 . Nota: Só devem ser utilizados embriões correctamente colocados e morfologicamente normais para o transplante. </li><li> AnestesiarAproximadamente vinte embriões de 48 hpf em água de ovo contendo 0,002% de Tricaine-S numa placa de Petri. Confirme a anestesia adequada observando a cessação do movimento. </li></ol> 3. Fazendo uma Suspensão de Células Tumorais NOTA: Zebrafish cérebro tumor modelos podem ser gerados geneticamente engenharia combinações de oncogenes e tumor supressor genes 17 , 46 , 47 . Aqui, utilizou -se o modelo de peixe- zebra CNS-PNET NRAS WT , p53 zdf1 / zdf1 impulsionado pelo sox10, tal como descrito recentemente 17 . <ol><li> Eutanizar um peixe com tumor cerebral cuja carga tumoral é aproximadamente 20% do tamanho total do corpo usando uma sobredose de Tricaine-S de 0,4% seguida de imersão em água gelada de acordo com protocolos aprovados pelo IACUC. </li><li> Dissecar o tumor marcado fluorescentemente com uma lâmina de barbear e pinças sob uma fluorescênciaMicroscópio usando a técnica estéril e colocá-lo em 5 mL de solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS). NOTA: Os métodos de dissecação exactos serão definidos pelo utilizador e dependentes do tipo de tumor e localização do tecido. Ver as referências listadas para procedimentos detalhados para a dissecção de diferentes órgãos zebrafish e tumores cerebrais 17 , 48 . </li><li> Manualmente perturbar a massa tumoral usando uma pipeta p1000 até que uma solução uniforme, turva se desenvolve. Remova partículas grandes com uma ponta de pipeta ou usando um filtro de células de 40 μm (isto é dependente do tumor). Centrifugar a suspensão à temperatura ambiente durante 5 min a 290 xg e remover o sobrenadante. Nota: A triagem celular activada por fluorescência (FACS) não é realizada para isolar células tumorais. Isto permite a transplantação de uma população heterogénea de células estromais, imunes e tumorais. </li><li> Ressuspender o sedimento de células tumorais em 100 μL de PBS estéril e transferi-lo para um micro de 1,5 mLTubo de centrifugação. Tomar 5 μL da suspensão celular e diluí-la em 250 μL de PBS. Contar o número de células usando um hemocitômetro. Centrifugar a suspensão durante 3 min a 290 xg, remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em PBS estéril para obter a concentração celular desejada. NOTA: Tipicamente, as células ressuspensas em 30-40 μL de PBS estéril produzem uma solução viscosa e opaca (concentração de células ≥ 100 células / nL) e tendem a gerar os transplantes mais bem sucedidos. A viabilidade celular não é avaliada. </li><li> Armazenar a suspensão do tumor em um bloco de calor de 28 ° C durante o procedimento de transplante. </li></ol> 4. Injetando a Suspensão do Tumor no Quarto Ventrículo de um Embrião de 2 dpf <ol><li> Transferir 10-20 embriões anestesiados (do passo 2.4) para a periferia da placa de injecção utilizando uma pipeta de transferência; Os embriões devem cair lateralmente sobre a placa de injeção, com os ventrículos claramente visíveis e acessíveis. Use uma ponta angular para ajustar os embriões conforme necessário e posicione-os longe da borda externa da placa de injeção. </li><li> Carregar 1-2 μL da suspensão de células tumorais na agulha de injecção utilizando pontas de pipeta de carga de gel e inserir a agulha no manipulador. </li><li> Abaixe manualmente o manipulador, segurando a agulha em um ângulo de 45 °. Ajuste os botões no micromanipulador nas direcções x, y e z até a agulha estar logo acima e aproximadamente 5 mm à direita da cabeça do embrião. Olhe através das oculares do estereomicroscópio e lentamente ajustar o micromanipulador na direção x até que a agulha perfura o quarto ventrículo do embrião. Não permita que a agulha perfure o coração ou a gema. <ol><li> Empurre o pedal de pé ligado ao microinjector para injectar a suspensão de células tumorais. NOTA: A pressão e o tempo de injeção variam de acordo com o tamanho do furo da agulha, mas um bom ponto de partida é 5 - 10 PSI e 50 - 100 ms.O volume de células tumorais injectadas pode ser avaliado com técnicas de gota de óleo convencionais por injecção em óleo mineral, se desejado 49 . Injecções de 500 pL com um diâmetro de gota de 0,1 mm tipicamente dão os melhores resultados. </li></ol></li><li> Enxaguar suavemente os embriões injetados da placa de injeção e em uma placa de Petri usando água de ovo fresco. Manter os embriões em água de ovo para os procedimentos restantes ou até que eles sejam cultivados em tanques (como descrito no passo 4.9.1). </li><li> Inspecionar os embriões injetados sob um estereomicroscópio de fluorescência. Confirmar que a pressão de injeção, ângulo, tamanho da agulha e viscosidade da suspensão celular resultam em células tumorais que enchem 25-50% do espaço ventricular. Ajuste esses parâmetros conforme necessário. </li><li> Repita os passos 4.1-4.5 para quaisquer embriões restantes. Anestesiar os embriões adicionais conforme necessário (descrito no passo 2.4). NOTA: Um usuário experiente pode injetar até 300 embriões em 3-4 h. </li><li> Coloque os embriões de voltaA incubadora a 28 ° C durante a noite. </li><li> No dia seguinte, avaliamos a sobrevivência do embrião examinando aspectos morfológicos e fisiológicos, como o desenvolvimento normal do coração e do cérebro, conforme descrito 45 . </li><li> Para o rastreio, anestesiar os embriões, tal como descrito no passo 2.4, 1 dia após o transplante (dpt). <ol><li> Utilizar uma pipeta de transferência para adicionar 4% de metilcelulose no meio de uma placa de Petri e adicionar os embriões à gota de metilcelulose. Oriente os embriões (lado ventral voltado para a fonte de luz) usando uma sonda angulada e tela para um tamanho de enxerto consistente usando um microscópio de fluorescência. Remova quaisquer embriões com células tumorais não confinadas ao ventrículo ou aquelas que contêm células tumorais que abrangem menos de 25% do espaço ventricular. Nota: Enxerto consistente é definido como embriões com uma única massa tumoral que engloba 25-50% do espaço ventricular 17 . Para fins de triagem, use uma fluorescência sTereomicroscope com um objetivo 1X, uma abertura numérica de 0.15, uma ampliação que varia de 0.7-1.6X, e um tempo de exposição de 50 ms a 1 s. Para todas as imagens, utilize o canal de campo claro além do canal GFP ou RFP. </li><li> Para manutenção de tumores, coloque os embriões transplantados em tanques para crescer 45 a 8 dpf (6 dpt). </li></ol></li></ol> 5. Imaging Transplanted Embryos para Comportamentos Celulares <ol><li> Anestesiar os embriões a 3-8 dpf (1-6 dpt) e montar (lado dorsal voltado para a lamela) em 1,2% de agarose de baixo ponto de fusão. Executar imagens de lapso de tempo dos embriões montados usando um microscópio confocal de varredura a laser durante o período de tempo desejado para visualizar comportamentos celulares, como migração, divisão celular ou interações célula-célula, conforme necessário 38 , 43 , 53 . NOTA: Use uma proporção de 1.024 x 1.024, uma velocidade de digitalização de 8 &amp; #181; s / pixel. Utilizar a média da varredura e definir as dimensões da profundidade z para assegurar a captura de toda a massa tumoral (1.000-1.500 μm). Além disso, realize experimentos de 4-h time-lapse, adquirindo uma imagem a cada 10-15 min usando um objetivo de 40x, para monitorar comportamentos invasivos. A sensibilidade do detector irá variar dependendo da intensidade da massa tumoral, ea potência do laser será dependente do microscópio, mas é geralmente recomendado estar entre 15 e 40%. </li><li> Uma vez que a imagem esteja completa, liberte o embrião montado da agarose usando uma ponta angular e transfira-a para uma placa de Petri com água fresca de ovo. </li></ol> 6. Administração de fármacos para embriões transplantados e avaliação da carga tumoral 17 <ol><li> Anestesiar os embriões a 3 dpf e orientá-los em 4% de metilcelulose, com o lado ventral voltado para a fonte de luz. Imagem dos embriões pré-tratamento utilizando um microscópio de fluorescência 17 . </li><li> PlaEm embriões transplantados a 3 dpf em uma placa de 12 poços, com 10 embriões por poço em 0,5 mL de água de ovo. Adicionar a quantidade apropriada de fármaco para obter a concentração final desejada ( por exemplo, inibidor de MEK 50 μM) e devolver os embriões a uma incubadora a 28 ° C. No dia seguinte, remova a água do ovo tratada com fármaco com uma pipeta de transferência de furo fino e adicione tratamento fresco. Repita isso diariamente até que os embriões atinjam 8 dpf. </li><li> Em 8 dpf, retire os embriões do tratamento de droga e colocá-los em água de ovo fresco. Anestesiar os embriões e orientar (face ventral voltada para a fonte de luz) em metilcelulose a 4%. Image embriões pós-tratamento usando um microscópio de fluorescência. Quantificar a área do tumor usando o software apropriado, conforme descrito 17 . </li><li> Separe os embriões conforme apropriado por tratamento e coloque-os em tanques para crescer. Após 4-9 semanas, anestesiar o peixe e avaliá-los para carga tumoral global usando um estereomicroscópio de fluorescência padrão, como dEscreveu 17 . </li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este protocolo detalha um ensaio de transplante simples e eficiente que envolve a injeção de células tumorais de peixe-zebra no ventrículo de um embrião de 2 dpf que desenvolverá um sistema imunológico plenamente competente. Até agora, o peixe-zebra CNS-PNET 17 e o melanoma (dados não apresentados) foram transplantados com sucesso para estudos a longo prazo do comportamento e invasão de células tumorais. As etapas críticas deste protocolo incluem assegurar o tamanho apropriado do furo da agulha e a adequada suspensão de células tumorais e embriões hospedeiros adequadamente anestesiados. Para cada pesquisador individual, a optimização adicional desta técnica pode incluir o ajustamento da concentração de células tumorais, a pressão de injecção e a orientação do embrião. Além disso, pode haver heterogeneidade na viscosidade de suspensões originárias de diferentes tumores, pelo que diferentes tipos de tumores podem ser mais ou menos difíceis de re-suspender e transplantar. No entanto, ajustando o tamanho do furo da agulha e usandoAlugue as diluições da suspensão do tumor, é possível superar as dificuldades associadas com as viscosidades tumorais. Em nossa experiência, as razões mais comuns para células esparsas / massas de células inconsistentes no ventrículo são as seguintes: 1) a suspensão de células tumorais é muito diluída; 2) o tamanho do furo da agulha é muito pequeno; 3) o tempo ea pressão da injeção são muito baixos; E / ou 4) tecido remanescente não foram filtrados a partir do tumor e são alojados na agulha. Quando a suspensão de células tumorais sai do ventrículo após a injecção, é provavelmente devido a: 1) a colocação da agulha contra o pavimento do ventrículo; 2) uma alta pressão e tempo de injeção; E / ou 3) um tamanho de furo da agulha que é demasiado grande. A baixa sobrevivência de embriões transplantados pode ser causada por: 1) embriões anestesiados por um longo período de tempo; 2) deixar os embriões na placa de injeção para secar; 3) a injecção de bolhas de ar no ventrículo; E / ou 4) órgãos vitais penetrantes, tais como o cérebro eCoração, porque a agulha passou pelo ventrículo. Métodos anteriores de transplante de tumores no cérebro de zebrafish adulto ou embrionário dependem de imunossupressão em adultos (geneticamente, farmacologicamente ou via radiação) ou estão limitados a estudos a curto prazo de células humanas ou de ratinho em embriões 38 , 43 , 52 , 53 , 54 . Por exemplo, tumores cerebrais de ratinho podem ser injectados intranasalmente em dexametasona imunossuprimida, 30-dpf, peixe-zebra juvenil para utilização em ensaios de fármaco pré-clínicos a curto prazo (~ 2 dias) 54 . No entanto, o local de injecção nestes experimentos é obscurecido pelo crânio e tecido cerebral e provavelmente resulta em danos ao tecido cerebral normal, o que reduz a viabilidade do hospedeiro e a eficiência do enxerto. Outro método recentemente descrito envolve a injecção de gliob humanoLastoma na região do mesencéfalo de embriões de peixe-zebra, o que possibilitou a análise de curto prazo do crescimento, invasão e resposta às drogas 43 . Novamente, a localização precisa do local de injecção é variável e provoca danos no tecido normal. Assim, os métodos anteriores de transplante de cérebro embrionário muitas vezes comprometem a viabilidade dos hospedeiros, limitando estes estudos à análise de curto prazo ( isto é, 2 a 14 dias), causando maior variabilidade entre as injeções individuais devido a locais de injeção obscurecidos, Análise de longo prazo de comportamentos celulares e respostas de drogas ou de re-transplante através de várias gerações. O método aqui descrito aborda as limitações atuais em técnicas de transplante embrionário e imunocomprometido do peixe-zebra, permitindo aos pesquisadores: 1) injetar reprodutivamente no mesmo local, com danos mínimos ao tecido circundante; 2) visualizar diretamente o local da injeção para maximizarEficácia do enxerto; 3) transplante centenas de embriões por dia; 4) permitem que os tumores cresçam em animais imunocompetentes; 5) permitem a monitorização do comportamento das células tumorais e respostas duradouras ao fármaco durante a vida do peixe-zebra; E 6) permitem o re-transplante de tumores ao longo de muitas gerações para estudos potenciais sobre a evolução tumoral ou mecanismos de recaída de fármaco. Além disso, este protocolo permite que os investigadores utilizem qualquer genótipo zebrafish para a avaliação da resposta do hospedeiro, incluindo diferentes populações imunes. Esses atributos tornam este método facilmente adaptável por qualquer laboratório que já executa microinjeções padrão em zebrafish. Finalmente, embora este método seja ideal para injeções ortotópicas de tumores cerebrais de peixe-zebra, quando transplantando outros tipos de tumores, como fígado ou pâncreas, o sítio ortotópico pode ser mais importante do que a competência imunológica ( por exemplo, se um pesquisador estiver estudando os efeitos do estroma Microambiente no crescimento tumoral). Neste cenário, oRecém-desenvolvido, imune deficientes zebrafish modelos podem ser mais adequados para a realização de transplantes de tumor ortotópico [ 11] . Este protocolo tem sido utilizado para realizar ensaios de competição de células tumorais e para injectar tumores duplamente marcados. Foi também discutida uma potencial estratégia de tratamento para a avaliação da eficácia de compostos químicos na tumorigênese, que envolve o tratamento de embriões pós-transplante através da adição do fármaco à água. Um método para o tratamento ex vivo de células tumorais antes da transplantação também foi relatado anteriormente 17 . Adicionalmente, os tumores transplantados foram agrupados para várias rondas de re-transplante, o que será benéfico para estudos de evolução tumoral e quimiorresistência 17 . Actualmente, os estudos pré-clínicos dependem de xenoenxertos de ratinho para avaliar a eficácia de compostos potenciais. No entanto, esses estudos levam muito tempoE caro. Considerando o elevado grau de conservação das vias de sinalização oncogénicas entre o peixe-zebra e os seres humanos 28 , é de esperar que este método complementará estudos convencionais de células humanas e de ratinho para permitir a identificação mais rápida de compostos eficazes entrando em ensaios clínicos e pré-clínicos. Em última instância, este método poderia revelar-se útil para o rastreio químico rápido de tumores de pacientes primários, o que poderia impulsionar ainda mais a iniciativa de medicina personalizada. No entanto, as condições para o crescimento a longo prazo de células humanas em peixe-zebra (adulto ou embrião) ainda precisam ser identificados.

O transplante de células tumorais em animais imunocomprometidos, particularmente xenoenxertos de ratinho, é uma técnica amplamente utilizada utilizada para estudar mecanismos que controlam a proliferação de células cancerígenas 1 , 2 , sobrevivência, invasão e metástase 3 , 4 , bem como para proporcionar uma plataforma Para rastreio de fármacos 5 , 6 , 7 . Mais recentemente, o transplante de amostras de tumor primário em ratinhos imunocomprometidos tem sido utilizado para gerar modelos de xenoenxertos (PDX) derivados de pacientes para fins de diagnóstico e pré-clínica de drogas e é a espinha dorsal da iniciativa de medicina personalizada 8 , 9 , 10 , 11 . Contudo, evidências significativas mostram que a modulação do sistema imunológicoTronco pode ter um impacto dramático no comportamento do tumor e no resultado do paciente 12,13 . Isto levou ao redesenho de técnicas baseadas em xenoenxerto para incluir ratinhos &quot;humanizados&quot;, nos quais o sistema imunitário do ratinho é reconstituído por co-transplante de células imunitárias humanas com células tumorais. No entanto, essa abordagem ainda é tecnicamente desafiadora, com reprodutibilidade variável e toxicidades associadas à técnica, além do custo significativo 14,15. Assim, são necessárias novas técnicas de transplante em animais imunocompetentes para acelerar a descoberta de mecanismos específicos de tumores e de imunidade de progressão do cancro e resposta a fármacos. Zebrafish são um modelo animal alternativo para o estudo do câncer humano, com mais de 20 modelos de câncer agora estabelecidos 16 , incluindo cérebro muito maligno 17 , mela<html> Noma 18 , 19 , 20 , e cancros pancreáticos 21 , 22 , bem como muitas leucemias 23 , 24 , 25 , 26 , 27 . Dois atributos do sistema de peixe-zebra torná-lo particularmente adequado para a investigação do cancro: 1) a clareza óptica de animais translúcidos permite a visualização direta de comportamentos de células cancerígenas ( ie, proliferação, sobrevivência, invasão e disseminação) usando técnicas de microscopia simples e 2) O zebrafish fêmea pode produzir até 200 embriões por o dia, permitindo a escala rápida de números animais para a seleção genética ou da droga a um custo baixo. Além disso, os genomas de câncer de peixe-zebra e humanos são altamente conservados (incluindo oncogenes e genes supressores de tumor)Permitindo que as descobertas mecânicas e medicamentosas sejam rapidamente traduzidas em sistemas de mamíferos, o que torna o peixe-zebra um modelo animal ideal para técnicas de transplante, que se aproveitam da imagem, escalabilidade e baixo custo do sistema. Estudos anteriores de transplante de tumores em zebrafish imunocomprometidos facilitaram a identificação de capacidades de auto-renovação, malignidade tumoral e invasão / disseminação 11 , 29 . Estudos a curto prazo do comportamento das células tumorais podem ser conduzidos após o transplante em adultos irradiados com y, cujos sistemas imunológicos são efetivamente suprimidos durante ~ 20 dias 11 , 30 . O tratamento de peixe-zebra adulto com dexametasona suprime as células B e T até 30 dias antes da rejeição 31 . Outra estratégia menos comum emprega estirpes clonal zebrafishQue permitem investigações a longo prazo em um hospedeiro imune-competente 32 . No entanto, apenas um número limitado de estirpes clonais foram geradas e são difíceis de manter devido à baixa fecundidade. Além disso, a maioria dos modelos de tumor zebrafish estabelecidos são gerados em outros antecedentes genéticos, por isso estes tumores não podem ser transplantados para as cepas clonais sem suprimir o sistema imunológico 11 , 33 , 34 . Abordagens mais recentes para melhorar os estudos de transplante a longo prazo incluem o desenvolvimento da linha mutante rag2 E450fs , com comprometimento das funções das células B e T, que tem sido utilizada para transplantar com sucesso vários tipos de câncer 35 , 36 . Para contornar a exigência de linhas de peixe-zebra clonal ou um hospedeiro imunocomprometido, vários grupos utilizaram embriões de fase inicial ( isto é, &gt; 72 hpOst-fertilization (hpf)) para o transplante de células tumorais humanas, uma vez que estes embriões ainda não desenvolveram completamente um sistema imunológico adaptativo 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 . No entanto, estes métodos limitam-se à análise a curto prazo do comportamento das células tumorais ou da resposta ao fármaco (normalmente menos de 2 semanas), porque as células de cancro humano ou a técnica de transplante própria mata o hospedeiro, prevenindo estudos a longo prazo e re-transplante. Este protocolo detalha um método de transplante embrionário modificado para o lúmen do quarto ventrículo de um cérebro de embrião de 2 dias pós-adubação (dpf). Ele minimiza a toxicidade para o hospedeiro e pode ser combinado com zebrafish cérebro tumor modelos para o enxerto de longo prazo de células tumorais. Assim, esta técnica alBaixos para o re-transplante de células tumorais em novos hospedeiros ao longo de muitas gerações, facilitando futuros estudos sobre heterogeneidade tumoral, hospedeiro / respostas imunes, respostas a fármacos ou potencial metastático. Este método também é simples, eficiente e escalável, já que até 300 transplantes podem ser realizados por um único usuário por dia, com até 90% de enxerto. Isto permite a propagação rápida de tumores primários únicos em centenas de embriões a 2 dpf para projetos genéticos ou de rastreio de drogas ou para visualizar diretamente o comportamento de células tumorais cerebrais em diferentes origens de hospedeiro ao longo de muitos meses.

<table><tbody><tr><td>Água de ovo</td><td>em casa</td><td></td><td>mantendo embriões, fazendo placa de injeção&nbsp;</td></tr><tr><td>Azul de Metileno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td>adicione à água do ovo para prevenir o crescimento de fungos</td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Thermo Fisher</td><td>FB0875711Z&nbsp;</td><td>embriões de alojamento, fazendo a placa da injeção</td></tr><tr><td>Copo de 50 mL (diâmetro de 2 polegadas)</td> <td>Qualquer marca</td><td></td> comercial <td>fazendo placa de injeção</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Denville</td><td>CA3510-8</td><td>fazendo placa de injeção</td></tr><tr><td>Recipiente de Vidro</td><td>Qualquer marca</td><td></td> comercial <td>fazendo placa de injeção</td></tr><tr><td>Pinças</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>11295-10</td><td>dissecção de tumor</td></tr><tr><td>Lâmina de barbear</td><td>Thermo Fisher</td><td>12640</td><td>preparação de agulha, dissecção de tumor</td></tr><tr><td>Lâmina de vidro envolvida em parafilme</td><td>Qualquer preparação de agulha de marca</td><td></td><td></td>comercial</tr><tr><td>Tampão com fosfato Salino 1x, pH 7.4</td><td>Life Technologies</td><td>10010023</td><td>ressuspensão de tumor</td></tr><tr><td>Filtro de células, 40 &micro; m</td><td>Corning Falcon</td><td>352340</td><td>ressuspensão tumoral</td></tr><tr><td>1.000 &micro; L pontas de filtro</td><td>qualquer ressuspensão de tumor de marca</td><td></td><td></td>comercial</tr><tr><td>100 &micro; Filtro L</td><td>derruba qualquer ressuspensão de tumor de marca</td><td></td><td></td>comercial</tr><tr><td>Tubos cônicos de 50 mL</td><td>Genesee Scientific&nbsp;</td><td>21-108</td><td>ressuspensão tumoral</td></tr><tr><td>tubos cônicos de 15 mL</td><td>Genesee Scientific&nbsp;</td><td>21-103&nbsp;</td><td>ressuspensão tumoral</td></tr><tr><td>Microtubos de 1,7 mL</td><td>Genesee Scientific&nbsp;</td><td>24-281</td><td>ressuspensão tumoral</td></tr><tr><td>Micropipetas</td><td>Qualquer marca</td><td></td> comercial <td>de ressuspensão tumoral e transplante</td></tr><tr><td>Capilar de vidro (sem filamento)</td><td>World Precision Instruments</td><td>&nbsp; TW120-4</td><td>transplante de tumor</td></tr><tr><td>Extrator de agulha</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td>transplante de tumor</td></tr><tr><td>Pontas de microcarregador</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td>transplante de tumor</td></tr><tr><td>Microinjetor</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PLI-90</td><td>transplante de tumor</td></tr><tr><td>Tricaine-S (MS-222)</td><td>Western Chemical</td><td>TRS1</td><td>transplante de tumor, anestésico</td></tr><tr><td>Sonda angular</td><td>Fine Science Tools</td><td>10140-02</td><td>manipulação de embriões</td></tr><tr><td>Pipeta de transferência</td><td>Qualquer manipulação de embriões de marca</td><td></td><td></td>comercial</tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>necessária durante a ressuspensão do tumor</td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td>necessária durante a ressuspensão do tumor</td></tr><tr><td>Estereomicroscópio</td><td>Olympus</td><td>Transplante de tumor</td> <td>SZ61</td></tr><tr><td>Estereomicroscópio fluorescente</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td>imagem transplantes de tumor</td></tr><tr><td>Microscópio Câmera</td><td>Olympus</td><td>DP-72</td><td>imagem transplantes de tumor</td></tr><tr><td>Metilcelulose&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7140</td><td>transplantes de tumores</td></tr><tr><td>de imagem Incubadora</td><td>Qualquer marca</td><td></td> comercial <td>que mantém embriões, aquecendo a placa de injeção</td></tr><tr><td>Microondas</td><td>Qualquer marca</td><td></td> comercial <td>que faz a placa de injeção</td></tr><tr><td>Escala</td><td>Qualquer marca</td><td></td> comercial <td>que faz a placa de injeção</td></tr><tr><td>Luvas</td><td>Qualquer marca</td><td></td> comercial <td>todos os aspectos do protocolo</td></tr><tr><td>Agarose de baixa fusão</td> Imagem <td>confocal de embriões</td>de <td>qualquer marca</td><td></td> comercial</tr><tr><td>Placa de fundo de vidro</td><td>Mattek Corporation</td><td>P35G-1.0-20-C</td><td>imagem confocal de embriões</td></tr><tr><td>Microscópio confocal de varredura a laser</td><td>Olympus</td><td>FLUOVIEW FV1200</td><td>imagem confocal de embriões</td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11459643001</td><td>embriões</td></tr> <tr>descorionados<td>PBS</td><td>Qualquer marca</td><td></td> comercial <td>ressuspende células tumorais/tumorais</td></tr><tr><td>Placa de 12 poços</td><td>Qualquer marca</td><td></td> comercial <td>tratamento medicamentoso de embriões</td></tr><tr><td>Pipeta de transferência de calibre fino</td><td>Qualquer marca</td><td></td> comercial <td>tratamento medicamentoso de embriões</td></tr><tr><td>Hemocitômetro</td><td>Qualquer marca</td><td></td> comercial <td>Para contagem de células tumorais em suspensão</td></tr><tr><td>N2</td><td>Qualquer marca comercial</td><td></td><td>Para configuração de microinjetores</td></tr></tbody></table>

transplante de tumores cerebrais pediátricos de zebrafish em hospedeiros imune-competentes para estudo a longo prazo do comportamento de células tumorais e resposta a medicamentos

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

O transplante de células tumorais é uma técnica importante para definir os mecanismos que controlam o crescimento das células cancerígenas, a migração ea resposta do hospedeiro, bem como para avaliar a potencial resposta do paciente à terapia. Os métodos actuais dependem largamente da utilização de animais singeneicos ou imunocomprometidos para evitar a rejeição do enxerto tumoral. Tais mï¿½odos requerem a utilizaï¿½o de estirpes genï¿½icas especï¿½icas que muitas vezes impedem a anï¿½ise de interacï¿½es de cï¿½ulas imuno-tumorais e / ou estï¿½ limitadas a antecedentes genï¿½icos especï¿½icos. Um método alternativo no peixe-zebra tira proveito de um sistema imunológico incompletamente desenvolvido no cérebro embrionário antes de 3 dias, onde as células tumorais são transplantadas para uso em ensaios de curto prazo ( isto é, 3 a 10 dias). No entanto, estes métodos causam a letalidade do hospedeiro, o que impede o estudo a longo prazo do comportamento das células tumorais e da resposta aos fármacos. Este protocolo descreve um método simples e eficiente para o transplante ortotópico a longo prazo de tecido de tumor cerebral de zebrafish emAo quarto ventrículo de um peixe-zebra imune-competente de 2 dias de idade. Este método permite: 1) estudo a longo prazo de comportamentos de células tumorais, tais como invasão e disseminação; 2) resposta duradoura do tumor às drogas; E 3) re-transplante de tumores para o estudo da evolução do tumor e / ou o impacto de diferentes fundos genéticos do hospedeiro. Em resumo, esta técnica permite que pesquisadores de câncer avaliem enxerto, invasão e crescimento em locais distantes, bem como para realizar análises químicas e testes de competição celular ao longo de muitos meses. Este protocolo pode ser alargado a estudos de outros tipos de tumores e pode ser utilizado para elucidar mecanismos de quimiorresistência e metástase.

Transplante e enxerto de tumor Um esquema esquematizado do procedimento é representado na Figura 1 . As células tumorais marcadas fluorescentemente são extraídas do local do órgão primário e é gerada uma suspensão de célula única para transplante para o quarto ventrículo de embriões de peixe- zebra w2 de 2 dpf mitfa w2 . A Figura 2 mostra os resultados representativos para este método utilizando um modelo zebrafish de tumor ectodérmico neural primitivo do sistema nervoso central (CNS-PNET), no qual o promotor sox10 dirige a expressão de NRAS de tipo selvagem ou NRAS activado fundido a mCherry em células precursoras oligonucleares deficiente em p53 17 . O mutante mitfa w2 zebrafish 44 , que não possui melanóforos, foi utilizado para visualizar mais prontamenteAs células tumorais após o transplante e / ou na idade adulta. Podem também ser utilizados outros mutantes de pigmento para proporcionar clareza de imagem adicional, tal como Casper 50 . Tão cedo quanto 24 h após o transplante, as células tumorais podem ser vistos invadindo o tecido cerebral circundante ( Figura 2A , 3 dpf, setas). Os enxertos tumorais continuam a crescer no ventrículo e tecido cerebral circundante ao longo da próxima semana ( Figura 2A , 8 dpf). Neste momento, a fluorescência também pode ser observada na região dos rins ( Figura 2A , asteriscos). Isto pode ser devido aos rins que filtram os detritos celulares do transplante, o que é consistente com estudos prévios que utilizam corantes fluorescentes como um ensaio para avaliar a função renal 51 . Células tumorais continuam a proliferar e invadir, por isso em 28 dpf, uma massa tumoral pode ser visto em todo o cérebro peixe-zebra ( Figura 2A , 28 dpf). <p class="jove_content" fo:keep-togetherEsta técnica permite o rápido transplante de células tumorais em centenas de embriões com consistência reprodutível, uma vez que o local da injeção pode ser direcionado com precisão com danos mínimos para o hospedeiro. Um grupo representativo de embriões transplantados com células de tumor cerebral marcadas com mCherry é mostrado no painel superior da Figura 2B . O enxerto tumoral é tipicamente alcançado em 80-90% dos embriões, e os transplantes de tumor persistem até a idade adulta; Três exemplos representativos são mostrados nos painéis inferiores da Figura 2B . Isto permite que os transplantes de tumor sejam colhidos e congelados ou re-transplantados ao longo de várias gerações. Invasão tumoral e respostas aos fármacos A Figura 3A ilustra um esquema de co-transplantação em que dois tumores diferentes marcados com GFP (Tumor A) ou mCherry (Tumor B) são colhidos por todo o tumorOu dissociação (note que o FACS não é usado aqui, mas as células tumorais classificadas por FACS podem ser usadas se necessário). Os tumores A e B podem ser de locais diferentes, induzidos com oncogenes diferentes ou induzidos em diferentes fundos genéticos. Cada tumor é processado numa suspensão de célula única, e as células tumorais são então misturadas juntas numa proporção de 1: 1 e transplantadas para o embrião de 2 dpf. As propriedades tumorais, tais como o enxerto, o crescimento, a invasão e a disseminação do tumor A versus tumor B podem então ser observadas no mesmo hospedeiro que permite controlos internos da técnica e do fundo genético. Na Figura 3B , foi colhido e processado em suspensões de célula única um CNS-PNET zebrafish marcado com NRAS , marcado com mCherry a partir do tectum óptico e um CNS-PNET marcado com GFP do cerebelo. As células foram contadas, e um número igual de células de cada tumor foi misturado em conjunto e transplantado para embriões de 2 dpf. Quatro diasApós o transplante, os embriões foram fotografados com microscopia confocal. Mostrado é um embrião representativo demonstrando que as células tumorais tectum (vermelho) migram mais extensivamente para o cérebro hospedeiro (setas) do que o tumor cerebelar. Os embriões transplantados com células tumorais marcadas fluorescentemente podem ser utilizados em regimes de tratamento de fármacos para identificar compostos que inibem o crescimento tumoral. A Figura 3C é uma linha de tempo típica para tratar e imaginar transplantes de tumor. 24 h após o transplante, os embriões são acedidos por tamanho de enxerto consistente e divididos em grupos de tratamento. No exemplo fornecido, os embriões transplantados com CNS-PNET zebrafish marcados com NRAS , tratados com NRAS são tratados com dimetilsulfóxido (DMSO) 50 μM ou inibidor de MEK (AZD6244). Os embriões são tratados durante 5 dias e formados em imagem a 8 dpf, como delineado na Figura 3C . A figura 3D (painéis esquerdos) mostra<html> E animais dos dois grupos de tratamento. Os embriões tratados com inibidor de MEK têm uma quantidade significativamente menor de fluorescência do que os tratados com DMSO, como descrito 17 . Depois que os animais são fotografados, eles são transferidos para tanques sem drogas e monitorados para o crescimento tumoral durante dois meses. No exemplo fornecido, o tratamento com inibidor de MEK resulta numa resposta duradoura no peixe adulto ( Figura 3D , painéis direitos). Para mais detalhes sobre o tratamento medicamentoso, imagiologia e quantificação, ver referência 17 . <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55712/55712fig1.jpg" /> Figura 1: Esquema de Protocolo de Transplante de Células Tumorais no Quarto Ventrículo de Embriões de Zebrafish de 2 dpf. Esquema geral das seções 3 a 4 do protocolo, incluindo análises de pontos de extremidade alternativas (seções 4.9-6)./55712/55712fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55712/55712fig2.jpg" /> Figura 2: Injerto de tumor e progressão. (A) Zebrafish primário CNS-PNET 17 células tumorais marcadas com mCherry foram transplantadas para o quarto ventrículo de 2 dpf embriões. Em 3 dpf, as células tumorais são vistas invadindo o tecido cerebral circundante (setas). Em 8 dpf, as células tumorais estão crescendo no ventrículo; Vermelho células tumorais também estão presentes no tecido cerebral circundante e rins (asteriscos). Em 28 dpf, as células tumorais invadiram e cresceram em todo o cérebro hospedeiro. (B) Painel superior. Sete embriões de 3 dpf transplantados com células de tumor cerebral zebrafish marcadas com mCherry. As células tumorais podem ser transplantadas consistentemente em centenas de embriões, com altas taxas de enxerto ( isto é, tipicamente 85/100 embriões). Médio eInferior. Três peixes adultos representativos com tumores transplantados 4-8 semanas após a fecundação (wpf). Os tumores podem ser visualizados por microscopia de fluorescência. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55712/55712fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55712/55712fig3.jpg" /> Figura 3: Comparação de Invasão de Tumor e Resposta de Medicamento. ( A ) CNS-PNET 17 a partir do tectum óptico ou cerebelo são marcados com mCherry ou GFP, respectivamente, processados ​​numa suspensão de célula única, misturados em conjunto numa proporção de 1: 1 e co-transplantados em embriões de 2 dpf. ( B ) Um embrião de 6 dpf co-transplantado com uma suspensão mista de células de tumor cerebelar marcadas com GFP e células tumorais marcadas com mCherry a partir do tectum óptico. As diferenças nas propriedades invasivas de cada tumor em tO mesmo receptor pode ser observado usando microscopia de fluorescência. Neste exemplo, as células tumorais marcadas com mCherry migram mais extensivamente do que as marcadas com GFP (setas). ( C ) Cronologia para tratamento com fármaco em embriões transplantados com células tumorais. ( D ) Imagens de animais representativos no final do regime de tratamento (8 dpf) e 8 semanas após o tratamento (8 wpf), quer com um controlo de DMSO quer com um inibidor de MEK 50 μM. A carga tumoral pode ser medida quantificando a fluorescência, como descrito 17 . Nesta experiência, o crescimento de células tumorais marcadas com mCherry é reduzido em embriões tratados com inibidor de MEK e traduz-se numa resposta duradoura no adulto. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55712/55712fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

O transplante de células cancerosas é uma ferramenta importante para a identificação de mecanismos de câncer e respostas terapêuticas. As técnicas atuais dependem de animais imune-incompetentes. Descrevemos aqui um método para transplantar células tumorais de zebrafish em embriões imunocompetentes para a análise a longo prazo do comportamento de células tumorais e respostas de fármacos in vivo .

Transplante de Tumores Cerebrais Pediátricos de Zebrafish em Hospedeiros Imune-competentes para Estudo a Longo Prazo do Comportamento de Células Tumorais e Resposta a Medicamentos

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

O objetivo geral deste procedimento é permitir a avaliação de longo prazo do comportamento de células tumorais, como invasão e disseminação, e testar terapêuticas potenciais em um hospedeiro animal imunocompetente. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área do câncer pediátrico do sistema nervoso central, incluindo a duração da resposta a um fármaco e os mecanismos que impulsionam a invasão e disseminação. A principal vantagem desta técnica é que ela minimiza a toxicidade para o hospedeiro, o que permite o enxerto duradouro de células tumorais e, consequentemente, estudos de longo prazo da biologia do câncer cerebral.As implicações dessa técnica estendem-se à terapia do câncer cerebral porque a carga tumoral pode ser diretamente avaliada in vivo após o tratamento com medicamentos. Geralmente, indivíduos novos nesse método terão dificuldades se a suspensão de células tumorais estiver muito concentrada ou muito diluída, tornando difícil injetar quantidades consistentes no quarto ventrículo. Para começar, prepare uma solução de 50 mililitros de agarose a 1,2% dissolvida em água de ovo.Ferva a solução até que a agarose se dissolva e, em seguida, acrescente 05 miligramas por litro de azul de metileno. Despeje 25 mililitros da solução final em uma placa de Petri de 10 centímetros e deixe solidificar. Coloque os 25 mililitros restantes da solução de agarose em um banho-maria a 42 graus Celsius.Em seguida, coloque um béquer de dois polegadas de diâmetro no centro da superfície solidificada e despeje os 25 mililitros restantes de agarose 1,2% sobre a camada anterior. Mantenha a placa de injeção a 28 graus Celsius por pelo menos 30 minutos antes da injeção ou a 4 graus Celsius para armazenamento de longo prazo. Confeccione as agulhas utilizando um puxador de agulhas para puxar capilares de 10 centímetros com dimensão externa de 1,2 milímetros e dimensão interna de 0,9 milímetros.Coloque cuidadosamente a agulha em uma lâmina de microscópio envolvida em filme de parafina plástica. Em seguida, use uma lâmina de barbear para cortar a extremidade da agulha em um ângulo de 45 graus, criando uma abertura na ponta. Após eutanasiar um peixe portador de tumor cerebral e dissecar o tumor conforme descrito no protocolo, use manualmente um P1000 para disruptar a massa tumoral até que uma solução uniforme e turva seja obtida.Utilize uma pipeta ou um estrainer de células de 40 micrômetros para remover partículas grandes. Em seguida, centrifugue a suspensão a 290 vezes g, à temperatura ambiente, durante cinco minutos e remova o sobrenadante. Re-suspenda o pellet de células tumorais em 100 microlitros de PBS estéril e transfira para um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro.Use 250 microlitros de PBS para diluir cinco microlitros da suspensão celular. Em seguida, use um hemocitômetro para contar o número de células. Centrifugue a suspensão a 290 vezes g durante três minutos.Após a remoção do sobrenadante, utilize PBS estéril para ressuspender o pellet e obter a concentração celular desejada. Armazene a suspensão tumoral em um bloco térmico a 28 graus Celsius durante o procedimento de transplante. Usando uma pipeta de transferência, transfira de 10 a 20 embriões anestesiados para a periferia da placa de injeção.Os embriões devem cair lateralmente, com os ventrículos claramente visíveis e acessíveis. Use uma sonda em ângulo para ajustar os embriões conforme necessário e posicione-os afastados da borda externa da placa de injeção. Em seguida, use uma ponteira para carregamento de gel para carregar um a dois microlitros da suspensão de células tumorais na agulha de injeção e insira a agulha no manipulador.Em seguida, abaixe manualmente o manipulador, mantendo a agulha em um ângulo de 45 graus. Ajuste os botões do micromanipulador nas direções x, y e z até que a agulha esteja logo acima e aproximadamente cinco milímetros à direita da cabeça do embrião. Usando um estereomicroscópio, ajuste lentamente o micromanipulador na direção x até que a agulha penetre no quarto ventrículo do embrião.Não permita que a agulha perfure o coração ou a gema. Para injeções consistentes, os embriões devem ser anestesiados, o tumor deve ser adequadamente dissociado em uma suspensão celular e a agulha deve perfurar o quarto ventrículo, mas sem se estender além, em direção ao coração. Acione o pedal do microinjetor com o pé para injetar a suspensão de células tumorais.Quando terminar a injeção, use água fresca para ovos para lavar suavemente os embriões injetados da placa de injeção para uma placa de Petri. Agora, examine os embriões injetados sob um estereomicroscópio fluorescente em uma sala escura. Confirme que a pressão de injeção, o ângulo, o tamanho da agulha e a viscosidade da suspensão celular resultam em células tumorais preenchendo de 25 a 50% do espaço ventricular.Coloque os embriões novamente no incubador a 28 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, avalie a sobrevivência dos embriões examinando características morfológicas e fisiológicas, como o desenvolvimento normal do coração e do cérebro, conforme descrito anteriormente. Use uma pipeta de transferência para adicionar 4% de metilcelulose no centro de uma placa de Petri e adicione os embriões anestesiados à gota de metilcelulose.Use uma sonda angulada para orientar os embriões e, sob o microscópio de fluorescência, selecione aqueles com tamanho de enxerto consistente. Para a manutenção dos tumores, assim que os embriões atingirem oito dias pós-fertilização, coloque os embriões transplantados em tanques para crescimento. Realize imagens e estudos adicionais conforme o protocolo descrito no texto.Neste experimento, células do tumor neuroectodérmico primitivo do sistema nervoso central foram transplantadas para o mutante de peixe-zebra mitfa que não possui melanóforos. Já em 24 horas após o transplante, é possível observar as células tumorais invadindo o tecido cerebral circundante. Os enxertos tumorais continuam a crescer no ventrículo e no tecido cerebral adjacente durante a semana seguinte, e a fluorescência também pode ser observada na região dos rins.As células tumorais continuam a proliferar e invadir, de modo que aos 28 dias após a fertilização, uma massa tumoral pode ser observada em todo o cérebro do peixe-zebra. Um grupo representativo de peixes-zebra transplantados com células de tumor cerebral marcadas com mCherry é mostrado nesta figura. O enxerto de células tumorais é tipicamente obtido em 80 a 90% dos peixes-zebra, e os transplantes tumorais persistem até a fase adulta.Neste experimento, um CNS-PNET de peixe-zebra impulsionado por NRAS e marcado com mCherry, proveniente do tecto óptico, e um CNS-PNET marcado com GFP, proveniente do cerebelo, foram coletados por dissociação completa do tumor, processados em uma suspensão de células únicas e então misturados em uma proporção de um para um antes do transplante. Este embrião representativo, que foi submetido à imagem quatro dias após o transplante, demonstra que as células tumorais do tecto óptico, em vermelho, migram de forma mais extensa para o cérebro do hospedeiro do que o tumor cerebelar. Após dominar a técnica, aproximadamente 300 embriões podem ser injetados em três a quatro horas.Após este procedimento, métodos adicionais, como imagem de animais vivos e administração de fármacos, podem ser realizados para responder questões adicionais relacionadas à biologia de células tumorais, resposta a medicamentos e quimiorresistência. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de modelagem de câncer em peixe-zebra explorarem novos inibidores para o tratamento de cânceres cerebrais pediátricos.

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