Name: Dissecção e cultura do rim embrionário do rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Aprenda a dissecar e cultivar rudimentos metanéfricos de embriões de rato para estudar a morfologia de ramificação do broto ureteral. Este método simples e acessível permite investigar a organogênese renal e malformações congênitas.

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Os autores agradecem a Leif Oxburgh e Derek Adams por compartilhar generosamente seus conhecimentos, Leif Oxburgh pelos comentários úteis sobre o manuscrito, e Stefan Wölfl e Ulrike Müller pelo seu apoio técnico e Saskia Schmitteckert, Julia Gobbert, Sascha Weyer e Viola Mayer pela ajuda na Laboratório Este trabalho foi apoiado por Desenvolvimento, A Empresa de Biólogos (a CP).

Os ratinhos foram mantidos de acordo com a regulamentação sueca ea legislação da União Europeia (2010/63 / UE). Todos os procedimentos foram realizados seguindo as diretrizes do Comitê de Ética Sueco (autorizações C79 / 9, C248 / 11 e C135 / 14). Procedimentos na Universidade de Heidelberg envolvendo animais sujeitos foram aprovados pelo Regierungspräsidium Karlsruhe e os agentes de bem-estar animal na Universidade de Heidelberg. 1. Preparação de Reagentes e Materiais para a Cultura NOTA: Use uma capa de fluxo laminar para minimizar a contaminação. <ol><li> No dia da dissecção, Fc humano pré-agrupamento ou proteína de efrina quimérica recombinante fundida a Fc humano por mistura com anticorpos de cabra Fc anti-humanos numa razão molar de 1: 5 em solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS). Incubar durante 1 h a 37 ° C 5 . </li><li> Preparar o meio de cultura suplementando Dulbecco Modified Eagle Medium: NutrientMistura F-12 (DMEM / F12) com penicilina / estreptomicina a 1% (v / v), glutamina a 1% (v / v), insulina transferrina selénio (v / v) a 50 μg / Transferrina e 1,5 μg / mL de anfotericina. NOTA: 10 mL de meio é suficiente para 16 embriões. </li><li> Adicionar solução de efrínina recombinante agrupada a uma concentração final de 20 μg / mL ao meio de cultura. Use o Fc humano agrupado como controle. </li><li> Preparar placas de cultura por adição de 500 μL de meio de cultura a cada poço de uma placa de 4 poços de poliestireno estéril, não revestido, de fundo plano. </li><li> Usando pinças esterilizadas, coloque cuidadosamente um filtro de membrana de policarbonato com um tamanho de poro de 5 μm por poço em cima do meio. Transferir a placa preparada para a incubadora (37 ° C / 5% CO 2 ). Certifique-se de que o filtro permanece seco na superfície superior e flutua. NOTA: Um filtro é suficiente para dois anlagen de rim. </li><li> Usando uma lâmina de barbear, corte aproximadamente 30 pontas de pipeta (volume: 100 μL) approximatelY 1 mm da ponta para resultar numa abertura mais larga. Coloque as pontas de volta em um rack de ponta de pipeta. </li></ol> 2. Dissecção de Rudimentos Metanefricos em E11.5 <ol><li> Sacrifique um rato com gestação cronometrada em E11.5 por deslocamento cervical (ou usando um método aprovado pelo comitê de ética local). </li><li> Remova o útero e os embriões, como descrito por Brown et al 6 . Deste ponto em diante, trabalhar sob um microscópio de dissecção. </li><li> Usando pinças de relojoeiro No. 5, corte o embrião diretamente sob as patas dianteiras. Use um prato de Petri fresco para cada embrião. Remova as pernas ea cauda do embrião. Para fazer isso, pegue o tecido a ser removido com um par de fórceps de relojoeiro No. 5 e use as pontas de um segundo par para cortar. </li><li> Para remover a massa do órgão ventral, use as pontas de um par de fórceps para abrir lateralmente a parede do corpo do embrião em uma direção rostral para caudal. <ol><li> Corte superficialmente, paralelo a tAorta dorsal. Use a aorta dorsal cheia de sangue e portanto visível para orientação. Cuidadosamente separar a parte ventral da parede do corpo da parte dorsal usando as pontas da pinça fechada e virar o embrião sobre. Corte a parede do corpo lateralmente em uma direção rostral-para-caudal e usando a aorta dorsal para a orientação, como para o lado anterior. </li></ol></li><li> Uma vez que a parede do corpo ventral foi separada do corpo dorsal, agarrá-lo com um par de fórceps e puxe cuidadosamente para removê-lo, juntamente com a massa do órgão. NOTA: O anlagen metanefric permanece geralmente unido à parede do corpo dorsal. São estruturas ovais, ~ 200 μm de comprimento, localizadas ao nível dos membros posteriores. </li><li> Segure a parede do corpo dorsal com um par de fórceps, com o lado ventral voltado para cima. Usando o outro par de fórceps, pegue a aorta dorsal em sua extremidade rostral e cuidadosamente descascar a aorta dorsal da parede do corpo dorsal. NOTA: Ambos os rins metanefric geralmente permanecem anexarÀ aorta dorsal. </li><li> Usando um par de fórceps, corte rostralmente para o rim anlagen para remover a aorta. Em seguida, cuidadosamente separar o anlagen dois rins usando as pontas do fórceps. </li><li> Cuidadosamente descascar tecido não desejado do rim anlagen usando as pontas do fórceps. Tome cuidado para não danificar o mesênquima, uma vez que os danos podem resultar em crescimento fraco e exclusão do explante de uma análise posterior. </li><li> Transferir o anlagen renal separadamente usando uma pipeta de microlitro e uma ponta de pipeta aberta em 10 μL de PBS para o filtro de membrana de policarbonato em uma placa de 4 poços. NOTA: Devido à tensão superficial, o explante será coberto com uma fina camada de meio. Um filtro é suficiente para dois rim anlagen. <ol><li> Coloque cada um dos dois anlagen renal no centro de cada respectiva metade do filtro. Transferir a placa de volta para a incubadora a 37 ° C / 5% de CO2. Deixar a placa na incubadora até que o metanephric rudImensos do próximo embrião estão prontos para serem colocados no filtro. </li></ol></li><li> Repita os passos 2.3-2.9.1 para cada embrião. NOTA: Com alguma prática, o procedimento de dissecção levará cerca de 5 min por embrião. </li><li> Incubar o anlagenio renal durante 3 dias a 37 ° C / 5% CO 2 . </li></ol> 3. Preparação de Reagentes para Fixação e Coloração <ol><li> Para preparar paraformaldeído a 4% (PFA) em PBS sem cálcio e magnésio (p / v), dissolver a PFA a 60 ° C em PBS, agitando continuamente. Arrefecer até à temperatura ambiente e utilizar um filtro de papel para remover as restantes partículas. Alíquota e manter a 4 ° C para uso imediato ou congelar para armazenamento de longo prazo. CUIDADO: PFA é tóxico. Usar o equipamento de proteção individual especificado nas normas de segurança locais e trabalhar em um exaustor. Descarte resíduos de acordo com as diretrizes institucionais e usando recipientes de resíduos designados. </li><li> Para preparar a solução de permeabilização, diluir Triton X-100Em PBS sem cálcio e magnésio até 0,3% (v / v). </li><li> Para preparar a solução de bloqueio, adicionar 5% (v / v) de soro de cabra e 0,1% de Triton X-100 a PBS sem cálcio e magnésio. Adicionar azida de sódio a uma concentração final de 0,02% (p / v). Armazenar a 4 ° C. CUIDADO: A azida sódica é tóxica. Manipular azida de sódio de acordo com os regulamentos locais de segurança e protecção ambiental. NOTA: Quando se utilizam anticorpos para coloração, utilizar soro a 5% da espécie a partir da qual se derivou o anticorpo secundário para se obter uma solução de bloqueio. </li><li> Diluir a aglutinina de Dolichorus biflorus biotinilada 1: 200 em solução de bloqueio. Diluir estreptavidina conjugada com Alexa488 1: 200 em solução de bloqueio. </li><li> Para fazer um meio de incorporação pronto a usar (ver a tabela de materiais), adicione 0,1 g de mucoadesivo / ml a base de álcool polivinílico solúvel em água a 25% (p / v) de glicerol em Tris-HCl 0,1 M (pH 8,5) . Aquecer a 50 ° C sob agitação contínua durante 1 h, arrefecer e ajustar o pH para 8,0-8,5 usando 1M NaOH. Evitar concentrações mais elevadas de NaOH. Adicionar 100 μg / mL de N-propilgalato e timerosal até uma concentração final de 0,02% (p / v). Agitar durante 30 min à temperatura ambiente. CUIDADO: O timerosal é tóxico. Manuseie-o de acordo com os regulamentos locais de segurança e protecção ambiental. <ol><li> Encher o meio de incorporação em tubos de 50 mL, equilibrar o rotor e centrifugar a 3.200 xg e à temperatura ambiente durante 10 min. Decantar a solução límpida em tubos de 15 mL e descartar a pastilha. Alicuotar e armazenar a -20 ° C durante várias semanas. Uma vez descongelado, mantenha a solução a 4 ° C. Aquecer a ~ 30 ° C imediatamente antes da utilização. </li></ol></li><li> Preparar como muitos slides de vidro como filtros com explantes devem ser montados. Para isso, cola dois pequenos lamínulas, 18 x 18 mm, em ambos os lados da lâmina de vidro usando adesivo instantâneo, deixe um espaço de ~ 15 mm para o filtro entre. </li></ol> 4. Fixação e coloração <ol><li> Após um período de cultura de 3Dias in vitro (div), remover as placas da incubadora e aspirar cuidadosamente o meio de cultura de cada poço utilizando uma micropipeta. Certifique-se de não tocar no filtro e manter a abertura da ponta para a parede do poço. </li><li> Adicionar 500 μL de PFA a 4% / PBS a cada poço. Os filtros flutuam no fixador. Usando uma micropipeta, adicione cuidadosamente o fixador PFA gota a gota para submergir os filtros. Incubar à temperatura ambiente durante 30 min. NOTA: Para todas as etapas seguintes, deve-se ter cuidado para não lavar os explantes do filtro. Mantenha a abertura da ponta da pipeta em direção à parede do poço. </li><li> Remover o PFA e enxaguar duas vezes com 500 μL de PBS, submergindo o filtro. Adicionar 500 μL de solução de permeabilização a cada poço e incubar à temperatura ambiente durante 1 h. </li><li> Enxaguar duas vezes com 500 μL de PBS e adicionar 500 μL de solução de bloqueio a cada poço. Incubar à temperatura ambiente durante 1 h. </li><li> Substitua a solução de bloqueio por250 μL de aglutinina biotinilada de Dolichorus biflorus diluída a 1: 200 em solução de bloqueio e incubar a 4 ° C durante 24 h. </li><li> Remover a solução de aglutinina de Dolichorus biflorus e enxaguar duas vezes com 500 μL de PBS por poço. </li><li> Adicionar 250 μL de estreptavidina conjugada com Alexa488 diluída a 1: 200 em solução de bloqueio e incubar a 4 ° C durante 24 h. Alternativamente, incubar à temperatura ambiente durante 2 h. NOTA: Uma melhor relação sinal-ruído é alcançada quando incubada a 4 ° C. </li><li> Enxágüe duas vezes com 500 μL de PBS por poço. Usando pinças, transfira os filtros para as lâminas de vidro preparadas, com os explantes voltados para cima. Monte com ~ 50-100 μL de meio de incorporação. Cubra com os lamínulas No. 1.5 de 60 mm de comprimento. Permitir que a solução de meio de incorporação solidifique durante 2 h à temperatura ambiente no escuro. Proceda à imagem ou guarde os slides, envoltos em papel alumínio, a 4 ° C até à imagem. </li><li> Imagem com um microscópio de epifluorescência de campo largo 7 &lt;/ Sup&gt; acoplado a uma lâmpada de Hg e utilizar uma unidade de espelho para excitação azul (onda de excitação, 460-495 nm, espelho dicromático, 505 nm, e passagem de emissão, 510-550 nm) e lentes 20X Plan-Apochromat, 0,75 numérico abertura. </li></ol>

<ol><li>Saxén, L. <a target="_blank" href="http://admin.cambridge.org/fk/academic/subjects/life-sciences/cell-biology-and-developmental-biology/organogenesis-kidney">Organogenesis of the kidney. Developmental and Cell Biology Series</a>. 19, Cambridge University Press. (1987).</li>
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<li>Ekblom, P., Miettinen, A., Virtanen, I., Wahlström, T., Dawnay, A., Saxén, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+segregation+of+the+metanephric+nephron%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro segregation of the metanephric nephron.</a> Dev Biol. 84 (1), 88-95 (1981).</li>
<li>Davies, J. A., Unbekandt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((siRNA-mediated+RNA+interference+in+embryonic+kidney+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">siRNA-mediated RNA interference in embryonic kidney organ culture.</a> Methods Mol Biol. 886, 295-303 (2012).</li>
<li>Saxén, L., Lehtonen, E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3328727">Embryonic kidney in organ culture.</a> Differentiation. 36 (1), 2-11 (1987).</li>
<li>Bard, J. B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+the+mouse+kidney+embryogenesis+writ+small%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">The development of the mouse kidney embryogenesis writ small.</a> Curr Opin Genet Dev. 2, 589-595 (1992).</li>
<li>Davies, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+cold+storage+and+transport+of+viable+embryonic+kidney+rudiments%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">A method for cold storage and transport of viable embryonic kidney rudiments.</a> Kidney Int. 70 (11), 2031-2034 (2006).</li>
<li>Batourina, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distal+ureter+morphogenesis+depends+on+epithelial+cell+remodeling+mediated+by+vitamin+A+and+Ret%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Distal ureter morphogenesis depends on epithelial cell remodeling mediated by vitamin A and Ret.</a> Nat Genet. 32 (1), 109-115 (2002).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este manuscrito descreve um método para isolar o desenvolvimento de metanéfric anlagen do embrião de rato e para cultivar os rudimentos de órgãos. Este método é uma técnica padrão, como desenvolvido por Grobstein 8 e Saxen 9 , 10 , e foi adaptado e modificado por muitos outros 11 , 12 . O sucesso do método depende principalmente da duração da dissecção, como sobrevivência do expla...

O rim de mamíferos é derivado de duas estruturas primordiais de origem mesodérmica: o broto ureteral epitelial tubular e o mesênquima metanéfrico. Durante a nefrogênese, o broto ureteral invade o mesênquima metanéfrico e se ramifica para formar o sistema coletor. O mesênquima metanéfrico dá origem aos elementos epiteliais dos néfrons. Esses processos ocorrem de maneira precisamente cronometrada e espacialmente coordenada e são iniciados por mecanismos indutivos recíprocos. Ambos os componentes do tecido se comunicam e afetam a morfogênese celular do outro. 
Na década de 1920, foi Boyden quem realizou a obstrução in vivo do ducto mesonéfrico em galinhas, fornecendo a primeira indicação de interações indutivas, pois o blastema néfrico separado não consegue diferenciar1. Mais ou menos na mesma época, foram publicadas as primeiras tentativas bem-sucedidas de cultivar rudimentos neférricos de frango em uma gota pendurada. Posteriormente, a cultura de órgãos foi desenvolvida para estudar as interações teciduais na organogênese de mamíferos. Na década de 1950, Grobstein desenvolveu uma técnica na qual rudimentos metanéfricos podiam ser cultivados em um filtro. Essa técnica foi modificada por Saxén, que colocou o filtro em uma tela do tipo Trowell em uma cultura dish1. Ao longo dos anos, muitas modificações e aplicações para a cultura de órgãos surgiram. O método aqui descrito baseia-se na técnica de Saxén, mas é simplificado, uma vez que os filtros flutuam livremente no meio e o diâmetro do poço de cultura excede apenas ligeiramente o diâmetro do filtro, limitando o movimento indesejado do filtro.
A cultura de órgãos inteiros é uma ferramenta clássica, barata e simples, mas poderosa, para investigar processos celulares e comunicação intercelular durante a organogênese. A cultura de órgãos permite o tratamento com agentes biológicos, como fatores de crescimento, anticorpos, oligonucleotídeos antisense, vírus e peptídeos, bem como com compostos farmacêuticos e outros produtos químicos. Além disso, a função gênica pode ser estudada usando explantes derivados de camundongos geneticamente modificados ou usando tecnologia de inativação gênica induzível, como o sistema Cre-loxP. Isso permite o estudo de mutações genéticas que causam letalidade embrionária antes do desenvolvimento do rim. A cultura de órgãos também pode ser combinada com marcação fluorescente para função gênica ou rastreamento de linhagem e técnicas modernas de imagem, que permitem o monitoramento em tempo real do comportamento celular2.
No exemplo específico fornecido aqui, foi investigado o efeito da sinalização do receptor de Eph ativado por EphrinB2 na morfologia ramificada do broto ureteral. A morfologia dos camundongos duplos knockout EphA4/EphB2 sugeriu vários defeitos graves no desenvolvimento renal, que foram detectáveis já no dia embrionário 11 (E11) e envolveram o broto ureteral, o ureter e o ducto neférrico comum3. A sinalização via receptores Eph requer o agrupamento do dímero ligante-receptor < classe sup = 'xref'>4. Para ativar a sinalização de Eph, os rudimentos renais de embriões de camundongos E11.5 foram cultivados na presença de EphrinB2-Fc recombinante agrupado. EphrinB2 é um ligante conhecido para o receptor EphA4, que é expresso nas pontas dos brotos ureterais3.

<table><tbody><tr><td>DMEM / F-12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21331020</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (10.000 U / mL)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Suplemento</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, cálcio, magnésio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14040117</td><td>uso para dissecação</td></tr><tr><td>holo-Transferrina humana</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0665</td><td></td></tr><tr><td>Insulina-Transferrina-Selênio (ITS-G) (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41400045</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127 Solução de</td><td></td></tr><tr><td>Anfotericina B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Azida de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8032</td><td></td></tr><tr><td>Timerosal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5125</td><td></td></tr><tr><td>Galato de propila</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2370</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Biotinilated Dolichorus Biflorus Aglutinina</td><td>Vector Laboratories</td><td>B-1035</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 Estreptavidin Jackson Immuno</td><td>Research</td><td>016-540-084</td><td></td></tr><tr><td>Recombinante Camundongo Ephrin-B2 Fc Chimera Protein, CF</td><td>R & D Systems</td><td>496-EB</td><td></td></tr><tr><td>IgG1 Humano Recombinante Fc, CF</td><td>R& D Systems</td><td>110-HG-100</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Anti-IgG Fc Humano</td><td>de Cabra R& D Systems</td><td>G-102-C</td><td></td></tr><tr><td>Comprimidos salinos tamponados com fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>uso para fixação e imunocoloração</td></tr><tr><td>Dumont #5, pontas biologie , INOX, 11 cm</td><td>agnthos.se</td><td>0208-5-PS</td><td>São necessários 2 pares de pinças</td></tr><tr><td>Tesoura de íris, reta, 12 cm</td><td>agnthos.se</td><td>03-320-120</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de curativo, reta, delicada, 13 cm</td><td>agnthos.se</td><td>08-032-130</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri tratadas com Nunclo Delta</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150679</td><td></td></tr><tr><td>TMTP01300 Isopore Membrane Filter, policarbonato, Hidrofílico, 5.0 &micro; m, 13 mm, branco, liso</td><td>MerckMillipore</td><td>TMTP01300</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Multidishes 4 poços, fundo plano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6789-1CS</td><td></td></tr><tr><td>Vidro de cobertura do microscópio com 24 x 50 mm de espessura. No.1.5H 0,17+/-0,005 mm</td><td>nordicbiolabs</td><td>107222</td><td></td></tr><tr><td>Óculos de cobertura No.1.5, 18 mm x 18 mm</td><td>nordicbiolabs</td><td>102032</td><td></td></tr><tr><td>Slides ~76 x 26 x 1, 1/2-w. planície moída</td><td>nordicbiolabs</td><td>1030418</td><td></td></tr><tr><td>VWR Lâminas de barbear</td><td>VWR VWR</td><td>55411-055</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 50 mL Tubos de centrífuga</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430828</td><td></td></tr><tr><td>15 mL</td> Papel de filtro qualitativo preplissado <td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430055</td><td></td></tr><tr><td>Whatman, grau 113V, crepado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA1213125</td><td></td></tr><tr><td>Mircoscópio de pesquisa em estágio fixo</td><td>Olympus</td><td>BX61WI</td><td></td></tr><tr><td>Black 6 camundongos endogâmicos, machos, C57BL / 6NTac</td><td>Taconic</td><td>B6-M</td><td></td></tr><tr><td>Black 6 camundongos endogâmicos, fêmeas, C57BL / 6NTac</td><td>Taconic</td><td>B6-F</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio estéreo Greenough</td><td>Leica Leica</td><td>S6 E</td><td></td></tr></tbody></table>

dissecção e cultura do rim embrionário do rato

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

O objetivo deste protocolo é descrever um método para a dissecção, isolamento e cultura de rastreios metanefric do rato. Durante o desenvolvimento do rim mamífero, os dois tecidos progenitorais, o broto ureterico e o mesênquima metanéfrico, comunicam-se e induzem reciprocamente mecanismos celulares para formar eventualmente o sistema colector e os nefrões do rim. À medida que os embriões de mamíferos crescem intra-uterinos e, portanto, são inacessíveis ao observador, desenvolveu-se uma cultura de órgãos. Com este método, é possível estudar interações epitélio-mesenquimais e comportamento celular durante a organogênese do rim. Além disso, a origem das malformações congênitas do rim e do trato urogenital pode ser investigada. Após dissecção cuidadosa, os rudimentos metanéfricos são transferidos para um filtro que flutua no meio de cultura e podem ser mantidos numa incubadora de cultura de células durante vários dias. Contudo, deve ter-se em conta que as condiçõesArtificial e poderia influenciar o metabolismo no tecido. Além disso, a penetração das substâncias de teste poderia ser limitada devido à matriz extracelular e à membrana basal presentes no explante. Uma vantagem principal da cultura do órgão é que o experimentador pode ganhar o acesso direto ao órgão. Esta tecnologia é barata, simples e permite um grande número de modificações, como a adição de substâncias biologicamente ativas, o estudo de variantes genéticas e a aplicação de técnicas de imagem avançadas.

O anlagenio metanï¿½rico de rim foi derivado de murganhos consanguï¿½eos Black-6 grï¿½idos a E11,5 e foram cultivados. Após 3 dias, o botão ureteriano ramificou-se até 5 vezes, resultando em uma ramificação do botão ureter inicialmente em forma de T. Cada explante foi fotografado e os números de segmentos e pontos finais foram quantificados para determinar as gerações de ramificação e calcular o número de pontos finais por ramo ( Figura 1 ). ( Figura 1b ...

Este protocolo descreve um método para isolar e cultivar rudimentos metanefricos de embriões de ratinho.

Dissecção e cultura do rim embrionário do rato

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

Os objetivos gerais deste procedimento são isolar e cultivar rudimentos metanefrídicos de embriões de camundongo e observar os efeitos de tratamentos específicos na morfologia da ramificação do divertículo ureteral. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na organogênese renal sobre o controle da morfogênese tubular em ramificações, sobre as interações entre epitélio e mesênquima e sobre a origem de malformações congênitas. As principais vantagens desta técnica são o acesso direto ao órgão; além de ser simples, econômica e facilmente modificável.Antes de iniciar a dissecação, use pin&ccedil;as est&eacute;reis para colocar cuidadosamente um filtro de membrana de policarbonato com porosidade de cinco micr&ocirc;metros em cada po&ccedil;o de uma placa de quatro po&ccedil;os contendo 500 microlitros de meio de cultura fresco. Transfira a placa para uma estufa de cultura celular. Em seguida, use uma l&acirc;mina de barbear para cortar aproximadamente 30 ponteiras de micropipeta de 100 microlitros a cerca de um mil&iacute;metro da ponta, para alargar as aberturas, e devolva as ponteiras &agrave; grade de ponteiras.Quando as pontas estiverem prontas, coloque um embrião do dia 11½ de desenvolvimento em PBS sob um microscópi

dissection-and-culture-of-mouse-embryonic-kidney

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Neste relatório nós descrevemos um método para o isolamento e cultura do nicho de células progenitoras do rim do rato embrionárias que podem ser usadas para estudar vias de sinalização que regulam tronco / progenitoras células do rim em desenvolvimento. Estas células em cultura são altamente acessível a pequenas moléculas e tratamento de proteínas recombinantes, e importante também para a transdução viral, que permite a manipulação eficiente das vias candidato.

Isolamento e cultura de células da zona nefrogênica do rim do rato embrionárias

Um método que permite a manipulação farmacológica direta de embriões de camundongos durante a neurulação que ultrapassa o metabolismo materno é descrito. A técnica pode ser adaptada para estudar os diferentes aspectos da neurulação, variando o ponto de tempo e agente farmacológico.

Fechamento do tubo neural no embrião do rato Cultura Whole

Este vídeo descreve o método para isolar glomérulos intactos dos rins de camundongos. Os glomérulos encapsulados e descapsulados assim obtidos podem ser usados para a cultura de conseqüências de células epiteliais parietais do rim murino.

Isolamento de glomérulos: uma técnica para obter glomérulos intactos do rim murino

Soro utilizado em culturas de embriões contém componentes desconhecidos que podem afetar o resultado de experimentos especialmente em estudos que envolvem interações de sinalização. Aqui, utilizamos um sistema de cultura oxigenado sem soro e mostram que os embriões no meio da gestação rato cultivadas durante 16-40 horas apresentam desenvolvimento morfológico comparável aos embriões em desenvolvimento in utero.

Rato Desenvolvimento Embrionário em todo um sistema de cultura de embriões sem soro

Os neurônios dopaminérgicos desempenham um papel regulador vital no cérebro. Sua perda está associada à doença de Parkinson. Neste vídeo, mostramos como gerar culturas primárias de neurônios dopaminérgicos centrais a partir de mesencéfalo embrionário de camundongo. Tais culturas são úteis para estudar a extrema vulnerabilidade desses neurônios a vários estresses.

Cultura primária de neurônios dopaminérgicos mouse

Nós apresentamos um método para isolamento e cultura do duto de Wolff rato (WD). Também demonstramos um procedimento detalhado para toda a imunocoloração monte da cultura / WDs recentemente isolados com anticorpos marcados fluorescentes. Em conjunto, estas técnicas permitem o estudo do desenvolvimento WD, de enrolamento, e a diferenciação.

Órgão Cultura e Whole Mount Imunofluorescência Coloração de rato Wolff Dutos

Engenharia de tecido renais construções oferecem uma solução para a escassez de órgãos e os efeitos deletérios da diálise. Aqui, descrevemos um protocolo para micro dissecar murino rins para isolamento dos segmentos córtico-medular. Esses segmentos são implantados livre de andaime celular construções, formando organoids renal.

Microdissection de segmentos de tecido Renal primária e incorporação com tecnologia de construção romance livre de andaime

Aqui, apresentamos uma nova técnica microcirúrgica para o isolamento de células-tronco neurais da Eminência ganglionar embrião de rato E13 .

Isolamento e cultura de células-tronco neurais embrionárias de rato

Este artigo descreve um método para culminar e analisar os crescimentos de células epiteliais parieais glomerulares de glomeruli encapsulado isolados do rim do rato. Este método pode ser usado para estudar caminhos envolvidos na proliferação e migração de células epiteliais parietal.

Crescimento glomerular como um ensaio ex vivo para analisar caminhos envolvidos na ativação de células epiteliais parietal

Este trabalho descreve dois métodos para estudar o desenvolvimento de órgãos, uma melhor configuração de xenotransplante na membrana corioallantoica (CAM) a partir de embriões aviários que permite a vascularização de órgãos e organóides embrionários cultivados e uma nova direção fixa z método de cultura de órgãos com condições experimentais modificadas que permite imagens confocais de lapso de tempo de alta resolução.

Otimização da Cultura Organóide Renal e Organotípica para Vascularização, Desenvolvimento Estendido e Imagem Microscopia Aprimorada

Aprenda a dissecar e cultivar rudimentos metanéfricos de embriões de rato para estudar a morfologia de ramificação do broto ureteral. Este método simples e acessível permite investigar a organogênese renal e malformações congênitas.

Dissecção e cultura do rim embrionário do rato

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