Condrócitos diferenciadores de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos derivadas de sangue periférico

O objetivo geral deste procedimento é gerar células de linhagem condrogênica a partir de células-tronco pluripotentes induzidas derivadas do sangue periférico humano, ou células IPS. Este método pode ajudar a responder às principais questões no campo da regeneração da cartilagem sobre o uso de células sanguíneas periféricas derivadas do paciente como células C para a geração de células IPS para reparo da cartilagem. As principais vantagens desta técnica são que ela é facilmente reprodutível, e a diferenciação de condrócitos ocorre nas condições sérica e livre de xeno.

Comece colocando células IPS humanas em meio IPSC humano de quatro mililitros em uma placa de cultura de tecidos de 60 milímetros contendo uma monocamada de células alimentadoras de fibroblastos embrionários de camundongo irradiadas. Cultive as células a 37 graus Celsius em cinco por cento de dióxido de carbono. Quando as células-tronco forem 80 a 90 por cento confluentes, dissocie as células com solução dispace para subcultura.

Após duas a três passagens, use uma agulha de vidro trefilada a fogo para dissecar a colônia IPSC indiferenciada confluente de 80 a 90 por cento em fragmentos menores e transfira não mais do que 100 pedaços de cultura de células para uma nova placa de Petri não aderente de 100 milímetros contendo 10 mililitros de meio de formação de corpo embrióide. A dissociação mecânica é melhor do que a digestão automática porque reduz o dano celular a pequenos fragmentos de células a serem transferidos para o novo recipiente de cultura e anuncia o descarte manual das células alimentadoras, que reprimem a diferenciação celular IPS humana. Devolva as células IPS humanas à incubadora de cultura de células.

Após dois dias, incline o prato para deixar os corpos embrióides assentarem e substitua cuidadosamente três mililitros do meio de formação do corpo embrióide por quatro mililitros de meio de cultura basal fresco. Após 10 dias, os corpos embrióides terão se formado. Cubra um novo prato de 100 milímetros com quatro mililitros de gelatina a 0,1% por 30 minutos a 37 graus Celsius.

Transfira os corpos embrióides com o sobrenadante para um tubo cônico de 15 mililitros e deixe os corpos repousarem por quatro a cinco minutos. Aspire todos, exceto os últimos 0,5 mililitros de meio, e ressuspenda os corpos embrióides em 10 mililitros de meio de cultura basal fresco. Quando a gelatina solidificar, descarte a gelatina.

Em seguida, semeie as células no prato revestido de gelatina e coloque o prato na incubadora de cultura de células. Após 10 dias em cultura, os corpos embrióides terão se diferenciado em excrescências de células fibroblásticas. Para induzir a diferenciação de condrócitos, lave a cultura com DPBS e separe as células com três mililitros de EDTA de tripsina a 0,25% a 37 graus Celsius por cinco minutos.

Quando as células forem levantadas do fundo da placa, neutralize a reação com quatro mililitros de meio de cultura basal fresco e titule suavemente a cultura de cinco a 10 vezes. Filtre a suspensão celular através de um filtro de malha de nylon de 70 mícrons e colete as células por centrifugação. Em seguida, semeie as células em uma nova placa de 100 milímetros revestida de gelatina em 10 mililitros de meio de cultura basal fresco.

Quando a cultura atingir 90 a 100 por cento de confluência, colha as células com três mililitros de EDTA de tripsina a 0,25 por cento, conforme demonstrado para contagem. Transferir três vezes 10 para a quinta alíquota de células para um tubo de polipropileno de 15 mililitros para centrifugação. E ressuspenda o pellet em um mililitro de meio de diferenciação condrogênica.

Em seguida, centrifugue novamente as células e coloque o tubo na incubadora de cultura de células por 21 dias sem perturbar o pellet. As células condrogênicas podem se montar in vitro, produzindo métricas extracelulares características quando sob condições de cultura de alta densidade. Após 21 dias em cultura, um pellet condrogênico de células IPS humanas terá se formado.

Após 21 dias de cultivo, as células condrogênicas IPSC humanas são positivas para azul de alcian e toluidina na coloração azul, indicando uma diferenciação condrogênica bem-sucedida do pellet HIPSC. A análise imuno-histoquímica para colágeno dois e colágeno 10 confirma ainda mais seu fenótipo semelhante ao condrócito. A análise de glicosaminoglicanos sulfatados revela que o conteúdo de glicosaminoglicanos sulfatados das células é significativamente regulado positivamente em pellets condrogênicos de IPSC humanos, em comparação com células semelhantes a fibroblásticos de IPSC humanos, corpos embrióides e células IPS humanas indiferenciadas.

Além disso, as células condrogênicas IPSC humanas demonstram um alto nível de expressão gênica da linhagem condroprogenitora e marcadores de condrócitos totalmente diferenciados, sugerindo a obtenção de uma diferenciação condrogênica bem-sucedida. Um método de cultura de várias etapas usado para diferenciar IPSCs humanas em condrócitos, incluindo diferenciação espontânea via formação de EB, crescimento celular de EBs, cultura de células monocamada após cultura de células e cultura de pellets 3D. O fenótipo de condrócitos é avaliado por análise histológica, análise bioquímica e expressão gênica condrogênica.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar um método de cultura de várias etapas para induzir a diferenciação de células IPS humanas em condrócitos. Essa técnica pode ser mais específica para o paciente e econômica.