Entrega sistêmica de MicroRNA utilizando vírus Adeno-associado recombinante sorotipo 9 para tratar doenças neuromusculares em roedores

O objetivo geral deste método é selecionar e entregar um microRNA usando um vetor de vírus adeno-associado recombinante. Em seguida, entregue-o ao músculo esquelético e aos neurônios motores de camundongos e avalie sua eficácia na melhora dos fenótipos da doença. Este método pode ajudar a responder à importante questão de saber se uma estratégia de silenciamento baseada em microRNA pode ser empregada para tratar condições neuromusculares.

A principal vantagem desta técnica é o uso do vírus adeno-associado do sorotipo 9 para entregar um microRNA através da circulação sistêmica para a medula espinhal e o músculo esquelético de camundongos, para silenciar diretamente um gene alvo da doença. Divida o estoque de plasmídeo AAV-microRNA em alíquotas de 100 a 200 microlitros contendo uma carga viral de dez a cem trilhões de genomas por mililitro. Em seguida, coloque uma alíquota em uma seringa e conecte uma agulha de calibre 27 a 30.

Agora, usando um limitador de mouse padrão, prenda um mouse com a cauda exposta. Em seguida, limpe a cauda com álcool 70% e coloque uma almofada quente sob a cauda por cerca de 30 segundos para aumentar a vasodilatação. Agora, na porção distal da cauda, insira a agulha na veia da cauda com o chanfro para cima e em um ângulo raso, cerca de 15 graus.

Em seguida, injete o vírus e aguarde alguns segundos antes de remover a agulha. Depois de remover a agulha, aplique pressão moderada usando dois dedos para parar qualquer sangramento. Em seguida, devolva o animal à gaiola de origem.

Durante a injeção da veia da cauda, não é incomum ver um flash de sangue no centro da agulha. Durante a injeção, não deve haver resistência. Se a cauda começar a branquear e inchar, remova a agulha e tente novamente proximal ao local de entrada anterior.

Para esses testes, os camundongos devem ter mais de quatro semanas e certifique-se de coletar uma medida inicial antes do tratamento. A sala de testes deve ser silenciosa e escura, sem perturbações. Traga os ratos para a sala pelo menos 30 minutos antes de realizar qualquer teste.

Não perturbe os animais durante este período de aclimatação. Comece com o teste do fio pendurado. Pegue o mouse pela cauda e coloque-o no centro da grade de arame.

Em seguida, levante a grade de 15 a 20 polegadas e inverta lentamente a tela para dar tempo ao mouse para ajustar sua aderência. Quando a grade estiver completamente invertida, inicie o cronômetro e registre o tempo de queda. Deixe o mouse pendurar 60 segundos, se cair antes, retorne-o à grade e repita o procedimento.

Se o mouse travar por 60 segundos completos, registre 60 segundos para a pontuação e retorne o mouse para sua gaiola. Permita que cada mouse faça três tentativas de entrega de 60 segundos. Caso contrário, marque o maior tempo de suspensão.

Depois de sacrificar, o camundongo colha a medula espinhal e, em seguida, colha o músculo esquelético do quadríceps. Para congelar os tecidos colhidos, encha até a metade uma tigela de aço inoxidável com 2-metilbutano e mergulhe o quarto inferior da tigela em nitrogênio líquido. Aguarde dois minutos antes de prosseguir.

Após alguns minutos, transfira a amostra para o 2-metilbutano. Quando a amostra ficar branca, transfira-a imediatamente para um recipiente embebido em gelo seco. Mais tarde, armazene a amostra a 80 graus Celsius.

Para análise bioquímica e quantificação de microRNA, coloque o tecido colhido em um criovial e congele-o em nitrogênio líquido. Em seguida, armazene-o a 80 graus Celsius. Camundongos SBMA foram injetados com cem trilhões de genomas de AAV microR-298 às cinco semanas de idade.

Os camundongos SBMA carregam o transgene do receptor de andrógeno humano com um trato de poliglutamina anormalmente expandido. Com dez semanas, eles normalmente desenvolvem sinais de doença neuromuscular. A medula espinhal lombar e o músculo quadríceps foram colhidos em vários momentos após o tratamento para análise.

A RT-PCR quantitativa mostrou que a expressão de micro-R298 atingiu o pico no músculo esquelético após oito semanas e que a expressão atingiu o pico na medula espinhal em 12 semanas. Dez semanas após a injeção, a GFP foi detectada em ambos os tecidos. E expressão de GFP co-localizada com o marcador do neurônio motor colina acetiltransferase.

Em um experimento de acompanhamento, os camundongos foram injetados aleatoriamente com o vírus, ou veículo, às sete semanas de idade e foram pesados e testados semanalmente, até 40 semanas de idade. Dez semanas após a injeção, os camundongos tratados começaram a ganhar peso e começaram a apresentar melhora no desempenho motor. A PCR quantitativa em tempo real revelou que o tratamento reduziu os níveis de transcrição de AR nos tecidos afetados.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como entregar um microRNA usando um vetor de vírus adeno-associado recombinante por meio de injeção de cauda vã. E como realizar ensaios comportamentais que podem ajudar a avaliar a eficiência do microRNA entregue na melhora da atrofia e fraqueza dos membros inferiores em camundongos. A implicação dessa técnica se estende às abordagens de terapia gênica, porque uma terapia gênica segura e eficaz requer a transferência específica de tecidos direcionados do transgene terapêutico.

Tivemos a ideia para esse método pela primeira vez quando percebemos que a doença causada por mecanismos tóxicos de ganho de função, como o SBMA, se beneficiaria da superexpressão de microRNAs que ocorrem naturalmente, visando especificamente o reparo de três primos do transcrito da doença.