Minimamente invasivo músculo incorporação (MIME) - uma nova técnica Experimental para facilitar Myogenesis doador-mediada por células

O objetivo geral desta técnica é implantar um pequeno segmento de tecido muscular doador em um músculo hospedeiro, a fim de promover a miogênese mediada por células doadoras. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia muscular regenerativa, como, por exemplo, o tecido muscular colhido post-mortem pode promover a miogênese mediada por células doadoras em um músculo hospedeiro. A principal vantagem dessa técnica é que ela é minimamente invasiva.

As implicações dessa técnica se estendem à terapia para distrofias musculares não letais, porque uma combinação de incorporação muscular, exercício e imunoterapia pode ser capaz de rejuvenescer o potencial regenerativo de certos músculos afetados. Como fisioterapeuta e engenheiro biomédico, acredito que a natureza minimamente invasiva do procedimento MIME é fundamental porque fornece uma fonte de células miogênicas, juntamente com um andaime de tecido natural sem interromper excessivamente a estrutura e a função muscular do hospedeiro. Demonstrando o procedimento estará a Srta. Morium Begam, assistente de pesquisa em meu laboratório.

Para começar, eutanasiar camundongos doadores C57 pretos de 12 a 16 semanas de idade, conforme descrito no protocolo de texto. Use uma tesoura cirúrgica para abrir a pele sobre a superfície anterior da perna traseira. Depois de encontrar o músculo TA, remova-o para visualizar o músculo EDL localizado atrás do músculo TA.

Deslize a ponta de um par de pinças atrás do músculo e puxe suavemente para ver se os dedos dos pés se estendem, confirmando que o músculo é o EDL. Depois de identificar o músculo EDL, use segmentos de seda 4-0 de aproximadamente 10 centímetros de comprimento para amarrar suturas de guia nos tendões distal e proximal. Faça dois nós duplos nas suturas dos tendões proximal e distal do músculo.

Corte o tendão distal do EDL e reflita o músculo. Em seguida, corte o tendão proximal para liberar o músculo. Coloque os músculos EDL coletados em uma placa de Petri cheia de solução de toque de rato.

Anestesiar o camundongo hospedeiro NSG-GFP macho de oito a 10 semanas de idade, de acordo com o protocolo de texto. Aplique vaselina nos olhos para evitar o ressecamento. Para preparar a pele, aplique creme depilatório sobre a face anterior da perna traseira esquerda e deixe agir por dois minutos.

Usando lenços embebidos em PBS, remova o creme depilatório junto com o pelo. Para limpar a pele, alterne a esfrega com três toalhetes de solução de iodopovidona e etanol a 70%. Para criar um trato de agulha no músculo TA hospedeiro, passe uma agulha cirúrgica pelo centro do músculo, ao longo do eixo longo do músculo.

Certifique-se de passar a agulha na direção céfalo-caudal, ao longo do comprimento do músculo TA e através do centro da barriga muscular. Após a inserção da agulha, passar as suturas guia de uma extremidade do tecido doador, através do lúmen da agulha cirúrgica no sentido caudocefálico. Retraia a agulha do músculo hospedeiro na direção caudocefálica, para guiar o tecido doador através do trato da agulha.

Coloque adequadamente o tecido muscular EDL doador dentro do músculo TA hospedeiro, use as suturas guias nas extremidades caudal e cefálica do músculo doador. Após a inclusão do tecido doador, corte as suturas guia e faça os ajustes com pinças de ponta fina. Finalmente, sele as feridas da agulha no tecido muscular fechando o amassado da ferida com uma pinça e aplicando adesivo de tecido veterinário com a ponta de uma agulha cirúrgica de calibre 27.

Após o MIME, injete 50 a 60 microlitros de cloreto de bário a 1,2% no músculo TA hospedeiro em três locais ao longo do comprimento do músculo, proximal, médio e distal um terço do ventre muscular. Após a injeção, limpe a perna do camundongo hospedeiro com etanol e proteja a pele aplicando uma fina camada de vaselina. Coloque o mouse em uma gaiola de recuperação solitária sem cama.

Uma almofada de aquecimento de gel isotérmico deve ser colocada sob a metade da gaiola para fornecer suporte térmico ao mouse host enquanto ainda permite que o mouse se mova para a metade não aquecida. Após a recuperação concluída, retorne o mouse à sua gaiola original. Use uma tesoura cirúrgica para abrir a pele sobre a superfície anterior da perna.

Depois de localizar o músculo TA, corte seu tendão distal e reflita o músculo. Corte o tendão do músculo proximal para liberar o músculo TA. Colete os músculos TA esquerdo ou tratado e direito ou controle.

Pese os músculos colhidos colocando-os em papel de pesagem e uma balança. Para crioproteção, mergulhe os músculos brevemente em óleo mineral e, em seguida, limpe o excesso de óleo. Para congelar os músculos, coloque-os em papel alumínio e mergulhe-os rapidamente em um frasco duplo cheio de nitrogênio líquido.

Transfira as amostras congeladas para frascos criogênicos rotulados. A incorporação precisa do tecido doador no músculo hospedeiro é fundamental para o sucesso do MIME. Após três dias, o músculo EDL doador permanece implantado no músculo TA hospedeiro com marcas de agulha ainda visíveis no músculo hospedeiro.

Além disso, as seções transversais dos músculos doadores não apresentam fluorescência verde. Considerando que, a seção transversal dos músculos hospedeiros sim. Nas seções transversais dos músculos implantados, há uma fronteira clara entre as fibras musculares da casca GFP positivas e as fibras musculares doadoras GFP negativas.

14 dias após o tratamento, todas as fibras musculares e os músculos não tratados são positivos para GFP. Mas não nos músculos hospedeiros tratados. Muitas dessas fibras negativas GFP mostram-se viáveis com a marcação de desmina vermelha.

Isso demonstra que o MIME leva à miogênese derivada de células doadoras. Existem fibras musculares quiméricas presentes no músculo TA. Detectado por sua fluorescência baixa a moderada, provavelmente decorrente da fusão das células miogênicas do hospedeiro e do doador.

Sua presença em todo o diâmetro do músculo hospedeiro sugere que as células miogênicas do doador podem migrar várias centenas de mícrons dentro do músculo. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 15 a 20 minutos, se executada corretamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar a técnica MIME para incorporar um segmento de músculo doador em um músculo hospedeiro, a fim de facilitar a miogênese mediada por células doadoras.

A técnica MIME abre caminho para estudarmos se o músculo humano cadavérico pode ou não promover a miogênese mediada por células doadoras em um camundongo hospedeiro. Também ajuda a avaliar se a estimulação elétrica neuromuscular é capaz de aumentar a miogênese mediada por células doadoras. Este método também pode ser aplicado a outros sistemas, como a geração de modelos animais de doenças humanas, incorporando biópsia de músculo humano em animais hospedeiros e para testar se os miméticos do tecido muscular contendo células miogênicas podem promover a miogênese.