Transferência de capacidade de formação de glândulas mamárias entre células epiteliais basais mamárias e células luminal mamárias através de vesículas / exossos extracelulares

Os objetivos gerais deste procedimento são isolar a transferência de vesículas extracelulares e exossomos de células-tronco. E para avaliar a capacidade de transferência de tronco dessas nanopartículas. O meso pode responder a perguntas-chave no campo das células-tronco sobre o tempo que as células-tronco derivam em células trans ou vesículas.

Ou o exossomo pode transferir a propriedade das células-tronco para as células não estaminais. A principal vantagem desta técnica é que as células-tronco induzidas derivam na vesícula transcelular. E o exossomo pode ser usado para reprogramar diretamente células não estaminais em células-tronco.

Demonstrando o procedimento estará o pesquisador postal LeMonsier, com o assistente cirúrgico Pei-Ling, Wen-Tin e Shih-Yin, todos do meu laboratório. Comece semeando um ponto duas vezes dez elevado à sexta células epiteliais mamárias não aderentes / mesenquimais, ou NAMECs, em 12 mililitros de meio por prato de 15 centímetros para uma cultura de quatro dias em uma incubadora de cultura de células. No quarto dia, colha o meio de cultura para centrugificação do tampo da mesa.

Em seguida, transfira o sobrenadante para um tubo cônico para uma segunda centrifugação de mesa. Em seguida, transfira o sobrenadante para uma nova ultracentrífuga e execute a ultracentrifugação por 30 minutos. No final da centrifugação, transfira o sobrenadante para um novo tubo de ultracentrífuga e centrifugue novamente o sobrenadante.

Remover o sobrenadante e ressuspender o exossoma palato da vesícula extracelular em PBS para uma terceira ultracentrifugação. Em seguida, ressuspenda o palato em PBS fresco e centrifugue as partículas celulares uma última vez. Remova o sobrenadante e ressuspenda o palato do exossomo da vesícula extracelular em 100 microlitros de PBS.

Em seguida, medir a concentração proteica da suspensão da vesícula extracelular pelo ensaio do ácido bicinconínico. A concentração deve ser de aproximadamente 20 a 40 microgramas por 100 microlitros. Para medir a concentração e o tamanho das vesículas extracelulares e exossomos, dilua as partículas celulares em dois microgramas de proteína por 100 mililitros de PBS.

E analise as partículas por análise de rastreamento de nanopartículas. Para purificar os exossomos por gradiente de densidade, após a terceira ultracentrifugação, ressuspenda o palato em dois mililitros de 40% de iodixanol em PBS. E sobreponha a suspensão celular com volumes sequenciais de dois mililitros de 30 por cento, 20 por cento, 10 por cento e cinco por cento de iodixanol.

Separar a fracção celular por ultracentrifugação com gradiente de densidade, utilizando uma pipeta, colher cada uma das dez camadas de gradiente no final da centrifugação. Em seguida, analise a presença de marcadores de exossomos em cada fração por página SDS e western blot de acordo com protocolos padrão. Usar anticorpos contra os marcadores de exossomos apropriados de interesse.

Para tratar as células epiteliais mamárias com as vesículas extracelulares e exossomos primeiro, semeie duas vezes a tenda para o quinto fluxo de células epiteliais mamárias de baixa luminalidade epcam hi-CD 49F por placa em placas de seis poços revestidas com gelatina. Em seguida, trate cada cultura celular com dois microgramas por mililitro de vesículas e exsomos extracelulares derivados do NAMEC. Substituindo o meio cultivado por vesículas extracelulares frescas e exossomos a cada dois dias durante dez dias.

No final do período de tratamento, coloque uma fêmea de três semanas anestesiada com camundongo 57 BL6 na posição supina e remova o pelo no meio do abdômen. Desinfete o local da cirurgia com três ciclos alternados de álcool a 70% e iodo de povodona. E faça uma incisão vertical de um ponto e cinco centímetros através da pele, ao longo da região inguinal torássica ventral.

Exponha alternadamente as bolsas de gordura mamárias direita e esquerda. Localize o linfonodo em cada almofada de gordura e remova toda a perancama da glândula abaixo do linfonodo. Em seguida, use uma enzima natural com atividade pró-dialítica e cologenalítica para separar as células epiteliais mamárias luminais vesicais extracelulares e tratadas com exsome.

Neutralizando a atividade enzimática, com cinco por cento de FBS em PBS após dez minutos. Recolha as células por centrifugação e elimine o sobrenadante. Após a contagem, dilua as células para uma vezes dez elevado a um vezes dez elevado a quarta células por 15 microlitros de concentração de PBS.

E use uma seringa de vidro de microlitro de 100 litros equipada com uma agulha de calibre 27 para injetar 15 microlitros da suspensão de células epiteliais mamárias em cada almofada de gordura. Em seguida, feche a pele com clipes de ferida. Oito semanas após a injeção, faça uma incisão vertical através da pele da região torácica até a região ingrinal e exponha as bolsas de gordura mamária direita e esquerda.

Remova a quarta glande mamária e espalhe as almofadas de gordura em lâminas individuais de microscópio de vidro. Em seguida, transfira as lâminas para uma capa química e fixe as almofadas com fixadores collies durante a noite em temperatura ambiente. Na manhã seguinte, lave as amostras em 250 mililitros de etanol a 70% por 15 minutos.

Seguido por 250 mililitros de água destilada por cinco minutos. Após a lavagem com água destilada, manche as almofadas de gordura com alúmen carmim durante a noite em temperatura ambiente. Seguido de desidratação em incubações ascendentes de etanol de 15 minutos.

Após a última desidratação, transfira as amostras para o zileno em uma capa química até que as almofadas de gordura se tornem transparentes. Em seguida, monte as lâminas com meio de montagem e use um scanner de lâminas digital para obter imagens das almofadas de gordura a 2.400 pontos por polegada. O tamanho das vesículas isoladas e do palato da ultracentrífuga é tipicamente de aproximadamente 100 nanômetros, conforme medido pela análise de rastreamento de nanopartículas.

Além disso, a análise por microscopia eletrônica de transmissão de frações de ultracentrífuga do meio condicionado NAMEC revela a presença de vesículas de membrana abundantes. Após a separação do gradiente de densidade, como acabamos de demonstrar, os marcadores de exossomos podem ser detectados na fração iodixonal de 20%. A análise emétrica do lado do fluxo de células epiteliais mamárias luminais humanas negociadas com vesículas e exossomos extracelulares derivados do nâmico marcados com CFSE revela um sinal CFSE dez vezes maior nas culturas tratadas com exossomos.

Indicando a captação específica de vesículas e exossomos extracelulares marcados com CFSE, pelas células epiteliais mamárias. Além disso, enquanto o controle negativo, as células epiteliais mamárias tratadas com PBS não exibem um SFSE singnal, evidências de captação vesical extracelular derivada do nâmico e exossomo pelas células tratadas com exossomo também podem ser observadas por microscopia confocal. Notavelmente, as almofadas de gordura de camundongos injetados com células epiteliais mamárias luminais epCAMhi / CD49Flo classificadas por fluxo tratadas com vesículas extracelulares derivadas de NAMEC e exossomos por dez dias adquiriram a capacidade de formar glândulas mamárias.

Após seu desenvolvimento, essa tecnologia abriu caminho para nosso pesquisador no campo da biologia de células-tronco. Explorar o uso da célula trans derivada de células-tronco e vesículas e exossomos na medicina de regeneração e reprogramação celular direta.