Name: Transferência de capacidade de formação de glândulas mamárias entre células epiteliais basais mamárias e células luminal mamárias através de vesículas / exossos extracelulares (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Aprenda a isolar vesículas extracelulares e exossomas de células epiteliais mamárias mesenquimais para transferir propriedades de células-tronco para células luminais. Este método permite estudar a reprogramação celular direta.

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Este trabalho foi apoiado por bolsas dos Institutos Nacionais de Pesquisa em Saúde (05A1-CSPP16-014, HJL) e do Ministério da Ciência e Tecnologia (MOST 103-2320-B-400-015-MY3, HJL).

Todas as pesquisas envolvendo animais obedeceram aos protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados com Animais. 1. Isolação e Validação Extracelular da Vesícula / exossoma <ol><li> Células basais epiteliais mamárias culturais, NAMECs 4 , com meio fresco e sem soro feito de 500 mL de MCDB 170, pH 7,4 + 500 mL de DMEM / F12 com bicarbonato de sódio (0,2438%); EGF (5 ng / mL); Hidrocoríssona (0,5 μg / mL); Insulina (5 μg / mL); Extracto de pituitária bovina (BPE; 35 μg / mL); E GW627368X (1 μg / mL) em pratos de 15 cm. </li><li> Depois de contar as células com um hemocitómetro, semente 1,2 x 10 6 células em 12 mL de meio por prato de 15 cm no dia 0 por 4 dias 4 . </li><li> Após 4 dias em cultura, centrifugar o meio de cultura a 300 xg durante 5 min usando uma centrífuga de mesa. Transfira o sobrenadante para um tubo cônico ( Figura 1 ). </li><li> Centrifugar o sobrenadanteA 2.000 xg por 20 min em uma centrífuga de mesa. Transfira o sobrenadante para um tubo de ultracentrífuga e deixe as células mortas e os detritos celulares ( Figura 1 ). </li><li> Centrifugar o sobrenadante a 10 000 xg durante 30 min a 4 ° C. Transfira o sobrenadante para um novo tubo de ultracentrífuga ( Figura 1 ). </li><li> Centrifugar o sobrenadante a 110 000 xg durante 60 min a 4 ° C. Remova o sobrenadante e ressuspenda o sedimento EV / exossoma em PBS ( Figura 1 ). </li><li> Centrifugar o sobrenadante a 110 000 xg durante 60 min a 4 ° C. Remova o sobrenadante. Ressuspender o sedimento EV / exossomo em PBS ( Figura 1 ). Ressuspender o grânulo isolado de 240-480 mL de meio condicionado NAMEC em 100 μL. </li><li> Medir a concentração de proteína da suspensão EV com o teste de proteína BCA. Certifique-se de que a concentração seja de cerca de 20-40 μg / 100 μL. Armazenar a -20 ° C paraAnálise posterior. </li><li> Medir a concentração eo tamanho dos EVs / exosomas por análise de rastreamento de nanopartículas (NTA), conforme descrito anteriormente por Gardiner et al. 11 . Diluir os EVs / exossomos (20 μg / 100 μL) com PBS a 10.000 vezes para análise NTA. NOTA: O resultado da análise NTA reflete o número e o tamanho das vesículas analisadas. </li><li> Imagem dos VE / exossos com microscopia eletrônica de transmissão (TEM), como descrito anteriormente por Lin et al 4 . </li></ol> 2. Exosome Purification Using a Density Gradient <ol><li> Ressuspender o grânulo de 110 000 g do passo 1.7 em iodixanol a 40% (p / v) em PBS (2 mL). Superponha a mistura em sequência com alíquotas de iodixanol a 30%, 20%, 10% e 5% (p / v) em PBS (2 mL cada) para formar um gradiente de densidade em um tubo de ultracentrífuga. </li><li> Centrifugar a mistura a 200.000 xg por 8 h a 4 ° C. </li><li> Coletar cada fração de gradiente (10 fracçõesOns; 1 mL / fração) com uma pipeta do topo do tubo. </li><li> Analisar a presença de marcadores de exossomo ( por exemplo, CD81, CD9, CD63 e Tsg101) em cada fração por SDS-PAGE 12 e Western blot. Carregar 50 μL de suspensões de cada fração em um gel a 10% contendo 0,1% (p / v) de SDS e separar as proteínas em frações com eletroforese em gel. </li><li> Transferir as proteínas de um gel para uma membrana de PVDF e incubar a membrana com anticorpos contra os marcadores de exossomo ( por exemplo, CD81, CD9, CD63 e Tsg101) e proteína GAPDH durante a noite ( Tabela de Materiais ) a 4 ° C. NOTA: O resultado identifica a fração contendo exossomos. </li></ol> 3. Etiquetagem extracelular da vesícula / exosomo <ol><li> Suspender os EVs / exossomos, obtidos no passo 1.7, em 10 μM de éster de diacetato de succinimidilo de carboxifluoresceína (CFSE) a 20 μg de proteína exossomal / 100 μL. Prepare uma amostra paralela coMantendo apenas CFSE e PBS, processados ​​da mesma maneira, como um controle negativo para os ensaios de absorção EV / exossomo posteriores. Deixe as misturas a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Suspenda os VE / exossos em 50x volume de PBS e centrifugue a suspensão a 110 000 xg durante 60 min a 4 ° C. Remova o sobrenadante e ressuspenda o sedimento EV / exossoma em PBS. Repita o passo 3.2 uma vez. </li><li> Suspender os EVs / exossomos em PBS a uma concentração de 20 μg de proteína exossomal / 100 μL e depois filtrar o EVs / exossos através de membranas de 0,22 μm antes de adicionar o EVs / exossomos às células. </li></ol> 4. Ensaio de absorção de vesícula extracelular / exosoma <ol><li> Para fazer um meio de cultura, misture 500 mL de MCDB 170, pH 7,4 + 500 mL de DMEM / F12 com bicarbonato de sódio (0,2438%); EGF (5 ng / mL); Hidrocoríssona (0,5 μg / mL); Insulina (5 μg / mL); E BPE (35 μg / mL) 4 . Placa as células HMLE epiteliais mamárias humanas em pratos de 6 poços (1 x 10 6 &lt;/ Sup&gt; células / poço) um dia antes do tratamento EV / exossomo. Adicionar EVs / exosomo marcados com fluorescência CFSE de 2 μg / mL, obtidos no passo 3.3, ao meio de cultura das células HMLE por 2-6 h. Trate as células HMLE do grupo de controle negativo com a preparação paralela, descrita no passo 3.1. </li><li> Após a incubação de 2 a 6 horas, lave as células duas vezes com 4 mL de PBS à temperatura ambiente. </li><li> Descarte as células com 0,25% de tripsina durante 10 min e re-suspende as células em PBS contendo 0,2% de FBS. Medir a absorção EV / exosoma da intensidade de fluorescência nas células usando um analisador de células de fluorescência 4 . Imagem as células tratadas com EVs / exossomos ou o controle negativo usando microscopia confocal. NOTA: A fluorescência verde nas células é causada pela absorção EV / exossoma. Veja a legenda da Figura 6 para as configurações do microscópio. </li></ol> 5. Isolamento das células epiteliais mamárias do mouse primário <ol><lI&gt; Prepare pratos revestidos com gelatina adicionando 12 mL de solução de gelatina a 0,1% a pratos de 10 cm. Coloque as placas em uma incubadora a 37 ° C durante 30 min. Remova a solução de gelatina e deixe as tampas dos pratos em uma capa de fluxo laminar por 4 h até o revestimento de gelatina secar. </li><li> Disseca as glândulas mamárias dos números 2, 3, 4 e 5 ( Figura 2 ) de camundongos C57BL / 6 virgens fêmeas de 12 semanas que usam tesoura e corte as glândulas em pequenos pedaços (2 mm 2 ) usando uma navalha. </li><li> Dissocie ainda mais a suspensão de glândulas mamárias (de 10 ratinhos) durante 60 minutos a 37 ° C, agitação de 120 rpm com 50 mL de DMEM / F12 contendo 0,2% de colagenase tipo IV, 0,2% de tripsina, 5% de FBS, 5 μg / mL de gentamicina , E 1x pen-strep. </li><li> Granular os organoícidos epiteliais da mistura por centrifugação a 350 xg durante 10 min. </li><li> Suspender os organoides epiteliais em 4 mL de DMEM / F12 com DNase I de 0,1 mg / mL durante 5 min à temperatura ambiente. Adicione 6 mL de DMEM / F12 a uma finalVolume de 10 mL. </li><li> Centrifugue a suspensão a 400 xg durante 10 minutos à temperatura ambiente e descarte o sobrenadante. </li><li> Ressuspender o sedimento em 10 mL de DMEM / F12. Centrifugue a suspensão, mas aperte o freio quando a velocidade atinge 400 xg. Descarte o sobrenadante. NOTA: Ao bater o freio, os organoídios epiteliais são rapidamente sedimentados, enquanto os fibroblastos, como células únicas, ainda permanecem no sobrenadante. </li><li> Repita o passo 5.6 e 5.7 5-7 vezes. Adicione uma gota da suspensão a um hemocitómetro e verifique a depuração dos fibroblastos da mistura orgânica sob microscopia após cada rodada de centrifugação ( Figura 3 ). </li><li> Placa os organoides no prato revestido com gelatina, obtido no passo 5.1, durante 48 h com DMEM / F12 contendo 1x ITS, 5% de FBS, 50 μg / mL de gentamicina, 10 ng / mL de EGF e 1x pen-strep. </li><li> Após 48 h, remova as células flutuantes na cultura substituindo o meio com meio de cultura fresco sem FBS (DMEM / F12 contendo 1x ITS, 50 μg / mL de gentamicina, 10 ng / mL de EGF e 1x pen-strep). </li><li> Confirme que uma monocamada de células epiteliais mamárias migra e cresce a partir dos organoides epiteliais anexados em 3 dias. </li></ol> 6. Separação das células epiteliais mamárias basais / luminal primárias <ol><li> Após a cultura de 3 dias, separe as células mamárias primárias de murganho com uma mistura enzimática natural com atividade enzimática proteolítica e colagenolítica durante 20 min. Neutralize a atividade enzimática com 5% de FBS em PBS. </li><li> Centrifugue a suspensão a 450 xg durante 10 minutos à temperatura ambiente e descarte o sobrenadante. Ressuspender o sedimento celular em 5 mg / mL de dispase durante 20 min. Neutralize a atividade enzimática com 5% de FBS em PBS. </li><li> Centrifugue a suspensão a 450 xg durante 10 minutos à temperatura ambiente e descarte o sobrenadante. </li><li> Re-suspendeu as células em 100 μL de PBS com 0,2% de FBS a uma concentração de 10 7 células / mL com o diluídoAnticorpos anti-CD49f e anti-EpCAM no gelo durante 1 h no escuro. </li><li> Lavar as células com PBS e depois incubar as células com anticorpo secundário conjugado com fluoróforo em gelo durante 30 min no escuro. </li><li> Lavar e voltar a suspender as células em PBS com FBS a 0,2%. </li><li> Classifique as células epiteliais mamárias EpCAM hi / CD49f lo luminal em um classificador celular 4 . </li></ol> 7. Extracelular Vesícula / tratamento com exossomos <ol><li> Semente as células epiteliais mamárias classificadas EpCAM hi / CD49f lo luminal a partir do passo 6.7 em pratos de 6 poços revestidos com gelatina (2 x 10 5 células / poço) e depois tratá-las com PBS ou EVs / exosomas derivados de NAMEC de 2 μg / mL Obtido no passo 1.7. </li><li> Para garantir a eficácia biológica dos EVs / exossos no tratamento de cultura a longo prazo, substitua o meio de cultura de células com meio fresco contendo PBS ou 2 μg / mL de EVs / exosomas derivados de NAMEC a cada dois dias. Não divide o mouse primaCélulas luminal durante os 10 dias de tratamento. </li></ol> 8. Injeção de pilhas gordas de células epiteliais mamárias <ol><li> Anestesiar os camundongos C57BL / 6 fêmeas com 3 semanas de idade com isofluorano 2-3% inalante. </li><li> Coloque o mouse anestesiado nas costas. Remova a pele no meio do abdômen com uma barbear / creme de cabelo e limpe o local da cirurgia com três ciclos alternados de 70% de álcool e povidona-iodo. </li><li> Faça uma incisão vertical de 1,5 cm através da pele ao longo da região ventricular torácica-inguinal com tesoura e, em seguida, exponha alternadamente as 4ª almofadas de gordura mamária direita e esquerda. </li><li> Limpe cada almofada de gordura removendo o parênquima da glândula com tesoura. Localize o nódulo linfático na almofada de gordura e, em seguida, remova todo o parênquima da glândula abaixo do nódulo linfático. NOTA: Dois terços da almofada de gordura devem permanecer no lugar. </li><li> Descarte as células obtidas a partir do passo 7.2 com uma mistura enzimática natural (veja a Tabela de Materiais ) com proteolítico aE atividade enzimática colagenolítica durante 10 min. Neutralize a atividade enzimática com 5% de FBS em PBS. </li><li> Centrifugue a suspensão a 450 xg durante 10 minutos à temperatura ambiente e descarte o sobrenadante. Contar as células com um hemocitómetro e suspender as células em PBS a uma concentração tal que 15 μL contém a dose celular desejada (10 4 -10 2 células / almofada). </li><li> Injetar 15 μL de suspensão de células epiteliais mamárias em uma almofada de gordura usando uma seringa de vidro de 100 μL anexada a uma agulha 27G. </li><li> Repita as etapas 8.4-8.7 para a almofada de gordura do outro lado. </li><li> Feche a pele com clipes de ferida. </li></ol> 9. Mammary Gland Whole Mount <ol><li> Eutanizar o mouse com luxação cervical CO 2 mais às 8 semanas após a injeção celular (Passo 8.7). </li><li> Faça uma incisão vertical através da camada de pele da região torácica até a região inguinal usando uma tesoura e depois exponha o 4º m da direita e da esquerdaAlmofadas de gordura amaria. Remova as 4ª glândulas mamárias ( Figura 2 ). </li><li> Espalhe as pastilhas de gordura em lâminas de microscópio de vidro e fixe as almofadas de gordura com o fixador de Kahle (4% de formaldeído, 30% de EtOH e 2% de ácido acético glacial) à temperatura ambiente durante a noite. Atenção: o fixador de Kahle é irritante. Execute este passo em um capô químico. </li><li> Lavar as almofadas de gordura em 250 mL de EtOH a 70% durante 15 min e depois em 250 mL de dH2O durante 5 min. Manchar as almofadas de gordura com alumínio de carmim (1 g de carmin e 2,5 g de sulfato de alumínio e potássio em 500 mL de dH2O) à temperatura ambiente durante a noite. </li><li> Lavar as almofadas de gordura com 250 mL de EtOH a 70% durante 15 minutos, 250 mL de EtOH a 95% durante 15 minutos e 250 mL de EtOH a 100% durante 15 min. </li><li> Limpe as almofadas de gordura em xileno por dias e pare a incubação de xileno quando as pastilhas de gordura se tornam transparentes. Atenção: o xileno é irritante. Execute este passo em um capô químico. </li><li> Monte os slides wiMedidor de montagem e tirar imagens (2.400 dpi) das almofadas de gordura usando um scanner de slide digital. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Os exossomas geralmente carregam características das células que os liberaram e a quantidade de exosomas liberados pode ser induzida por estímulos 4 . O meio de cultura das células pode ser coletado e submetido a ultracentrifugação diferencial para a coleta de EV / exossomo ( Figura 1 ). Atualmente, não existe um acordo geral sobre um método ideal para isolar EVs / exossomos. O método ideal usado aqui foi determinado pelo aplicativo a jusante 14</su...

Os exossos podem mediar a comunicação celular através da transferência de proteínas de membrana e citossolo, lipídios e RNAs entre as células 1 . A comunicação mediada por exosomo demonstrou estar envolvida em muitos processos fisiológicos e patológicos ( ie, apresentação de antígenos, desenvolvimento de tolerância 2 e progressão tumoral 3 ). Os exossomos geralmente têm conteúdos semelhantes aos das células-fonte que as liberam. Assim, os exossos podem transportar propriedades celulares específicas das células originais e transferir essas propriedades para as células que as ingerem 4 . Os exossomos são vesículas de membrana de camada dupla de 50 a 150 nm e apresentam marcadores específicos ( por exemplo, CD9, CD81, CD63, HSP70, Alix e TSG101). Assim, os exossomos devem ser caracterizados por vários métodos para diferentes aspectos. A microscopia eletrônica de transmissão pode ser usada para visualizar vesículas da membranaTais como os exossomos 4 , 5 . A análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) e a análise dinâmica de dispersão de luz (DLS) são usadas para medir o tamanho eo número de exossomos purificados 4 . O conteúdo da membrana lipídica dos exossomos pode ser verificado por gradiente de densidade. Os marcadores exossais, como CD9, CD81, CD63, HSP70, Alix e TSG101 6 , 7 , podem ser medidos por Western Blot. As células basais mamárias têm a capacidade de gerar glândulas mamárias quando implantadas em almofadas de gordura, enquanto as células luminal não podem 8 , 9 , 10 . Assim, as células basais mamárias também são referidas como unidades de repovoamento mamário. Ao usar o modelo de células basais e luminales mamárias, a capacidade de EVs / exossomos para transferir características celulares entre diferentes populações celulares pode ser examinada. Este trabalhoDemonstra o método de transferir a capacidade de formação de glândulas de células epiteliais basais mamárias para células epiteliais luminales luminal utilizando EVs / exosomas derivados de células epiteliais basais mamárias. As células epiteliais mamárias luminal adquiriram propriedades das células basais após a ingestão de EVs / exossos secretados a partir de células basais e podem então formar glândulas mamárias 4 .

<table><tbody><tr><td>MCDB 170&nbsp;</td><td>USBiological</td><td>M2162</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo</td><td>1250062</td><td></td></tr><tr><td>Optima L-100K ultracentrifuge</td><td>Beckman</td><td>393253</td><td></td></tr><tr><td>SW28 Ti Rotor</td><td>Beckman</td><td>342204</td><td></td></tr><tr><td>SW41 Rotor</td><td>Beckman</td><td>331306</td><td></td></tr><tr><td>NANOSIGHT LM10</td><td>Malvern</td><td>NANOSIGHT LM10</td><td>para análise de rastreamento de nanopartículas (NTA)</td></tr><tr><td>Optiprep&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556</td><td>Solução de iodixanol a 60% (p/v) em água (estéril).</td></tr><tr><td>O anticorpo CD81</td><td>GeneTex</td><td>GTX101766</td><td>1:1.000 em leite em pó desnatado a 5% p/v, 1x TBS, 0,1% Tween 20 a 4 &deg; C, durante a noite&nbsp;</td></tr><tr><td>O anticorpo CD9</td><td>GeneTex</td><td>GTX100912</td><td>1:1.000 em 5% p/v de leite em pó desnatado, 1x TBS, 0,1% Tween 20 a 4 &deg; C, durante a noite&nbsp;</td></tr><tr><td>Anticorpo CD63</td><td>Abcam</td><td>Ab59479</td><td>1:1.000 em 5% p/v de leite em pó desnatado, 1x TBS, 0,1% Tween 20 a 4 &deg; C, durante a noite&nbsp;</td></tr><tr><td>O anticorpo TSG101</td><td>GeneTex</td><td>GTX118736</td><td>1:1.000 em 5% p/v de leite em pó desnatado, 1x TBS, 0,1% Tween 20 a 4 &deg; C, durante a noite&nbsp;</td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>GeneTex</td><td>GTX100118</td><td>1:6.000 em 5% p/v de leite em pó desnatado, 1x TBS, 0,1% Tween 20 a 4 &deg; C, durante a noite&nbsp;</td></tr><tr><td>CFSE (carboxifluoresceína succinimidil diacetato éster)</td><td>Thermo</td><td>V12883</td><td></td></tr><tr><td>FACSCalibur</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>analisador de células de fluorescência</td></tr><tr><td>colagenase Tipo IV&nbsp;</td><td>Thermo</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>tripsina</td><td>Thermo</td><td>27250018</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; ITS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3146</td><td>uma mistura de insulina humana recombinante, transferrina humana e selenito de sódio</td></tr><tr><td>accutase</td><td>ebioscience</td><td>00-4555-56</td><td>uma mistura enzimática natural com atividade enzimática proteolítica e colagenolítica</td></tr><tr><td>dispase&nbsp;</td><td>STEMCELL</td><td>7913</td><td>5 mg/mL = 5 U/mL</td></tr><tr><td>anticorpo anti-CD49f</td><td>Biolegend</td><td>313611</td><td>1:50</td></tr><tr><td>anticorpo anti-EpCAM</td><td>Biolegend</td><td>118213</td><td>1:200</td></tr><tr><td>FACSAria</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>classificador de</td></tr><tr><td>células carmim alúmen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1022</td><td></td></tr><tr><td>células epiteliais mamárias humanas (células HMLE, NAMECs)</td><td></td><td></td><td>presentes do Dr. Robert Weinberg</td></tr><tr><td>Thermo</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>bicarbonato de sódio</td><td>Zymeset&nbsp;</td><td>BSB101</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-015</td><td></td></tr><tr><td>Hidrocoritisona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SI-H0888</td><td></td></tr><tr><td>Insulina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SI-I9278</td><td></td></tr><tr><td>BPE (extrato de hipófise bovina)</td><td>Hammod Cell Tech&nbsp;</td><td>1078-NZ</td><td></td></tr><tr><td>GW627368X&nbsp;</td>Prato de cultura <td>Cayman</td><td>10009162</td><td></td></tr><tr><td>15 cm</td><td>Falcon&nbsp;</td><td></td><td></td>353025</tr><tr><td>centrífuga de mesa</td><td>Eppendrof&nbsp;</td><td>Tubo de ultracentrífuga Centrífuga 3415R</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Beckman</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>PBS (solução salina tamponada com fosfato)&nbsp;</td><td>Corning</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>BCA Protein Assay</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td>Microscopia Eletrônica de Transmissão <td>23228</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Hitachi</td><td>HT7700</td><td></td></tr><tr><td>gelatina&nbsp;</td><td>STEMCELL</td><td>7903</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de 10 cm</td><td>Falcon&nbsp;</td><td></td><td></td>353003</tr><tr><td>prato de cultura de 6 poços</td><td>Camundongos C57BL</td>/6 fêmeas Corning <td>3516</td><td></td></tr><tr><td></td><td>NLAC (National Laboratory Animal Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS (Soro Fetal Bovino)</td><td>BioWest&nbsp;</td><td>S01520</td><td></td></tr><tr><td>gentamicina</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>15710072</tr><tr><td>Caneta/Strep</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>5PRIMER</td><td>2500120</td><td></td></tr><tr><td>isofluorano&nbsp;</td><td>Halocarbono</td><td>NPC12164-002-25</td><td></td></tr><tr><td>formaldeído</td><td>MACRON</td><td>H121-08</td><td></td></tr><tr><td>EtOH (Etanol)</td><td>J.T. Baker</td><td>800605</td><td></td></tr><tr><td>ácido acético glacial</td><td>Panreac</td><td>131008.1611</td><td></td></tr><tr><td>sulfato de potássio de alumínio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12625</td><td></td></tr><tr><td>Xileno&nbsp;</td><td>Leica</td><td>3803665</td><td></td></tr><tr><td>0,22 &mu; m membranas</td><td>Merck Millipore</td><td>Millex-GP</td><td></td></tr><tr><td>AUTOCLIP Clips de Ferida, 9 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>427631</td><td></td></tr><tr><td>AUTOCLIP Aplicador de Clipe</td><td>de Ferida BD Biosciences</td><td>427630</td><td></td></tr><tr><td>CellMask&trade; Termo Vermelho Profundo</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>Coloração da membrana plasmática</td> <td>C10046</td></tr></tbody></table>

transferência de capacidade de formação de glândulas mamárias entre células epiteliais basais mamárias e células luminal mamárias através de vesículas / exossos extracelulares

Transfer of Mammary Gland-forming Ability Between Mammary Basal Epithelial Cells and Mammary Luminal Cells via Extracellular Vesicles/Exosomes

As células podem se comunicar através de exossos, vesículas extracelulares de 100 nm (VE) que contêm proteínas, lipídios e ácidos nucleicos. As vesículas extracelulares derivadas de células epiteliais mamárias não aderentes / mesenquimatosas (NAMEC) podem ser isoladas do meio NAMEC por ultracentrifugação diferencial. Com base na sua densidade, os VE podem ser purificados através de ultracentrifugação a 110 000 x g. A preparação EV a partir da ultracentrifugação pode ser mais separada usando um gradiente de densidade contínua para evitar a contaminação com proteínas solúveis. Os EVs purificados podem então ser mais avaliados usando a análise de rastreamento de nanopartículas, que mede o tamanho eo número de vesículas na preparação. As vesículas extracelulares com um tamanho variando de 50 a 150 nm são exossos. Os EVs / exosomas derivados de NAMEC podem ser ingeridos por células epiteliais mamárias, que podem ser medidas por citometria de fluxo e microscopia confocal. Algumas propriedades das células-tronco mamárias ( por exemplo, capacidade de formação de glândula mamária) podemSer transferido dos NAMECs de haste para células epiteliais mamárias através dos EVs / exossomos derivados de NAMEC. As células epiteliais primárias preliminares da EpCAM hi / CD49f lo luminal não podem formar glândulas mamárias após serem transplantadas para almofadas de gordura de ratos, enquanto as células epiteliais mamárias basais EpCAM lo / CD49f hi formam glândulas mamárias após o transplante. A absorção de EVs / exosomas derivados de NAMEC pelas células epiteliais mamárias EpCAM hi / CD49f lo luminal permite que elas gerem glândulas mamárias após serem transplantadas para almofadas de gordura. Os EVs / exossomos derivados de células epiteliais mamárias semelhantes a tronco transferem a capacidade formadora de glândula mamária para as células epiteliais mamárias EpCAM hi / CD49f lo luminal.

Uma vez que foi demonstrado que o bloqueio da sinalização de PGE 2 / EP 4 desencadeia a liberação de EV / exossomo a partir de células-tronco basais semelhantes a mamas 4 , este trabalho apresenta um método para isolar os EVs / exosomas induzidos pela cultura de células basais epiteliais mamárias (NAMEC). Uma vez que os NAMECs são cultivados em meio isento de soro, não existem EVs / exossomos pré-existentes derivados do soro <sup class="xref"...

Este protocolo descreve métodos para purificar, quantificar e caracterizar vesículas extracelulares (EVs) / exossomos de células epiteliais mamárias não aderentes / mesenquimatosas e para utilizá-las para transferir a capacidade de formação de glândula mamária para células epiteliais mamárias luminal. EVs / exosomas derivados de células epiteliais mamárias semelhantes a tronco podem transferir esta propriedade celular para células que ingerem EVs / exossos.

Transferência de capacidade de formação de glândulas mamárias entre células epiteliais basais mamárias e células luminal mamárias através de vesículas / exossos extracelulares

Cells can communicate via exosomes, ~100-nm extracellular vesicles (EVs) that contain proteins, lipids, and nucleic acids. Non-adherent/mesenchymal ...

Os objetivos gerais deste procedimento são isolar vesículas extracelulares e exossomos que transferem características de células-tronco a partir de células-tronco e avaliar a capacidade dessas nanopartículas de transferir características de células-tronco. O método pode responder perguntas fundamentais na área de células-tronco sobre se as células-tronco derivam ou transmitem sinais por meio de células ou vesículas.Ou o exossomo pode transferir propriedades de célula-tronco para uma célula não tronco. A principal vantagem dessa técnica é que a célula-tronco induzida se origina na vesícula celular trans. E o exossomo pode ser usado para reprogramar diretamente uma célula não tronco em célula-tronco.Demonstrará o procedimento a pesquisadora postal LeMonsier, com a assistente cirúrgica Pei-Ling, Wen-Tin e Shih-Yin, todas do meu laboratório. Comece semeando um vírgula dois vezes dez à sexta potência de células epiteliais mamárias não aderentes/mesenquimais, ou NAMECs, em 12 mililitros de meio por placa de 15 centímetros, para um cultivo de quatro dias em incubadora de cultura celular. No quarto dia, colete o meio de cultura para centrifugação em centrífuga de bancada.Em seguida, transfira o sobrenadante para um tubo cônico para uma segunda centrifugação em centrífuga de bancada. Em seguida, transfira o sobrenadante para um novo tubo de ultracentrífuga e realize a ultracentrifugação por 30 minutos. Ao final da centrifugação, transfira o sobrenadante para um novo tubo de ultracentrífuga e ultracentrifugue o sobrenadante novamente.Remova o sobrenadante e re-suspenda o pallet de exossomos de vesículas extracelulares em PBS para uma terceira ultracentrifugação. Em seguida, re-suspenda o pallet em PBS fresco e ultracentrifugue as partículas celulares uma última vez. Remova o sobrenadante e re-suspenda o pallet de exossomos de vesículas extracelulares em 100 microlitros de PBS.Em seguida, meça a concentração de proteína da suspensão de vesículas extracelulares por ensaio com ácido biccinconínico. A concentração deve ser aproximadamente de 20 a 40 microgramas por 100 microlitros. Para medir a concentração e o tamanho das vesículas extracelulares e exossomos, dilua as partículas celulares até dois microgramas de proteína por 100 mililitros de PBS.E analise as partículas por análise de rastreamento de nanopartículas. Para purificar os exossomos por gradiente de densidade, após a terceira ultracentrifugação, reconstitua o pellet em dois mililitros de iodixanol a 40% em PBS. E sobreponha a suspensão celular com volumes sequenciais de dois mililitros de iodixanol a 30%, 20%, 10% e 5%.Se pare a fração celular por ultracentrifugação em gradiente de densidade, utilizando uma pipeta para coletar cada uma das dez camadas do gradiente ao final da centrifugação. Em seguida, analise a presença de marcadores de exossomos em cada fração por eletroforese SDS-PAGE e western blot, conforme protocolos padrão, utilizando anticorpos contra os marcadores de exossomos de interesse apropriados.Para tratar células epiteliais mamárias com vesículas extracelulares e exossomos, primeiramente semeie dois vezes dez à quinta células epiteliais mamárias luminas Epcam hi-CD49f low classificadas por fluxo por placa em placas de seis poços revestidas com gelatina. Em seguida, trate cada cultura celular com dois microgramas por mililitro de vesículas extracelulares e exossomos derivados de NAMEC. Substitua o meio de cultura por vesículas extracelulares frescas e exossomos a cada dois dias durante dez dias.No final do período de tratamento, posicione um camundongo fêmea de três semanas de idade, anestesiado, da linhagem 57 BL6, em posição supina e remova os pelos da região mediana do abdômen. Desinfete o local cirúrgico com três ciclos alternados de álcool a 70 por cento e iodeto de povidona. Em seguida, faça uma incisão vertical de um ponto cinco centímetro através da pele, ao longo da região torácica ventral até a virilha.Exponha alternadamente os quartos bolsões de gordura mamária direito e esquerdo. Localize o linfonodo em cada bolsão de gordura e remova toda a glândula perancama abaixo do linfonodo. Em seguida, utilize uma enzima natural com atividade prodialítica e cologenolítica para destacar as células epiteliais mamárias luminais tratadas com vesículas extracelulares e exossomos.Neutralizar a atividade enzimática com cinco por cento de FBS em PBS após dez minutos. Coletar as células por centrifugação e descartar o sobrenadante. Após a contagem, diluir as células para uma concentração de um vezes dez à segunda até um vezes dez à quarta células por 15 microlitros de PBS.Utilize uma seringa de vidro de 100 microlitros equipada com agulha de 27 gauge para injetar 15 microlitros da suspensão de células epiteliais mamárias em cada coxim adiposo. Em seguida, feche a pele com clipes cirúrgicos. Oito semanas após a injeção, faça uma incisão vertical na pele, da região torácica até a região inguinal, e exponha os quartos coxins adiposos mamários direito e esquerdo.Remova a quarta glândula mamária e espalhe os coxins adiposos sobre lâminas de microscópio de vidro individuais. Em seguida, transfira as lâminas para uma cabine química e fixe os coxins com fixador collies durante a noite à temperatura ambiente. Na manhã seguinte, lave as amostras em 250 mililitros de etanol a 70 por cento por 15 minutos.Em seguida, adicione 250 mililitros de água destilada por cinco minutos. Após a lavagem com água destilada, corar os tecidos adiposos com carmim de alumínio durante a noite à temperatura ambiente. Em seguida, desidratar com incubações ascendentes de etanol de 15 minutos.Após a última desidratação, transfira as amostras para xilol em uma capela química até que os coxins de gordura fiquem transparentes. Em seguida, monte as lâminas com meio de montagem e utilize um escâner digital de lâminas para imagens dos coxins de gordura a 2.400 pontos por polegada. O tamanho das vesículas isoladas e da palheta do ultracentrífugo é tipicamente de aproximadamente 100 nanômetros, conforme medido por análise de rastreamento de nanopartículas.Além disso, a análise por microscopia eletrônica de transmissão de frações do meio condicionado de NAMEC após ultracentrifugação revela a presença de abundantes vesículas de membrana. Após a separação por gradiente de densidade conforme demonstrado anteriormente, marcadores de exossomos podem ser detectados na fração de iodixanol a 20 por cento. A análise citométrica de fluxo de células epiteliais mamárias humanas do tipo luminal tratadas com vesículas extracelulares e exossomos derivados de namic marcados com CFSE revela um sinal de CFSE dez vezes maior nas culturas tratadas com exossomos.Indicando a captação específica de vesículas extracelulares e exossomos marcados com CFSE pelas células epiteliais mamárias. Além disso, enquanto o controle negativo, células epiteliais mamárias tratadas com PBS, não exibem sinal de CFSE, evidências da captação de vesículas extracelulares e exossomos derivados de namic pelas células tratadas com exossomos também podem ser observadas por microscopia confocal. Notavelmente, os compartimentos adiposos de camundongos injetados com células epiteliais mamárias luminas epCAMhi/CD49Flo separadas por citometria de fluxo e tratadas com vesículas extracelulares e exossomos derivados de NAMEC por dez dias adquiriram a capacidade de formar glândulas mamárias.Após seu desenvolvimento, essa tecnologia abriu caminho para nossos pesquisadores na área da biologia de células-tronco. Para explorar o uso de células trans e vesículas e exossomos derivados de células-tronco na medicina regenerativa e no reprogramamento direto de células.

transfer-mammary-gland-forming-ability-between-mammary-basal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

HC11 lactogênica diferenciação pode ser caracterizada pela formação de estruturas de cúpula referido como mammospheres. As estruturas podem ser enumerados por microscopia de contraste de fase para ajudar a quantificar a diferenciação lactogênese.

Rato células epiteliais mamárias forma Mammospheres durante a diferenciação lactogênica

Este artigo demonstra o procedimento desenvolvido por DeOme...

Procedimento de transplante do epitélio mamário

Neste relatório, nós demonstramos um sistema para isolar e cultura de células de doadores da glândula mamária do mouse, e ortotopicamente transplante dessas células em ratos para analisar estroma destinatário: interações epiteliais durante o desenvolvimento do tumor mamário.

Transplante mamária de células estromais e células de carcinoma em camundongos C57BL/6J

Este método descreve como dissecar e avaliar o desenvolvimento da glândula mamária e na função de camundongos. Excisadas glândulas mamárias são avaliados quanto ao grau de desenvolvimento usando montar todo, enquanto a ejeção do leite é avaliada através de um ensaio de oxitocina baseado contração mioepiteliais celular.

Avaliação do desenvolvimento da glândula mamária e Função em modelos de ratos

O protocolo de imunofluorescência indirecta descrito neste artigo permite a detecção e a localização de proteínas na glândula mamaria do rato. Um método completo é dada para preparar amostras da glândula mamaria, a efectuar imuno-histoquímica, para as secções de tecido imagem por microscopia de fluorescência, e para reconstruir imagens.

Imunofluorescência Indireta em cortes congelados de Rato glândula mamária

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Uma nova técnica de transplante de almofada de gordura mamária para visualizar a geração de vasos de células vasculares endoteliais vasculares

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Aprenda a isolar vesículas extracelulares e exossomas de células epiteliais mamárias mesenquimais para transferir propriedades de células-tronco para células luminais. Este método permite estudar a reprogramação celular direta.

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Transferência de capacidade de formação de glândulas mamárias entre células epiteliais basais mamárias e células luminal mamárias através de vesículas / exossos extracelulares

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