Analisando supercomplexos da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial com eletroforese nativa, ensaios em gel e eletroeluição

O objetivo geral da eletroforese nativa em combinação com ensaios em gel, immunoblotting e eletroeluição nativa é preservar e analisar a montagem de supercomplexos mitocondriais. Este método pode ajudar a responder como os complexos proteicos da cadeia de transporte de elétrons mitocondriais se montam em supercomplexos, dependendo de muitos fatores, incluindo necessidades bioenergéticas e condições fisiológicas e patológicas. A principal vantagem desta técnica é que, se feita corretamente, a integridade fisiológica e a funcionalidade dos supercomplexos mitocondriais são preservadas durante todo o longo processo de isolamento.

Este método também pode ser aplicado para estudar a dinâmica da montagem de supercomplexos e para analisar complexos proteicos na membrana plasmática, bem como em outras membranas intracelulares. Ao se preparar para ensaios em gel, é absolutamente crítico que todas as partes usadas para eletroforese nativa não estejam contaminadas por detergentes, pois contribuirão para a desintegração dos supercomplexos mitocondriais. Corte uma ou mais faixas de um gel nativo transparente e transfira-as para um recipiente rotulado.

Para realizar o ensaio do complexo 1, combine 10 mililitros de tampão de ensaio com 25 miligramas de nitro azul de tetrazólio e 100 microlitros de 10 miligramas por mililitro de NADH. Adicione isso à pista de gel nativo transparente excisado ou área de interesse. Siga o desenvolvimento de faixas azuis após agitação suave em um balancim por pelo menos três minutos.

Em seguida, fixe o gel em 10 a 20 mililitros de solução de ácido acético ou lave em cinco milimolares Tris pH 7,4 para interromper a reação. Tire fotos para documentação. Para realizar o ensaio do complexo 5, obtenha um gel, uma pista ou uma área de interesse de um gel nativo azul ou nativo transparente.

Incubar a amostra por duas horas com agitação suave em 10 a 20 mililitros de tampão de ensaio, mais ou menos cinco microgramas por mililitro de oligomicina à temperatura ambiente. Após a incubação, substitua o tampão por 14 mililitros de tampão de ensaio fresco. Em seguida, adicione, em ordem, 190 microlitros de sulfato de magnésio molar, 27,28 miligramas de nitrato de chumbo, 60 miligramas de ATP e 75 microlitros de oligomicina.

Incube com agitação suave e observe se há um precipitado branco, pois as bandas nos géis tratados com oligomicina darão bandas dependentes do complexo 5. Fixe o gel no fixador à base de metanol porque as soluções ácidas dissolvem o precipitado de chumbo. Fotografe os resultados e siga com transferência de proteínas e immunoblotting, conforme descrito no protocolo de texto.

No dia da eletroeluição, coloque uma frita no fundo de cada tubo de vidro a ser usado. Se necessário, coloque o tubo de vidro no tampão de eluição e empurre a frita de dentro para o fundo do tubo. Empurre o tubo de vidro com a frita para dentro do módulo do Electro-Eluter.

Molhe o anel imortal com tampão de eluição e deslize o tubo de vidro no lugar. Certifique-se de que a parte superior dos tubos de vidro esteja nivelada com o ilhó. Feche os ilhós vazios com rolhas.

Em seguida, coloque uma tampa de membrana úmida na parte inferior do adaptador de silicone e encha o adaptador com tampão de eluição. Pipete lentamente o tampão e o adaptador para cima e para baixo para remover quaisquer bolhas de ar ao redor da membrana de diálise. Deslize o adaptador cheio de tampão para a parte inferior do tubo de vidro.

Em seguida, remova todas as bolhas que aparecem na frita dentro do tubo de vidro. Encha cada tubo de vidro com o tampão de eluição. Coloque as bandas excisadas do BN-PAGE nos tubos de vidro.

Corte pedaços grandes em pedaços menores. Certifique-se de que a altura de enchimento dentro do tubo de vidro seja de cerca de um centímetro. Em seguida, coloque todo o módulo no tanque.

Adicione cerca de 600 mililitros de tampão de eluição fria ao tanque. Certifique-se de que as tampas do adaptador de silicone estejam imersas no tampão. Coloque uma barra de agitação no fundo do tanque antes de eluir as proteínas por quatro horas a 350 volts em uma câmara fria.

Após a conclusão da eluição, remova o módulo Electro-Eluter do tanque tampão e coloque-o em uma pia ou tigela. Se uma rolha foi usada, remova-a para drenar a câmara tampão superior. Remova o tampão de cada tubo de vidro e descarte-o.

Certifique-se de que o adaptador de silicone permaneça no lugar e que o líquido abaixo da frita não seja perturbado ou agitado. Em seguida, remova cuidadosamente o adaptador de silicone, juntamente com a tampa da membrana do fundo do tubo de vidro. Pipete o conteúdo da tampa de silicone em um microtubo.

Com mais 200 microlitros de tampão de eluição, enxágue a tampa de silicone e adicione ao microtubo. Repita esse processo para todos os tubos de vidro. Preserve as tampas de membrana reutilizáveis colocando-as em tampão de eluição contendo 0,5 miligramas por mililitro de azida de sódio e leve à geladeira.

Supercomplexos de mitocôndrias cardíacas são visualizados aqui por ensaios em gel. Faixas do gel nativo transparente são usadas para ensaios em gel para o complexo-1 e complexo-5. A especificidade do sinal pode ser avaliada usando inibidores, como a oligomicina para a ATP-sintase.

Os ensaios em gel fornecem informações sobre o tamanho de um complexo proteico, com atividade do complexo 1 ou complexo 5, mas não sobre sua composição. O gel nativo azul mostra bandas de complexos proteicos que podem ser excisados para eletroeluição. Após a eletroeluição, o eluído é usado para análises posteriores, como ensaios em gel, coloração com prata das proteínas eluídas por eletroforese nativa ou desnaturante e Western blotting.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em três dias se executada corretamente. Esses três dias incluem o isolamento de mitocôndrias, a realização de uma maxi eletroforese nativa azul durante a noite e o immunoblotting. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar e identificar supercomplexos mitocondriais usando eletroforese nativa, ensaios em gel e eletroeluição.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que os supercomplexos mitocondriais são frágeis. O congelamento e o descongelamento das amostras devem ser reduzidos ao mínimo. A eletroforese nativa e a eletroeluição devem ser feitas no gelo ou na câmara fria.

As implicações dessas técnicas vão além da definição da composição física de cada supercomplexo. Como os supercomplexos são capturados em sua forma nativa, ensaios funcionais podem ser realizados. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área de biologia mitocondrial reavaliarem a compreensão da atividade de transporte de elétrons mitocondrial e suas consequências para pacientes com doenças mitocondriais.

Após este procedimento, outros métodos como HPLC, espectroscopia de massa, microscopia eletrônica ou patch clamping podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a composição molecular, estrutura ou propriedades eletrofisiológicas dos complexos proteicos isolados.