Analisando supercomplexos da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial com eletroforese nativa, ensaios em gel e eletroeluição

O objetivo geral da eletroforese nativa em combinação com ensaios em gel, imunoblotagem e eletroeluição nativa é preservar e analisar a montagem dos supercomplexos mitocondriais. Este método pode ajudar a responder como os complexos proteicos da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial se organizam em supercomplexos, dependendo de diversos fatores, incluindo necessidades bioenergéticas e condições fisiológicas e patológicas. A principal vantagem desta técnica é que, se realizada corretamente, a integridade fisiológica e a funcionalidade dos supercomplexos mitocondriais são preservadas ao longo de todo o processo extenso de isolamento.

Este método também pode ser aplicado para estudar a dinâmica da montagem de supercomplexos e para analisar complexos proteicos na membrana plasmática, bem como em outras membranas intracelulares. Ao se preparar para ensaios em gel, é absolutamente essencial que todas as partes utilizadas para eletroforese nativa não estejam contaminadas por detergentes, pois eles contribuirão para a desintegração dos supercomplexos mitocondriais. Corte uma ou mais faixas de um gel nativo transparente e transfira-as para um recipiente identificado.

Para realizar o ensaio da complexo-1, combine 10 mililitros de tampão de ensaio com 25 miligramas de tetrazólio azul nítrico e 100 microlitros de NADH a 10 miligramas por mililitro. Adicione isso à faixa do gel nativo transparente removida ou à área de interesse. Acompanhe o desenvolvimento das bandas azuis após agitação suave em um agitador durante pelo menos três minutos.

Em seguida, fixe o gel em 10 a 20 mililitros de solução de ácido acético ou lave com Tris 5 milimolar, pH 7,4, para interromper a reação. Tire fotografias para documentação. Para realizar o ensaio do complexo 5, obtenha um gel, uma fileira ou uma área de interesse de um gel azul nativo ou nativo claro.

Incube a amostra por duas horas com agitação suave em 10 a 20 mililitros de tampão do ensaio, com ou sem cinco microgramas por mililitro de oligomicina, à temperatura ambiente. Após a incubação, substitua o tampão por 14 mililitros de tampão de ensaio fresco. Em seguida, adicione, na ordem indicada, 190 microlitros de sulfato de magnésio um molar, 27,28 miligramas de nitrato de chumbo, 60 miligramas de ATP e 75 microlitros de oligomicina.

Incube com agitação suave e observe um precipitado branco em forma de bandas, pois os géis tratados com oligomicina apresentarão bandas independentes do complexo 5. Fixe o gel em fixador à base de metanol, pois soluções ácidas dissolverão o precipitado de chumbo. Fotografe os resultados e prossiga com a transferência proteica e imunoblotagem, conforme descrito no protocolo no texto.

No dia da eletroeluição, coloque um frit no fundo de cada tubo de vidro a ser utilizado. Se necessário, coloque o tubo de vidro no tampão de eluição e empurre o frit de dentro para o fundo do tubo. Insira o tubo de vidro com o frit no módulo do Eletro-Eluidor.

Umedeça o anel com o tampão de eluição e insira o tubo de vidro no lugar. Certifique-se de que as extremidades superiores dos tubos de vidro estejam alinhadas com o anel. Feche os anéis vazios com tampões.

Em seguida, coloque uma tampa úmida de membrana na base do adaptador de silicone e preencha o adaptador com tampão de eluição. Pipete lentamente o tampão e o adaptador para cima e para baixo para remover quaisquer bolhas de ar ao redor da membrana de diálise. Deslize o adaptador cheio de tampão até a base do tubo de vidro.

Em seguida, remova todas as bolhas que aparecem na frita dentro do tubo de vidro. Encha cada tubo de vidro com o tampão de eluição. Coloque as faixas recortadas da BN-PAGE nos tubos de vidro.

Corte os pedaços grandes em pedaços menores. Certifique-se de que a altura do preenchimento dentro do tubo de vidro seja de aproximadamente um centímetro. Em seguida, coloque todo o módulo dentro do tanque.

Adicione cerca de 600 mililitros de tampão de eluição frio ao tanque. Certifique-se de que as tampas adaptadoras de silicone estejam imersas no tampão. Coloque uma barra de agitação na parte inferior do tanque antes de eluir as proteínas por quatro horas a 350 volts em uma câmara fria.

Após a eluição ser concluída, remova o módulo de eletroeluição do tanque de tampão e coloque-o em uma pia ou recipiente. Se um tampão foi utilizado, remova-o para drenar a câmara superior de tampão. Remova o tampão de cada tubo de vidro e descarte-o.

Certifique-se de que o adaptador de silicone permaneça no lugar e de que o líquido abaixo do funil não seja perturbado ou agitado. Em seguida, remova cuidadosamente o adaptador de silicone, juntamente com a tampa da membrana, da base do tubo de vidro. Pipete o conteúdo da tampa de silicone para um microtubo.

Com outros 200 microlitros de tampão de eluição, enxágue a tampa de silicone e adicione ao microtubo. Repita este processo para todos os tubos de vidro. Preserve as tampas de membrana reutilizáveis colocando-as em tampão de eluição contendo 0,5 miligramas por mililitro de azida de sódio e refrigere-as.

Supercomplexos de mitocôndrias cardíacas são visualizados aqui por ensaios em gel. As faixas do gel nativo transparente são usadas para ensaios em gel das complexas I e V. A especificidade do sinal pode ser avaliada utilizando inibidores, como oligomicina para a ATP-sintase.

Ensaios em gel fornecem informações sobre o tamanho de um complexo proteico, com atividade do complexo-1 ou complexo-5, mas não sobre sua composição. O gel azul nativo mostra bandas de complexos proteicos que podem ser destacadas para eletroeluição. Após a eletroeluição, o eluato é utilizado para análises adicionais, como ensaios em gel, coloração com prata das proteínas eluídas por eletroforese nativa ou desnaturante e Western blotting.

Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em até três dias, se executada corretamente. Esses três dias incluem o isolamento de mitocôndrias, a realização de uma eletroforese nativa azul em gel grande durante a noite e o imunoblot. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar e identificar supercomplexos mitocondriais utilizando eletroforese nativa, ensaios em gel e eletroeluição.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que os supercomplexos mitocondriais são frágeis. O congelamento e descongelamento de amostras deve ser mantido ao mínimo. A eletroforese nativa e a eletroeluição devem ser realizadas no gelo ou em câmara fria.

As implicações dessas técnicas vão além da definição da composição física de cada supercomplexo. Como os supercomplexos são capturados em sua forma nativa, ensaios funcionais podem ser realizados. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para que pesquisadores na área da biologia mitocondrial reavaliassem a compreensão da atividade do transporte de elétrons mitocondrial e suas consequências para pacientes com doenças mitocondriais.

Após este procedimento, outros métodos como CLAE, espectroscopia de massa, microscopia eletrônica ou patch clamping podem ser realizados para responder perguntas adicionais sobre a composição molecular, estrutura ou propriedades eletrofisiológicas dos complexos proteicos isolados.