Name: Analisando supercomplexos da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial com eletroforese nativa, ensaios em gel e eletroeluição (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Aprenda a analisar supercomplexos da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial usando eletroforese nativa, ensaios em gel e eletroeluição. Este método preserva a integridade funcional das estruturas para estudos bioenergéticos.

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Este trabalho foi apoiado por bolsas do Afiliado do Fundador da American Heart Association [12GRNT12060233] e do Centro de Pesquisa de Crianças Fortes da Universidade de Rochester.

<ol><li>Lenaz, G., Genova, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramolecular+organisation+of+the+mitochondrial+respiratory+chain%3A+a+new+challenge+for+the+mechanism+and+control+of+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Supramolecular organisation of the mitochondrial respiratory chain: a new challenge for the mechanism and control of oxidative phosphorylation.</a> Adv Exp Med Biol. 748, 107-144 (2012).</li>
<li>Saks, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Energetic+Units+regulate+metabolism+in+cardiac+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular Energetic Units regulate metabolism in cardiac cells.</a> J Mol Cell Cardiol. 52 (2), 419-436 (2012).</li>
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<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+electrophoretic+techniques+to+identify+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions.</a> Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).</li>
<li>Genova, M. L., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+role+of+mitochondrial+respiratory+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Functional role of mitochondrial respiratory supercomplexes.</a> Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 427-443 (2014).</li>
<li>Hahn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+Complete+ATP+Synthase+Dimer+Reveals+the+Molecular+Basis+of+Inner+Mitochondrial+Membrane+Morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">Structure of a Complete ATP Synthase Dimer Reveals the Molecular Basis of Inner Mitochondrial Membrane Morphology.</a> Molecular cell. 63 (3), 445-456 (2016).</li>
<li>Strauss, M., Hofhaus, G., Schroder, R. R., Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimer+ribbons+of+ATP+synthase+shape+the+inner+mitochondrial+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Dimer ribbons of ATP synthase shape the inner mitochondrial membrane.</a> EMBO J. 27 (7), 1154-1160 (2008).</li>
<li>Beutner, G., Eliseev, R. A., Porter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+electron+transport+chain+activity+in+the+embryonic+heart+coincides+with+the+activation+of+mitochondrial+complex+1+and+the+formation+of+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Initiation of electron transport chain activity in the embryonic heart coincides with the activation of mitochondrial complex 1 and the formation of supercomplexes.</a> PloS one. 9 (11), e113330(2014).</li>
<li>Genova, M. L., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Interplay+Between+Respiratory+Supercomplexes+and+ROS+in+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">The Interplay Between Respiratory Supercomplexes and ROS in Aging.</a> Antioxid Redox Signal. 23 (3), 208-238 (2015).</li>
<li>Rosca, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+mitochondria+in+heart+failure%3A+decrease+in+respirasomes+and+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation.</a> Cardiovasc Res. 80 (1), 30-39 (2008).</li>
<li>Kuter, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+within+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+supercomplexes+and+membrane+viscosity+during+degeneration+of+dopaminergic+neurons+in+an+animal+model+of+early+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Adaptation within mitochondrial oxidative phosphorylation supercomplexes and membrane viscosity during degeneration of dopaminergic neurons in an animal model of early Parkinson's disease.</a> Biochim Biophys Acta. 1862 (4), 741-753 (2016).</li>
<li>Wittig, I., Karas, M., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+clear+native+electrophoresis+for+in-gel+functional+assays+and+fluorescence+studies+of+membrane+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">High resolution clear native electrophoresis for in-gel functional assays and fluorescence studies of membrane protein complexes.</a> Mol Cell Proteomics. 6 (7), 1215-1225 (2007).</li>
<li>Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+%28BN-PAGE%29+for+analysis+of+multiprotein+complexes+from+cellular+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates.</a> J Vis Exp. (48), (2011).</li>
<li>Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19026783">Respiratory active mitochondrial supercomplexes.</a> Molecular cell. 32 (4), 529-539 (2008).</li>
<li>Dudkina, N. V., Eubel, H., Keegstra, W., Boekema, E. J., Braun, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+mitochondrial+supercomplex+formed+by+respiratory-chain+complexes+I+and+III%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Structure of a mitochondrial supercomplex formed by respiratory-chain complexes I and III.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 102 (9), 3225-3229 (2005).</li>
<li>Giorgio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimers+of+mitochondrial+ATP+synthase+form+the+permeability+transition+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Dimers of mitochondrial ATP synthase form the permeability transition pore.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 110 (15), 5887-5892 (2013).</li>
<li>Beutner, G., Sharma, V. K., Giovannucci, D. R., Yule, D. I., Sheu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+ryanodine+receptor+in+rat+heart+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of a ryanodine receptor in rat heart mitochondria.</a> J Biol Chem. 276 (24), 21482-21488 (2001).</li>
<li>Rehncrona, S., Mela, L., Siesjo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+brain+mitochondrial+function+in+the+rat+after+complete+and+incomplete+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Recovery of brain mitochondrial function in the rat after complete and incomplete cerebral ischemia.</a> Stroke. 10 (4), 437-446 (1979).</li>
<li>Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue-native+gels+to+isolate+protein+complexes+from+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Blue-native gels to isolate protein complexes from mitochondria.</a> Methods Cell Biol. 65, 231-244 (2001).</li>
<li>Althoff, T., Mills, D. J., Popot, J. L., Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrangement+of+electron+transport+chain+components+in+bovine+mitochondrial+supercomplex+I1III2IV1%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I1III2IV1.</a> EMBO J. 30 (22), 4652-4664 (2011).</li>
<li>Schafer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+active+mammalian+respiratory+chain+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Architecture of active mammalian respiratory chain supercomplexes.</a> J Biol Chem. 281 (22), 15370-15375 (2006).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramolecular+organization+of+ATP+synthase+and+respiratory+chain+in+mitochondrial+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Supramolecular organization of ATP synthase and respiratory chain in mitochondrial membranes.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (6), 672-680 (2009).</li>
<li>Davies, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+organization+of+ATP+synthase+and+complex+I+in+whole+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Macromolecular organization of ATP synthase and complex I in whole mitochondria.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 108 (34), 14121-14126 (2011).</li>
<li>Lapuente-Brun, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercomplex+assembly+determines+electron+flux+in+the+mitochondrial+electron+transport+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain.</a> Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).</li>
<li>Antonioli, P., Bachi, A., Fasoli, E., Righetti, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+removal+of+DNA+from+proteomic+samples+prior+to+two-dimensional+map+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+A%22%5BJournal%5D)">Efficient removal of DNA from proteomic samples prior to two-dimensional map analysis.</a> J Chromatogr A. 1216 (17), 3606-3612 (2009).</li>
<li>Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+assays+in+high-resolution+clear+native+gels+to+quantify+mitochondrial+complexes+in+human+biopsies+and+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines.</a> Electrophoresis. 28 (21), 3811-3820 (2007).</li>
<li>Glancy, B., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+composition+and+function+of+red+and+white+skeletal+muscle+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Protein composition and function of red and white skeletal muscle mitochondria.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 300 (6), C1280-C1290 (2011).</li>
<li>Wittig, I., Beckhaus, T., Wumaier, Z., Karas, M., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+estimation+of+native+proteins+by+blue+native+electrophoresis%3A+principles+and+practical+hints%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Mass estimation of native proteins by blue native electrophoresis: principles and practical hints.</a> Mol Cell Proteomics. 9 (10), 2149-2161 (2010).</li>
<li>Alavian, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+uncoupling+channel+within+the+c-subunit+ring+of+the+F1FO+ATP+synthase+is+the+mitochondrial+permeability+transition+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">An uncoupling channel within the c-subunit ring of the F1FO ATP synthase is the mitochondrial permeability transition pore.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 111 (29), 10580-10585 (2014).</li>
<li>Chance, B., Williams, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+enzymes+in+oxidative+phosphorylation.+IV.+The+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. IV. The respiratory chain.</a> J Biol Chem. 217 (1), 429-438 (1955).</li>
<li>Zickermann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+biology.+Mechanistic+insight+from+the+crystal+structure+of+mitochondrial+complex+I%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural biology. Mechanistic insight from the crystal structure of mitochondrial complex I.</a> Science. 347 (6217), 44-49 (2015).</li>
<li>Zhu, J., Vinothkumar, K. R., Hirst, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+mammalian+respiratory+complex+I%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of mammalian respiratory complex I.</a> Nature. 536 (7616), 354-358 (2016).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Um ETC funcional é necessário para a geração de ATP mitocondrial. Os complexos do ETC são capazes de formar dois tipos de supercomplexos: os respirasomes (Cx-I, -III e -IV) 1 e os synthasomes (Cx-V) 2 . A montagem de cada complexo é necessária para um ETC intacto, enquanto a organização do ETC em supercomplexos é pensado para aumentar a eficiência geral ETC 5 , 22 . Como esses supercomplexos se mestam e desmontam n...

A energia mitocondrial na forma de ATP não é apenas essencial para a sobrevivência celular, mas também para a regulação da morte celular. A geração de ATP por fosforilação oxidativa requer uma cadeia funcional de transporte de elétrons (ETC, Cx-I a IV) e ATP sintetase mitocondrial (Cx-V). Estudos recentes mostraram que esses grandes complexos de proteínas são organizados em supercomplexos, chamados respirasomes e synthasomes 1 , 2 . É desafiador analisar a montagem, a dinâmica e a regulação da atividade desses complexos maciços e supercomplexos. Enquanto as medições de consumo de oxigênio tomadas com um eletrodo de oxigênio e ensaios enzimáticos realizados usando um espectrofotômetro podem fornecer informações valiosas sobre a atividade do complexo ETC, esses ensaios não podem fornecer informações sobre a presença, tamanho e composição da subunidade do complexo de proteína ou supercomplexos envolvidos. No entanto, o desenvolvimento de nativos azuis e nítidos (BN e CN, respectivamente) A PAGE 3 criou uma ferramenta poderosa para revelar informações importantes sobre composição complexa e montagem / desmontagem e sobre a regulação dinâmica da organização supramolecular desses complexos respiratórios vitais em condições fisiológicas e patológicas 4 . A montagem desses complexos em supercomplexos de ordem superior parece regular a estrutura mitocondrial e a função 5 . Por exemplo, a montagem do respirasome aumenta a eficiência da transferência de elétrons e a geração da força motora do próton através da membrana interna mitocondrial 5 . Além disso, a montagem de synthasomes não só aumenta a eficiência da produção de ATP e a transferência de equivalentes de energia para o citoplasma 2 , mas também molda a membrana interna mitocondrial nas cristas tubulares 6 , &lt;/ Sup&gt; 7 . Estudos de montagem de supercomplexos durante o desenvolvimento cardíaco em embriões de ratos mostram que a geração de supercomplexos contendo Cx-I no coração começa no dia embrionário 13,5 8 . Outros mostraram que a quantidade de supercomplexos contendo Cx-I diminui no coração devido ao envelhecimento ou lesões de isquemia / reperfusão 9 , 10 ou pode desempenhar um papel na progressão de doenças neurodegenerativas 11 . Este protocolo descreve métodos para o PAGE gel nativo que podem ser usados ​​para investigar a montagem e a atividade dos complexos ETC e supercomplexos. O peso molecular aproximado dos supercomplexos mitocondriais pode ser avaliado separando os complexos de proteínas em géis de poliacrilamida CN ou BN. O CN PAGE também permite a visualização da atividade enzimática de todos os complexos mitocondriais diretamente no gel (ensaios em gel;IGA) 12 . Este trabalho demonstra a atividade dos respirasomes ao destacar a capacidade do Cx-I de oxidar o NADH através do IGA e a presença de sinteticos devido à atividade de hidrolização de ATP da Cx-V pela IGA. Os múltiplos complexos e supercomplexos contendo Cx-I e Cx-V também podem ser demonstrados pela transferência das proteínas para membranas de nitrocelulose e realização de imunotransferência. A vantagem desta abordagem é que BN ou CN PAGE geralmente separam complexos de proteínas com base em seu tamanho e composição fisiológica; A transferência para uma membrana preserva esse padrão de bandas. A análise de complexos de proteína em uma BN ou CN PAGE também pode ser feita usando 2D-PAGE (ver Fiala et al. 13 para uma demonstração) ou por centrifugação de densidade de sacarose 14 , 15 . Para analisar ainda mais uma banda específica, ela pode ser excluída da BN PAGE, e as proteínas deste complexo proteico podem ser purificadasD, electroelutando-os sob condições nativas. A eletroeluição nativa pode ser realizada dentro de poucas horas, o que poderia fazer uma diferença significativa na difusão passiva (como usada na Referência 16) de proteínas de um gel para o amortecedor circundante. Em resumo, esses métodos descrevem várias abordagens que permitem a caracterização adicional de supercomplexos de alto peso molecular de membranas mitocondriais.

<table><tbody><tr><td>Câmara de mini-gel Protean II</td><td>Biorad</td><td>1658004</td><td>Conjunto completo para verter e correr a eletroforese em mini-gel</td></tr><tr><td>Maxi-gel Protean XL</td><td>Biorad</td><td>1653189</td><td>Conjunto completo para verter e correr a eletroforese em maxi-gel</td></tr><tr><td>Criador de gradientes, Hoefer SG15</td><td>VWR</td><td>95044-704</td><td>Despejar mini-gel</td></tr><tr><td>gradientes Gradiente maker, maxi-gel</td><td>VWR</td><td>GM-100</td><td>Derramar maxi-gel gradientes</td></tr><tr><td>Kit de transferência</td><td>Biorad</td><td>1703930</td><td>Conjunto completo para transferência úmida de proteínas para membranas</td></tr><tr><td>Electroeluter modelo 422</td><td>Biorad</td><td>1652976</td><td>Electroeluição de proteínas de PÁGINAS nativas ou SDS Placas</td></tr> de <tr><td>vidro</td><td>Biorad</td><td>1653308</td><td>Placas curtas</td></tr><tr><td>Placas de vidro</td><td>Biorad</td><td>1653312</td><td>Placas espaçadoras</td></tr><tr><td>Placas</td> <td>de vidroBiorad</td><td>1651823</td><td>Placas internas</td></tr><tr><td>Placas de vidro</td><td>Biorad</td><td>1651824</td><td>Placas externas</td></tr><tr><td>Fonte de alimentação</td><td>Biorad</td><td>1645070</td><td>Fonte de alimentação adequada para eletroforese nativa</td></tr><tr><td>ECL-Western&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>32209</td><td>Substrato de quimiomolumniscense</td></tr><tr><td>SuperSignal-West Dura</td><td>Thermo Scientific</td><td>34075</td><td>Substrato de quimolumniscense aprimorado</td></tr><tr><td>Filme/filme de autorradiografia</td><td>GE Health care</td><td>28906845</td><td>Documentação de Western blots Processador de</td></tr><tr><td>filme CP1000</td><td>Agfa</td><td>NC0872640</td><td></td></tr><tr><td>Canon Power Shot 640&nbsp;</td><td>Canon</td><td>NA</td><td>Tirar fotos para documentar géis, membranas e borrões.</td></tr><tr><td>Capuz de câmera Canon Power Shot 640&nbsp;</td><td>Câmera de blindagem Canon para fotos tiradas em uma mesa de luz</td><td></td> Acrilamida/bisacrilamida Biorad 1610148 solução pré-misturada a 40% Glicina Sigma G7403 SDS (dodecil sulfato de sódio)Invitrogen 15525-017 Tris-base Sigma T1503 Buffer Tricine Sigma T0377 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Desoxiquelato de sódio</td><td>Sigma</td><td>D66750</td><td>Detergente</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma</td><td>M1254</td><td>Tampão</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma</td><td>I15513</td><td>Tampão</td></tr><tr><td>Lauril maltosídeo</td><td>Sigma</td><td>D4641</td><td>Detergente</td></tr><tr><td>Coomassie G250</td><td>Biorad</td><td>161-0406</td><td></td></tr><tr><td>Ácido aminohexanoico</td><td>Sigma</td><td>O7260</td><td></td></tr><tr><td>Kit de peso molecular nativo</td><td>GE Health care&nbsp;</td><td>17-0445-01</td><td>Kit de calibração de alto peso molecular para eletroforese nativa.</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>NADH</td><td>Sigma</td><td>N4505</td><td></td></tr><tr><td>Nitroblue tetrazólio</td><td>Sigma</td><td>N6639</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>ATP&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A2383</td><td></td></tr> <tr><td> Nome</td> <td> Empresa </td> <td> Número de catálogo</td> <td> Comentários</td></tr> <tr><td>Nitrato de chumbo (II) (Pb (NO 3) 2):</td> <td>Sigma</td><td>228621</td><td></td></tr><tr><td>Oligomicina</td><td>Sigma</td><td>O4876</td><td></td></tr> <tr><td> Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Sigma</td><td>P3504</td><td></td></tr><tr><td>anti-ATP5A</td><td>Abcam</td><td>ab14748</td><td>anticorpo para ATP sintase subunidade ATP5A</td></tr><tr><td>anti-NDUFB6</td><td>Abcam</td><td>ab110244</td><td>anticorpo para Cx-1 subunidade NDUFB6</td></tr><tr><td>anti-VDAC</td><td>Calbiochem</td><td></td><td>529534 anticorpo para anticorpo ligado a VDAC</td></tr><tr><td>ECL HRP GE</td><td>Health Care</td><td>NA931V</td><td>anticorpo secundário para ATP5A, NDUFB6 e VDAC</td></tr><tr><td>Reagente de bloqueio</td><td>Biorad</td><td>170-6404</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cloreto de sódio</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>cloreto de potássio</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de Catálogo<</td><td>strong>Comentários</td></tr><tr><td>Kit de coloração de prata</td><td>Invitrogen</td><td>LC6070</td><td></td></tr></tbody></table>

analisando supercomplexos da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial com eletroforese nativa, ensaios em gel e eletroeluição

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

A cadeia de transporte de elétrons mitocondrial (ETC) transduz a energia derivada da quebra de vários combustíveis na moeda bioenergética da célula, a ATP. O ETC é composto de 5 complexos de proteínas maciças, que também se reúnem em supercomplexos chamados respirasomes (CI, C-III e C-IV) e synthasomes (CV) que aumentam a eficiência do transporte de elétrons e produção de ATP. Vários métodos foram usados ​​por mais de 50 anos para medir a função ETC, mas esses protocolos não fornecem informações sobre a montagem de complexos e supercomplexos individuais. Este protocolo descreve a técnica de eletroforese de gel de poliacrilamida de gel nativo (PAGE), um método que foi modificado há mais de 20 anos para estudar a estrutura do complexo ETC. A eletroforese nativa permite a separação de complexos ETC em suas formas ativas, e esses complexos podem então ser estudados usando imunotransferência, ensaios em gel (IGA) e purificação por eletroeluição. Ao combinar o reResultados da PAGE PAGE nativa com os de outros ensaios mitocondriais, é possível obter uma imagem completa da atividade ETC, sua montagem dinâmica e desmontagem, e como isso rege a estrutura e função mitocondrial. Este trabalho também irá discutir limitações dessas técnicas. Em resumo, a técnica de PAGE nativa, seguida de imunotransferência, IGA e eletroeluição, apresentada abaixo, é uma maneira poderosa de investigar a funcionalidade e a composição dos supercomplexos ETC mitocondriais.

Para visualizar supercomplexos mitocondriais, foram usadas 17 , 18 mitocôndrias recentemente isoladas de camundongos. Os supercomplexos mitocondriais são sensíveis a ciclos repetidos de congelamento e descongelamento, levando à sua desintegração, embora isso possa ser tolerável para alguns pesquisadores. Se o congelamento for necessário para o armazenamento, para garantir melhores resultados, as amostras não devem sofrer mais de ...

Este protocolo descreve a separação de complexos funcionais de cadeia de transporte de elétrons mitocondriais (Cx) IV e supercomplexos usando eletroforese nativa para revelar informações sobre sua montagem e estrutura. O gel nativo pode ser submetido a imunotransferência, ensaios em gel e purificação por eletroeluição para caracterizar ainda mais complexos individuais.

Analisando supercomplexos da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial com eletroforese nativa, ensaios em gel e eletroeluição

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

O objetivo geral da eletroforese nativa em combinação com ensaios em gel, imunoblotagem e eletroeluição nativa é preservar e analisar a montagem dos supercomplexos mitocondriais. Este método pode ajudar a responder como os complexos proteicos da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial se organizam em supercomplexos, dependendo de diversos fatores, incluindo necessidades bioenergéticas e condições fisiológicas e patológicas. A principal vantagem desta técnica é que, se realizada corretamente, a integridade fisiológica e a funcionalidade dos supercomplexos mitocondriais são preservadas ao longo de todo o processo extenso de isolamento.Este método também pode ser aplicado para estudar a dinâmica da montagem de supercomplexos e para analisar complexos proteicos na membrana plasmática, bem como em outras membranas intracelulares. Ao se preparar para ensaios em gel, é absolutamente essencial que todas as partes utilizadas para eletroforese nativa não estejam contaminadas por detergentes, pois eles contribuirão para a desintegração dos supercomplexos mitocondriais. Corte uma ou mais faixas de um gel nativo transparente e transfira-as para um recipiente identificado.Para realizar o e

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Neste vídeo, vamos mostrar-lhe como os complexos da cadeia respiratória mitocondrial de células estaminais embrionárias humanas podem ser analisadas por ensaios de atividade em gel.

Sondagem para a Atividade Complexo mitocondrial em células estaminais embrionárias humanas

Neste vídeo, demonstramos uma técnica eletroforética, chamada PAGE nativa azul, para a análise de complexos de proteínas respiratórias mitocondriais em seu estado nativamente dobrado e funcionalmente ativo. O corante aniônico azul de Coomassie faz com que os complexos de proteínas fiquem carregados negativamente, permitindo a separação com base no tamanho e na estrutura.

Eletroforese em gel de poliacrilamida nativa azul: uma técnica de separação não desnaturante para análise de complexos de cadeias respiratórias mitocondriais intactas

Este protocolo demonstra a análise dos complexos da cadeia respiratória mitocondrial por eletroforese em gel de poliacrilamida nativo azul. Aqui, é descrito o método aplicado para culturas de células humanas.

Análise dos complexos de cadeia respiratória mitocondrial em células humanas cultivadas usando electroforese em Gel de poliacrilamida nativo azul e Immunoblotting

Aqui apresentamos um protocolo para extrair, resolver e identificar supercomplexos mitocondrial que minimiza a exposição a detergentes e Coomassie Blue. Este protocolo oferece um equilíbrio ideal entre a resolução e a preservação das atividades enzimáticas, minimizando o risco de perda de interações proteína-proteína lábil.

Eletroforese nativa clara/azul híbrida para a separação e análise de supercomplexos de cadeia respiratória mitocondrial

O genoma mitocondrial da levedura de Baker codifica oito polipeptídeos. O objetivo do protocolo atual é rotular todos eles e, posteriormente, visualizá-los como bandas separadas.

Rotulagem e Visualização de Produtos de Expressão do Genoma Mitocondrial no Saccharomyces cerevisiae de Levedura de Baker

A preparação de amostras enriquecidas com mitocôndrias de tecidos sólidos arquivados previamente congelados permitiu que os pesquisadores realizassem avaliações funcionais e analíticas de mitocôndrias em várias modalidades experimentais. Este estudo demonstra como preparar preparações enriquecidas com mitocôndrias a partir de tecido cardíaco congelado e realizar avaliações analíticas de mitocôndrias.

Medindo complexos de transferência de elétrons mitocondrial em tecido cardíaco previamente congelado da prole da porca: um modelo para avaliar alterações bioenergetics mitocondrial induzidas pelo exercício

Este protocolo descreve uma técnica para a análise de supercomplexos respiratórios quando apenas pequenas quantidades de amostras estão disponíveis.

Isolamento de mitocôndrias para análise de supercomplexos mitocondriais a partir de pequenas amostras de cultura de tecidos e células 

Este artigo descreve um método para avaliar as interações e montagens de proteínas integrais de membrana in vitro com vários fatores parceiros em um ambiente lipídico-proximal.

Usando andaime lipossomas para reconstituir interações proteína-proteína Lipid-proximal In Vitro

Biopanning bacteriana exibir bibliotecas é uma técnica comprovada para a descoberta dos reagentes de afinidade do peptide, uma alternativa robusta para anticorpos. O método de classificação semi-automatizadas aqui simplificou biopanning para diminuir a ocorrência de falsos positivos. Aqui ilustramos o processo de pensamento e técnicas aplicadas na avaliação de candidatos e minimizando a análise a jusante.

Biopanning semi-automático de exibição bacteriana bibliotecas para peptídeo afinidade reagente descoberta e análise dos isolados resultantes

O objetivo do presente protocolo é espectrofotometricamente monitorar o transporte de elétrons da membrana trans-plasma utilizando aceitadores de electrões extracelular e analisar interações enzimáticas que podem ocorrer com estes aceitadores de electrões extracelular.

Trans-Plasma da membrana, transporte de elétrons por Myotubes de C2C12 de medição

Aprenda a analisar supercomplexos da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial usando eletroforese nativa, ensaios em gel e eletroeluição. Este método preserva a integridade funcional das estruturas para estudos bioenergéticos.

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Analisando supercomplexos da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial com eletroforese nativa, ensaios em gel e eletroeluição

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