A perfusão DiI como método de visualização vascular em Ambystoma mexicanum

O objetivo geral deste procedimento é visualizar a vasculatura do axolote. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da medicina regenerativa sobre os meandros da revascularização de tecidos regenerativos no axolote. A principal vantagem dessa técnica de visualização vascular é que todos os vasos sanguíneos do animal podem ser facilmente visualizados em um microscópio fluorescente padrão.

Embora esse método possa fornecer informações sobre a regeneração dos membros do axolote, ele também pode ser aplicado a outros tecidos, como cauda, coração, olhos, brânquias ou outros órgãos. Antes de abrir o baú do axolote, primeiro confirme o nível apropriado de sedação beliscando o dedo do pé. Em seguida, use uma pinça cirúrgica para beliscar a pele ao longo do eixo central do tórax, logo abaixo da linha dos ombros.

Usando um bisturi, faça uma incisão onde a pele é puxada para cima e remova uma mancha quadrada de pele sobre o peito para revelar duas placas de cartilagem. Em seguida, abra uma janela sobre a cavidade torácica e rasgue cuidadosamente o tecido conjuntivo sem cortar nenhum vaso sanguíneo importante. Use uma pinça para levantar cada placa de cartilagem individualmente, excisando cada placa com uma tesoura cirúrgica.

Aperte cuidadosamente o pericárdio exposto com a pinça. Puxando o tecido para cima e puncionando-o com a tesoura cirúrgica, apenas o suficiente para remover o pericárdio sem ferir o coração. Em seguida, remova suavemente o pericárdio para expor o coração e a aorta, para visualizar claramente o coração a aproximadamente cinco milímetros da aorta, ramificando-se do coração.

Para perfundir o axolote, coloque um suporte de grampo com uma agulha borboleta carregada ao lado de uma estrutura de espuma de poliestireno, de modo que o braço do grampo seja facilmente manipulado para a inserção da agulha. Ligue uma bomba peristáltica para lavar 0.7x PBS através da tubulação da bomba e aponte a ponta da agulha para o aspecto rostral. Deslize a pinça sob o arco aórtico e puxe ligeiramente para cima.

Em seguida, manobre a combinação de pinça de agulha, de modo que a agulha corra ao longo do comprimento da aorta em direção à cabeça do animal, e insira a agulha cerca de cinco milímetros na aorta, mantendo a pinça atrás da aorta para apoio. Uma inserção bem-sucedida pode ser confirmada por um aumento visível dos átrios cardíacos. Dilacere rapidamente um átrio e deixe o sangue escorrer.

Em seguida, perfunda o axolote com cerca de 20 a 30 mililitros de PBS. Após uma perfusão bem-sucedida, o animal deve mudar de rosa claro para branco. Quando todo o PBS tiver sido perfundido, pause a bomba peristáltica e mova a extremidade livre da tubulação para um tubo de 15 mililitros de solução de Dil.

Reinicie a bomba, tomando cuidado para evitar a criação de bolhas na tubulação e perfundir o animal com todo o estoque Dil em funcionamento. Em uma perfusão bem-sucedida, o axolote mudará para uma cor rosa brilhante que será mais perceptível nas brânquias. Quando todo o Dil tiver sido perfundido, pause a bomba e coloque a extremidade livre da tubulação em solução de paraformaldeído a 4%.

Em seguida, reinicie a bomba e perfunda pelo menos 10 mililitros do fixador. Quando todo o paraformaldeído tiver sido administrado, pare a bomba e remova a agulha. Transfira o axolote para um prato de plástico e coloque-o em um microscópio fluorescente.

Em seguida, com as luzes apagadas, selecione um filtro que permita a excitação de Dil, que emite uma luz vermelha laranja. Após uma perfusão bem-sucedida, a coloração de Dil é visível como um sinal vermelho de admissão em todos os tecidos do axolote, incluindo cauda, membros, brânquias e olhos. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em uma hora se for executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de tomar cuidado para não lacerar os principais vasos sanguíneos ou o coração ao abrir a cavidade torácica e inserir a agulha alinhada com a aorta para evitar perfurações. Após este procedimento, outros métodos, como preparações esqueléticas, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área biomédica explorarem a vasculatura de diferentes espécies.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar uma perfusão cardíaca do axolote com o corante carbocianina, Dil. Não se esqueça de que trabalhar com agulhas e paraformaldeído pode ser extremamente perigoso e que precauções, como usar o equipamento de proteção individual adequado, devem sempre ser tomadas durante a realização do procedimento.