Preparação de Vesículas de Membranas Plasmáticas de Células-Tronco Mesenquimais de Medula Óssea para Terapia Potencial de Substituição de Citoplasma

O objetivo geral deste procedimento é fornecer uma nova terapia de reposição de citoplasma ao músculo gastrocnêmio de camundongos usando vesículas de membrana plasmática, ou PMVs derivadas de células-tronco mesenquimais da medula óssea de camundongos ou BMSCs. Este método pode ajudar a responder a perguntas com a suplementação de células com citoplasma jovem de outro BMSC via fusão PMV pode melhorar ou mesmo reverter os fenótipos associados à idade. A principal vantagem desta técnica é que o encapsulamento de PMV do citosol BMSC pode ser instantaneamente induzido por extrusões mecânicas.

Quando você está demonstrando esse método, é fundamental, pois você está extrudando e construindo etapas difíceis de aprender testando para realmente possuir. Para gerar os PMVs, primeiro cultive BMSCs de camundongos em meio de cultura DMEM completo em um poço de uma placa de seis poços em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Quando as células atingirem 90% de confluência, enxágue o poço com 0,5 mililitros de PBS livre de cálcio e retire as células com 0,5 mililitros de 0,25% de tripsina-EDTA.

Após três minutos a 37 graus Celsius, bata na placa com a palma da mão algumas vezes para facilitar a dissociação celular e interromper a digestão com um mililitro de meio de cultura. Transfira as células para um tubo cônico de cinco mililitros para centrifugação e ressuspenda o pellet em quatro mililitros de meio de cultura fresco. Em seguida, divida as células entre dois poços de uma nova placa de seis poços e devolva a placa à incubadora de cultura de células por 24 horas.

No dia seguinte, colha as células de um poço por digestão de tripsina, como acabamos de demonstrar. Ressuspender o pellet em 0,5 mililitros de meio de cultura fresco após a coleta por centrifugação. Coloque as células em uma seringa de insulina de um mililitro e conecte a seringa a uma unidade de filtro.

Pressione rapidamente o êmbolo para espremer as células através do filtro e descarte o meio extrudado. Em seguida, carregue e dispense 0,5 mililitros de meio de cultura extra através do filtro, conforme demonstrado, coletando o meio da segunda extrusão. Semeie 150 microlitros do meio coletado em um prato com fundo de vidro de 35 mililitros e deixe as vesículas assentarem por cerca de 10 minutos.

Em seguida, confirme a presença de PMVs sob um microscópio de contraste de fase invertida equipado com uma câmera CCD usando uma lente objetiva 20 vezes. Para rastrear o invólucro mitocondrial e o potencial de membrana nos PMVs, corar uma cultura BMSC 90% confluente com um corante mitocondrial apropriado ou uma sonda de potencial de membrana mitocondrial, respectivamente, em meio de cultura fresco por 30 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, enxágue as células três vezes com 0,5 mililitros de PBS por lavagem e colha as células por digestão de tripsina para geração de PMV, conforme demonstrado para sua visualização por microscopia confocal.

Para rastrear a localização citoplasmática das proteínas PMV, primeiro dilua dois microgramas de DNA de plasmídeo superenrolado para um de expressão EGFP e seis microlitros de reagente de transfecção catiônica em tubos individuais de 0,5 mililitro contendo 50 microlitros de DMEM livre sérico. Vortex os tubos, seguido por uma breve centrifugação. Em seguida, adicione o reagente de transfecção gota a gota no tubo que contém a solução de DNA diluída.

Vortex a mistura de transfecção de DNA robustamente por um minuto, seguido por uma breve rotação em uma incubação de 10 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, alimente uma cultura de BMSC 30% confluente em uma placa de seis poços com dois mililitros de meio de cultura fresco e adicione a mistura de DNA gota a gota às células. 48 horas após a transfecção, colha o BMSC por digestão de tripsina e prepare PMVs como acabamos de demonstrar.

Os PMVs podem então ser analisados por microscopia confocal usando uma objetiva de óleo 100 vezes. Antes de injetar os PMVs, rotule uma cultura BMSC com um corante rastreador de células fluorescentes de coloração de membrana em um mililitro de meio de cultura fresco a 37 graus Celsius por 30 minutos e colha as células por digestão de tripsina. Ressuspenda as células marcadas em 0,5 mililitros de meio de cultura fresco suplementado com um micrograma de polietilenoamina e prepare PMVs conforme demonstrado.

Em seguida, concentre os PMVs por centrifugação e ressuspenda o pellet em 100 microlitros de meio de cultura fresco com um giro suave. Em seguida, carregue as células em uma seringa de insulina de um mililitro equipada com uma agulha de calibre 30 e desinfete a parte externa do músculo gastrocnêmio de um camundongo BALB / c anestesiado com etanol a 75%. Em seguida, injete lentamente todo o volume de PMVs no músculo e permita que o animal se recupere sob uma lâmpada de calor.

Após 12 horas, polvilhe 75% de etanol sobre o músculo, abra a pele com uma tesoura e colha todo o músculo gastrocnêmio em ambas as extremidades. Enxágue o músculo com PBS e coloque-o sob um microscópio de fluorescência. Usando a lente objetiva de 20 vezes, remova os pedaços de tecido muscular não fluorescente com uma lâmina afiada e pique os pedaços fluorescentes fortemente vermelhos restantes em cerca de nove cubos de milímetros cúbicos.

Incorpore cada cubo em um meio de temperatura de corte ideal. Em seguida, mergulhe os cubos em nitrogênio líquido por cinco minutos. E armazene as amostras de tecido a menos 20 graus Celsius até sua análise.

Os PMVs gerados a partir de BMSCs, conforme demonstrado, exibem predominantemente um tamanho na faixa de cerca de três micrômetros de diâmetro, conforme examinado em microscopia de contraste de fase usando o objetivo de 20 vezes. A transfecção de BMSC com de expressão fluorescente por 48 horas ilustra o encapsulamento citoplasmático da proteína EGFP pelos PMVs. Além disso, ficar com um corante mitocondrial fluorescente revela que uma grande fração dos PMVs contém mitocôndrias.

A maioria dos quais cora positiva para um corante potencial de membrana mitocondrial, indicando a funcionalidade das mitocôndrias. O tratamento com polietileno amina antes de sua administração in vivo evita a agregação de PMV durante sua concentração centrífuga para remoção de componentes celulares. A marcação de corante de membrana dos BMSCs antes da geração de PMV facilita a geração de PMVs rastreáveis por fluorescência.

De fato, a visualização de seções congeladas do músculo gastrocnêmio após a administração intramuscular de PMVs marcados indica a entrega de PMV ao citoplasma da célula muscular, provavelmente por endocitose. Ao tentar o procedimento de geração de PMV, é importante lembrar de carregar a seringa com o número apropriado de células para pressionar o êmbolo rapidamente ao lavar as células através do filtro. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da terapia com células-tronco explorarem o tratamento de doenças relacionadas à idade em camundongos.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar o PMV do BMSC para a entrega do citoplasma no músculo gastrocnêmio de camundongos.