Glycoengineering metabólica do ácido siálico usando N-acil-modificado Mannosamines

O objetivo geral desta técnica é gerar células ou produtos derivados de células com expressão de ácido siálico modificado. Portanto, as células são tratadas com manosaminas modificadas com N-acila, que são metabolizadas nos ácidos siálicos correspondentes e posteriormente expressas na superfície celular. Este método pode ajudar a responder questões-chave no campo da Glicobiologia, como a influência dos glicoconjugados nas interações receptor-ligante.

A principal vantagem desta técnica é que é fácil de aplicar e puramente citotóxica. Para demonstrar a glicoengenharia metabólica, usaremos N-acetilmanosamina, que está disponível comercialmente. Além disso, demonstraremos a síntese e o uso de N-propionil e N-butanoilmanosamina.

Os efeitos biológicos da glicoengenharia metabólica na expressão do ácido polissiálico são mostrados. Primeiro, dissolva 431,2 miligramas de cloridrato de mannosamina em 10 mililitros de solução de metóxido de sódio de três milimolares em um frasco de vidro de 15 mililitros contendo uma barra de agitação. Resfrie a mistura no gelo a zero graus Celsius.

Enquanto agita, adicione lentamente 210 micrômetros de cloreto de propionila gota a gota à solução. Em seguida, incube a mistura agitando a zero graus Celsius por quatro horas. Em seguida, transfira a solução para um tubo de plástico de 50 mililitros e faça de quatro a 8 furos na tampa do tubo com uma agulha fina.

Congele rapidamente a solução usando nitrogênio líquido. Em seguida, liofilize a amostra até que esteja completamente seca. Após a liofilização, dissolva o produto seco em acetato de etila, metanol e água.

Usando uma pipeta, coloque a solução em uma coluna de sílica gel previamente preparada. Depois de eluir 500 mililitros de solvente, colete quatro frações de mililitro. Transfira as frações eluídas para um tubo de plástico de 15 mililitros e faça três a seis furos na tampa do tubo com uma agulha fina.

Após o congelamento da solução com nitrogênio líquido, liofilize a amostra até que esteja completamente seca. Cultura de células de neuroblastoma Kelly em meio RPMI a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Antes da aplicação das manosaminas, desprenda as células do neuroblastoma de Kelly, incubando-as por 10 minutos com tripsina e EDTA.

Depois de neutralizar a tripsina com meio RPMI, contar as células usando uma câmara de Neubauer. Para medir os monossacarídeos de ácido siálico, coloque as células em 500 microlitros de meio em uma placa de cultura de tecidos de 48 poços. Para a análise dos ácidos polissiálicos, assente as células em três mililitros de meio em uma placa de cultura de células de seis centímetros de diâmetro.

Adicionar os respectivos derivados de manosamina, dissolvidos em RPMI, às células recém-plaqueadas, em uma concentração final de cinco milimolares e incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, substituindo o meio contendo as Manosaminas modificadas com N-acila a cada 24 horas. Após o tratamento, decantar o meio e lavar as células com PBS. Separe as células incubando-as por 10 minutos com tripsina e EDTA.

Neutralize a tripsina adicionando o mesmo volume de meio de cultura celular às células destacadas. Em seguida, transfira as células destacadas para tubos de plástico de 15 mililitros. Centrifugue as amostras por três minutos a 500 vezes G.Depois de descartar o sobrenadante, lave as células três vezes com cinco mililitros de PBS.

Após a centrifugação, ressuspenda os grânulos de células coletados em 500 microlitros de tampão de lise de HPLC gelado. Ultrassonicar as amostras com uma agulha de processador ultrassônico três vezes por um período de 30 segundos em amplitudes médias-altas, resfriando as amostras em gelo por pelo menos um minuto entre os ciclos. Depois de centrifugar as amostras de células lisadas, separar o sobrenadante das fracções de membrana em tubos de plástico de 1,5 mililitros.

Para hidrólise ácida, adicione 150 microlitros de uma solução molar de TFA às frações de membrana separadas. Incubar as amostras por quatro horas a 80 graus Celsius com agitação de 200 a 600 RPM. Em seguida, transporte as amostras para tubos de filtro de 0,5 mililitro com membranas de exclusão de três kilodaltons.

Centrifugar as amostras durante cerca de 30 minutos a 20 000 vezes G e 21 graus Celsius, até que o volume da fase superior seja inferior a 20 microlitros. Em seguida, descarte as inserções e faça dois a quatro furos nas tampas dos tubos que contêm o ultrafiltrado com uma agulha fina. Após o congelamento das amostras com nitrogênio líquido, liofilize-as durante a noite.

Ressuspenda as amostras secas em 10 microlitros de solução de TFA 120 milimolares e adicione 50 microlitros de solução DMB. Transfira as amostras para tubos escuros de 1,5 mililitro para protegê-las da luz ultravioleta. Incube as amostras e padrões da membrana celular por 1,5 horas a 56 graus Celsius.

Após a incubação, adicione quatro microlitros de solução de hidróxido de sódio 400 milimolares a cada amostra para interromper a reação de marcação. Para análise de HPLC, defina a temperatura da coluna para 40 graus Celsius e configure o detector de fluorescência para 373 nanômetros para excitação e 448 nanômetros para omissão, respectivamente. Injete 10 microlitros de volume de amostra e separe as sondas por 15 minutos a uma taxa de fluxo de 0,5 mililitros por minuto com metanol, acetonitrila e água como eluente.

Para análise de espectrometria de massa, injete 20 microlitros de cada amostra de HPLC coletada em um sistema detector seletivo de massa LC. No software de avaliação do sistema detector seletivo de massa LC, selecione o pico de interesse no cromatograma de íons totais. Visualize o espectro de massa do pico resolvido e exiba a relação massa-carga positiva entre 300 e 700.

Adicione um mililitro de tampão de lise western blot aos pellets previamente preparados de células de glicoengenharia e vórtice. Incubar as amostras durante 30 minutos no gelo, fazendo vórtice de cinco em cinco minutos. Em seguida, centrifugue as amostras por 1,5 horas a 20.000 vezes G e quatro graus Celsius.

Em seguida, colete o sobrenadante contendo as proteínas das células lisadas em tubos de 1,5 mililitro. Prepare as amostras para a página SDS adicionando 10 microlitros de tampão de amostra Laemmli a 90 microlitros de cada fração de proteína. Ferva as amostras por cinco minutos.

Depois de carregar as amostras em um gel de acrilamida 8% SDS, execute o gel a 25 miliamperes por duas horas em temperatura ambiente. Quando terminar, remova cuidadosamente a tampa de vidro do gel e corte a parte superior do gel que contém os bolsos de carregamento. Em seguida, coloque o gel em uma membrana de micro nitrocelulose 0,2, previamente embebida em tampão western blot.

Transferir as proteínas para a nitrocelulose de acordo com a recomendação do sistema. Depois de remover a membrana de nitrocelulose do sistema de manchas, corar a mancha com vermelho de Ponceau para visualizar as proteínas e, assim, controlar a qualidade da transferência. Em seguida, transfira a membrana de nitrocelulose para uma câmara de plástico e adicione 10 mililitros de solução de bloqueio.

Depois de incubar a membrana de nitrocelulose, decantar a solução de bloqueio e adicionar o anticorpo monoclonal antiácido polissiálico 735 em PBS. Após a incubação, lave a membrana pelo menos três vezes por cinco minutos com PBS. Agora, adicione anticorpo secundário anti-IgG de camundongo policlonal acoplado à peroxidase de rábano à membrana de nitrocelulose.

Depois de incubar e lavar a membrana, transfira-a para uma placa de um gerador de imagens apropriado. Em seguida, detecte o sinal de acordo com as instruções do fabricante. O ácido neuramínico N-glicolil marcado com DMB elui entre sete e nove minutos.

E o ácido neuramínico N-acetil marcado com DMB elui entre 10 e 12 minutos. Vários picos menores observados no cromatograma representam DMB não reagido e intermediários de reação. Os cromatogramas HPLC dos lisados celulares mostram vários picos indefinidos, que representam impurezas internas e subprodutos DMB da reação com outros alfa-cetoácidos presentes nos lisados celulares.

O tratamento com N-acetil manosamina geralmente leva à depleção do ácido N-glicolilneuramínico na superfície celular. Nos cromatogramas de células lisadas tratadas com ácido N-propionil neuramínico ou ácido N-butanoílo neuramínico, são observados picos que indicam o aparecimento dos ácidos siálicos não naturais correspondentes. A reação do DMB com espécies de ácido siálico leva a um aumento na massa molecular de 116,2 dalton, em comparação com as espécies de ácido siálico que não são marcadas com este corante.

Além das espécies de íons potentados DMB-Neu5Gc elui logo após a espécie DMB não reagiu ou parcialmente reagiu, o que explica o aparecimento de picos indefinidos no espectro de massa de DMB-Neu5Gc. O tratamento de células de neuroblastoma Kelly com N-propionilmanosamina ou N-butanoilmanosamina leva à redução da expressão de ácido polissiático na superfície celular.

O tratamento com N-acetilmanosamina, por outro lado, leva ao aumento da expressão do ácido polissiático. Ao aplicar esta técnica, as células com sialilação total podem ser geradas em vários dias. Essas células de glicoengenharia podem ser usadas em outros experimentos.

Por exemplo, para estudar as interações receptor-ligante ou, como mostrado aqui, para inibir a expressão do ácido polissiático. O procedimento de engenharia metabólica apresentado aqui é otimizado para experimentos com ácido siálico. No entanto, o mesmo procedimento também pode ser usado em experimentos com animais.

Esperamos que nosso protocolo apresentado e esta produção de vídeo ajudem os autores a trazer a glicoengenharia metabólica para os laboratórios para analisar a função e também o papel biológico dos receptores de ácido siálico e ácido siálico em sistemas biológicos. Os químicos orgânicos podem sintetizar manosaminas modificadas com N-acil com estruturas mais complexas e usá-las conforme sugerido em nosso protocolo. Seguindo nosso protocolo, todas as amostras devem ser analisadas imediatamente após a marcação fluorescente.

Consequentemente, não deve haver atraso entre os analisadores HPLC e ACMS.