Purificação de proteínas de superfície de células biotiniladas de Rhipicephalus microplus Células intestinais epiteliais

Purificação da proteína da superfície celular biotinilada das células epiteliais intestinais de Rhipicephalus microplus. Neste estudo, uma metodologia modificada baseada em gradiente de Percoll foi utilizada para isolar células epiteliais individuais do tecido intestinal de Rhipicephalus microplus. As proteínas ligadas à superfície foram biotiniladas e purificadas através de esferas magnéticas de estreptavidina para utilização em aplicações a jusante.

Dissecção do epitélio intestinal de Rhipicephalus microplus semi-ingurgitado. Você precisará dos seguintes materiais. Cole uma tira de fita adesiva no fundo de uma placa de Petri.

Adicione uma gota de Super Cola à fita. Coloque o carrapato com o lado ventral voltado para baixo na Super Cola, deixando-o secar. Mergulhe completamente o carrapato em 100 mL de PBS.

Utilizando um bisturi tamanho 11, corte da parte superior dos olhos até os festões inferiores em ambos os lados do carrapato. Usando uma pinça estéril, remova completamente o escudo e o aloscutum para expor os órgãos internos. Remova os órgãos finos e brancos semelhantes a fios e outras membranas.

Remova o intestino usando uma pinça. Armazene o intestino em HBSS e PIC gelados. Dissociação de células epiteliais.

Você precisará dos seguintes materiais. Despeje o intestino dissecado em um filtro de células de 70 mícrons dentro de um tubo Falcon de 50 mL. Como pode formar-se vácuo dentro do tubo Falcon, levante o filtro para permitir a circulação de ar.

Lave o tecido intestinal com 50 mL de HBSS gelado com PIC. Ressuspenda as tripas em 30 mL de HBSS gelada com PIC. Se necessário, use um raspador estéril para auxiliar na ressuspensão intestinal.

Centrifugar a 500 g. Retirar o sobrenadante e repetir o processo de lavagem três vezes. Ressuspenda as células intestinais em 10 mL de DMEM, 2% FCS, 5 EDTA milimolar, um TCEP milimolar e PIC.

Misture delicadamente. Incube por 60 minutos a 37 graus Celsius sob rotação lenta usando um rolo. Filtre a suspensão através de um filtro de células de 250 mícrons.

Vortex o fluxo. E filtre através de um filtro de células de 70 mícrons, coletando o fluxo restante. Centrifugue a suspensão.

Isolamento de células epiteliais únicas usando um gradiente de Percoll. Você precisará dos seguintes materiais. Filtrando através do papel de pré-filtro AP15, prepare 40% e 20% de Percoll em água Milli-Q.

Carregue uma seringa estéril com a solução de Percoll. Aplique-o no equipamento de filtro e descarregue lentamente o Percoll. Deixe esfriar a quatro graus Celsius por uma hora antes de colocar o gradiente em camadas.

Configure a bomba peristáltica conforme mostrado. Usando uma bomba peristáltica ajustada na velocidade mais baixa, coloque três mL de 40% de Percoll em um tubo de ultracentrífuga de 16 mL. Deixe repousar no gelo por 15 minutos.

A velocidade da bomba deve levar a uma vazão inferior a um mL por minuto. Inclinando o tubo para um ângulo de 45 graus, use a bomba peristáltica para colocar o 20% Percoll em cima da camada de 40%. Certifique-se de que o tubo de saída esteja apoiado no tubo da centrífuga para evitar que as gotículas se misturem com as camadas inferiores.

A velocidade da bomba deve levar a uma vazão inferior a um mL por minuto. Deixe as camadas assentarem no gelo por 15 minutos. Usando a bomba peristáltica a menos de um mL por minuto de vazão para colocar três mL de solução DMEM contendo as células epiteliais isoladas no gradiente de 20 a 40% de Percoll.

Certifique-se de que o tubo de saída esteja apoiado no tubo da centrífuga para evitar que as gotículas se misturem com as camadas inferiores, interrompendo o gradiente. Centrifugar a 600 g durante 10 minutos. Colete as interfases entre o DMEM, gradiente de 20% de Percoll e os gradientes de 20% 40% de Percoll para isolar células epiteliais únicas.

Biotinilação de proteínas de superfície celular e isolamento de proteínas de superfície biotiniladas. Você precisará dos seguintes materiais. Biotinilar 100 microlitros de células epiteliais unicelulares usando o Kit de Conjugação de Biotina Tipo A de acordo com as instruções do fabricante.

Adicione 100 microlitros de PBS, 1% Triton X-100, 10% glicerol, 100 glutationa oxidada micromolar e PIC às células biotiniladas. Incube no gelo por uma hora com uma mistura suave a cada 10 minutos. Centrifugar o extracto celular a 20 000 g a quatro graus Celsius durante 20 minutos e retirar a amostra.

Prepare 50 microlitros de esferas magnéticas de estreptavidina lavando com 1.000 microlitros de TBS 1%Tween-20. Misture delicadamente sacudindo com o dedo. Coloque o tubo em um suporte magnético, coletando as contas contra a lateral do tubo.

Remova e descarte o sobrenadante. Combine 300 microlitros de proteínas de superfície celular biotiniladas com esferas magnéticas lavadas. Incubar durante duas horas à temperatura ambiente com agitação.

Colete as contas com o suporte magnético, remova e descarte o sobrenadante. Adicione 300 microlitros de TBS 1%Tween-20 ao tubo, misturando suavemente para ressuspender as contas. Colete contas, remova e descarte o sobrenadante.

Repita esta etapa de lavagem duas vezes. Adicione 100 microlitros da glicina molar pH dois às esferas magnéticas. E incube em temperatura ambiente por cinco minutos.

Recolha as esferas e remova o sobrenadante contendo proteínas de superfície biotiniladas eluídas. A Figura um é uma representação do protocolo utilizado para isolar células epiteliais e suas proteínas de superfície de um carrapato inteiro. Utilizando este protocolo, aproximadamente 1,2 por 10 a sete células por mL com 75 a 80% de viabilidade e 20 a 24 microgramas de proteínas de superfície biotiniladas purificadas podem ser purificadas a partir de uma dissecção inicial de 50 carrapatos.

Imagens representativas de microscopia de fluorescência de células epiteliais de obtenção de carrapatos preparadas usando este protocolo são mostradas nas figuras 2A e 2B. As células aparecem como morfologia de superfície única, esférica e lisa e um tamanho consistente em toda a amostra. Isolamentos deficientes são visualizados para conter dissociação incompleta de células epiteliais individuais com populações de células variadas identificadas por meio de tamanhos e morfologias de células variadas.

A contaminação cruzada das proteínas do hospedeiro, figura 3A, pode ser minimizada enxaguando adequadamente as entranhas dos carrapatos para produzir um gradiente de Percoll branco ou claro, figura 3B. A comparação de proteínas por SDS-PAGE, figura 4A, coloração de prata, figura 4B, dot blot, figura cinco, e ELISA, figura seis, indica que as metodologias descritas purificaram com sucesso proteínas de superfície biotiniladas de células epiteliais individuais isoladas de intestinos de carrapatos Rhipicephalus microplus. Em conclusão, os métodos utilizados neste estudo isolaram com sucesso células epiteliais individuais de todo o intestino de Rhipicephalus microplus.

Proteínas da superfície das células epiteliais de Rhipicephalus microplus foram obtidas para posterior análise e estudos. Finalmente, o protocolo desenvolvido demonstrou o rendimento potencial de células epiteliais individuais do intestino do carrapato e a eficiência das proteínas de superfície biotiniladas da célula. O protocolo desenvolvido pode ser utilizado em qualquer espécie de carrapato de importância econômica em um esforço para investigar as interações carrapato-hospedeiro, estudando a composição proteica da membrana do intestino.