Name: Longo prazo Imagens ao vivo de Drosophila Disco para os olhos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Aprenda a realizar imagens ao vivo de longo prazo de discos imaginais de Drosophila para estudar diferenciação de fotorreceptores e rotação omatidial. Este método permite observar processos celulares dinâmicos por 10 horas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Somos gratos a Chun-lan Hsu e Yu-Chi Yang para preparar a comida mosca e manter os estoques da mosca, e Su-Ping Lee eo IMB imagem Núcleo por sua ajuda com a microscopia confocal. Este estudo foi apoiado por bolsas para YHS (NSC 101-2321-B-001 -004, NSC 100-2321-B-001 -012, NSC 102-2321-B-001 -002, MAIS 103-2311-B-001 -035 -MY3) do Conselho Nacional de Ciência e do Ministério da Ciência e Tecnologia da República da China.

Configuração 1. Pré-experimental <ol><li> Recolhe um ovo de mosca que expressa nuclear proteína fluorescente verde (GFP) sob mδ0.5-Gal4 e cultura a 25 ° C durante 5 dias. </li><li> Microondas 0,7 g de agarose de baixo ponto de fusão em 10 ml de solução salina tamponada 1x com fosfato (PBS) até a agarose estar completamente dissolvida. Manter o gel de baixo ponto de fusão a 0,7% numa incubadora a 37 ° C até à sua utilização. </li><li> Esterilizar todo o equipamento, incluindo as pinças, tesouras, 42 mm x 0,17 mm lamelas, uma placa de ponto vidro 9 poços, e uma câmara de cultura magnética, com 70% de etanol por mais de 12 h. </li><li> Prepara-se o meio de cultura 3: meio de Drosophila de Schneider suplementado com 2% de Soro Fetal Bovino (FBS), 0,5% de penicilina-estreptomicina, e 1,25 mg / mL de insulina. Para evitar a contaminação, preparar a forma de um capuz de cultura de células. Armazenar o meio de cultura preparado, a 4 ° C e utilizadas dentro de um mês. </li><li> Limpe a plataforma de dissecção e o experimentador&#39;s mãos com etanol a 70% antes de iniciar a dissecção. </li></ol> Dissecção 2. Disco <ol><li> Air secar todo o equipamento a partir de 70% de etanol. </li><li> Selecione uma larva de terceiro instar de um frasco mosca. Para evitar a contaminação a partir do frasco de mosca, lavar a larva em 1x PBS, 3x para remover os resíduos. </li><li> Dissecar a larva limpas em 1 ml de meio de cultura (em RT) na 9-poço da placa de ponto de vidro sob um microscópio de dissecção. </li><li> Agarrar a larva com um par de pinças em cerca de um terço do caminho a partir da extremidade posterior e mais uma pinça no gancho boca. Puxar as duas pinças em sentidos opostos para libertar os tecidos internos. <ol><li> Retirar as glândulas salivares, gordura corporal, e a cutícula do complexo olho-cérebro ligado ao gancho boca. Se o cordão nervoso ventral está ainda ligado, cortá-lo afastado com uma tesoura. </li></ol></li><li> Utilizar um par de fórceps para agarrar o gancho boca e um par de fórceps para remover uma peça de tecido que connects os cérebros e discos de olho na parte dorsal. NOTA: Se esse tecido não é removido, os dois discos olho-antenal será próximos uns dos outros e do cérebro. Os discos oculares, em seguida, não vai ficar na posição horizontal sobre a lamela porque este tecido, o cérebro, e o disco de olho-de antenas irá formar um triângulo. </li><li> Gire todo o complexo para uma posição ventral-para cima. Remover o filamento que liga o gancho ou disco para o cérebro. NOTA: Se o filamento não é removido, o disco olho-antenal será dividida em duas peças, quando o gancho for removido da boca. <ol><li> Retirar o gancho boca. Tome cuidado para não danificar o disco olho durante o processo. NOTA: O disco olho é agora livre no meio e apenas ligado ao cérebro pela haste óptico. </li></ol></li></ol> 3. montagem <ol><li> Ar seco e montar os componentes da câmara com um x 0,17 milímetros lamela de 42 mm. Anexar uma dupla camada de O-rings para o centro da lâmina de cobertura para segurar thE agarose. </li><li> Monte a câmara com lamínula. Coloque a lamela de 42 mm x 0,17 mm no receptor de palco. Coloque o O-ring de silício sobre a tampa deslizante. Coloque a base. Bloqueie o cacifo de vedação e coloque a tampa ( Figura 1 ). </li><li> Transferir cuidadosamente o complexo olho-cérebro dissecado para o centro do O-ring usando uma micropipeta de 20 μL com uma ponta de 10-200 μL. </li><li> Remover a maior parte do meio e adicionar 12 μL de 0,7% de agarose de baixo ponto de fusão (a 37 ° C) à amostra. NOTA: A posição do disco ocular pode ser alterada com fórceps antes da solidificação da agarose. A agarose irá solidificar dentro de 5 min. <ol><li> Adicionar 1 mL de meio de cultura à temperatura ambiente ao centro do O-ring; Cada O-ring pode carregar até 4 amostras. Certifique-se de que a agarose é colada ao O-ring para evitar a derivação da amostra. NOTA: Não é necessária ventilação ou circulação do meio. </li></ol></li></ol>4. microscopia confocal <ol><li> Coloque a câmara na platina de um microscópio invertido confocal durante 30 minutos para equilibrar a temperatura. Isto pode impedir a dispersão do eixo Z durante a imagiologia. </li><li> Antes de imagens ao vivo de longo prazo, verificar se o tecido está intacta por microscopia de contraste de interferência diferencial. </li><li> Para evitar a fototoxicidade, utilize uma fonte de laser abaixo de 2 mW. Use uma objetiva de 40X para a imagem latente. </li><li> 62? M adquirir imagens Z-stack em 12 min a um intervalo óptico de 1? M. Adquirir 40 ciclos de varrimentos ao longo de um total de 10 h. Assegure-se que cada ciclo contém 12 min de imagiologia e 3 minutos de descanso. </li></ol>

<ol><li>Cohen, S. M. Imaginal disc development. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCohen%2C+SM+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Development of Drosophila melanogaster</a>. Bate, M., Martinez-Arias, A. 2, Cold Spring Harbor. NY. 747-842 (1993).</li>
<li>Auerbach, C. The development of the legs, wings and halteres in wild type and some mutant strains of Drosophila melanogaster. Proc. R. Soc. Edinb. B. 58, 787-815 (1936).</li>
<li>Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+Ex+Vivo+Culture+and+Live+Imaging+of+Drosophila+Larval+Imaginal+Discs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Long-term Ex Vivo Culture and Live Imaging of Drosophila Larval Imaginal Discs.</a> PLoS One. 11 (9), e0163744(2016).</li>
<li>Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+Drosophila+retina%2C+a+neurocrystalline+lattice%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice.</a> Dev Biol. 53 (2), 217-240 (1976).</li>
<li>Wolff, T., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beginning+of+pattern+formation+in+the+Drosophila+compound+eye%3A+the+morphogenetic+furrow+and+the+second+mitotic+wave%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave.</a> Development. 113 (3), 841-850 (1991).</li>
<li>Tomlinson, A., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+differentiation+in+Drosophila+ommatidium%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Neuronal differentiation in Drosophila ommatidium.</a> Dev Biol. 120 (2), 366-376 (1987).</li>
<li>Wolff, T., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWolff%2C+T+%22The+Development+of+Drosophila+Melanogaster%22">The Development of Drosophila Melanogaster</a>. , Cold Spring Harbor Press. 1277-1316 (1993).</li>
<li>Adler, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+signaling+and+morphogenesis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Planar signaling and morphogenesis in Drosophila.</a> Dev Cell. 2 (5), 525-535 (2002).</li>
<li>Choi, K. W., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+of+glia+along+photoreceptor+axons+in+the+developing+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Migration of glia along photoreceptor axons in the developing Drosophila eye.</a> Neuron. 12 (2), 423-431 (1994).</li>
<li>Strutt, D. I., Mlodzik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ommatidial+polarity+in+the+Drosophila+eye+is+determined+by+the+direction+of+furrow+progression+and+local+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Ommatidial polarity in the Drosophila eye is determined by the direction of furrow progression and local interactions.</a> Development. 121 (12), 4247-4256 (1995).</li>
<li>Gaengel, K., Mlodzik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Egfr+signaling+regulates+ommatidial+rotation+and+cell+motility+in+the+Drosophila+eye+via+MAPK%2FPnt+signaling+and+the+Ras+effector+Canoe%2FAF6%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Egfr signaling regulates ommatidial rotation and cell motility in the Drosophila eye via MAPK/Pnt signaling and the Ras effector Canoe/AF6.</a> Development. 130 (22), 5413-5423 (2003).</li>
<li>Li, C., Meinertzhagen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditions+for+the+primary+culture+of+eye+imaginal+discs+from+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Conditions for the primary culture of eye imaginal discs from Drosophila melanogaster.</a> J Neurobiol. 28 (3), 363-380 (1995).</li>
<li>Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+in+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Pattern formation in the Drosophila eye.</a> Curr Opin Genet Dev. 17 (4), 309-313 (2007).</li>
<li>Treisman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+differentiation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Retinal differentiation in Drosophila.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (4), 545-557 (2013).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene,, Wittbrodt, F., J,, Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li>
<li>Keller, P. J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+in+vivo+imaging+of+entire+embryos+with+Digital+Scanned+Laser+Light+Sheet+Fluorescence+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Quantitative in vivo imaging of entire embryos with Digital Scanned Laser Light Sheet Fluorescence Microscopy.</a> Curr Opin Neurobiol. 18 (6), 624-632 (2008).</li>
<li>Winter, P. W., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Faster+fluorescence+microscopy%3A+advances+in+high+speed+biological+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Faster fluorescence microscopy: advances in high speed biological imaging.</a> Curr Opin Chem Biol. 20, 46-53 (2014).</li>
<li>Bosveld, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Control+of+Morphogenesis+by+Fat%2FDachsous%2FFour-Jointed+Planar+Cell+Polarity+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mechanical Control of Morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-Jointed Planar Cell Polarity Pathway.</a> Science. 336 (6082), 724-727 (2012).</li>
<li>Ghannad-Rezaie, M., Wang, X., Mishra, B., Collins, C., Chronis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Chips+for+In+Vivo+Imaging+of+Cellular+Responses+to+Neural+Injury+in+Drosophila+Larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Chips for In Vivo Imaging of Cellular Responses to Neural Injury in Drosophila Larvae.</a> Plos One. 7 (1), (2012).</li>
<li>Heemskerk, I., Lecuit, T., LeGoff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+clonal+analysis+based+on+chronic+in+vivo+imaging+allows+multiscale+quantification+of+growth+in+the+Drosophila+wing+disc%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dynamic clonal analysis based on chronic in vivo imaging allows multiscale quantification of growth in the Drosophila wing disc.</a> Development. 141 (11), 2339-2348 (2014).</li>
<li>Taylor, J., Adler, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+rearrangement+and+cell+division+during+the+tissue+level+morphogenesis+of+evaginating+Drosophila+imaginal+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell rearrangement and cell division during the tissue level morphogenesis of evaginating Drosophila imaginal discs.</a> Dev Biol. 313 (2), 739-751 (2008).</li>
<li>Ward, R. E., Reid, P., Bashirullah, A., D'Avino, P. P., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP+in+living+animals+reveals+dynamic+developmental+responses+to+ecdysone+during+drosophila+metamorphosis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">GFP in living animals reveals dynamic developmental responses to ecdysone during drosophila metamorphosis.</a> Dev Biol. 256 (2), 389-402 (2003).</li>
<li>Gibbs, S. M., Truman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+and+cyclic+GMP+regulate+retinal+patterning+in+the+optic+lobe+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide and cyclic GMP regulate retinal patterning in the optic lobe of Drosophila.</a> Neuron. 20 (1), 83-93 (1998).</li>
<li>Fristrom, J. W., Logan, W. R., Murphy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+and+Minimal+Culture+Requirements+for+Evagination+of+Imaginal+of+Drosophila-Melanogaster+in-Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthetic and Minimal Culture Requirements for Evagination of Imaginal of Drosophila-Melanogaster in-Vitro.</a> Dev Biol. 33 (2), 441-456 (1973).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Neste estudo, nós fornecemos um protocolo detalhado para um experimento de imagens ao vivo de longo prazo sobre discos imaginais de Drosophila. Passamos muito tempo praticando a dissecção cuidadosa para evitar danos ao disco e para permitir a fixação do disco perto as lamelas. Tentámos poli-L-lisina (PLL) e baixo ponto de fusão de agarose para segurar o tecido; no final, o de agarose de baixo ponto de fusão, demonstrou maior capacidade para manter o tecido. Embora apenas o disco olho foi usado no presente documento para demonstrar a ocorrência normal de diferenciação de fotorreceptores e rotação ommatidial durante o período de imagens ao vivo 10 h, este método também pode ser aplicado a, pelo menos, um outro disco, o disco da asa, como demonstrado em um estudo anterior 3. Além disso, a preparação de meio de cultura e configuração imagens ao vivo são simples e não exigem aeração ou circulação média. imagens ao vivo contínuo pode fornecer uma seqüência temporal clara de véspera biológicants. No nosso relatório anterior de diferenciação glia e migração no disco olho, nós fornecemos prova direta de que glia envolvendo diferenciar da glia existente após a migração para o anterior do disco olho 3. Longo prazo ex vivo cultura permite a rotulagem ativado por laser específico de células, como a foto-conversão da proteína fluorescente KAEDE, para seguir seus comportamentos 3. Ele também pode acomodar o teste de produtos químicos que são adicionados directamente ao meio de cultura; Assim, ele pode ser usado como uma plataforma de rastreio de drogas. Desde ocorrer algum processo dinâmico dentro de minutos ou segundos, alta resolução temporal é necessária. Para aumentar a resolução temporal, microscopia folha de luz 15, 16 ou microscopia de disco giratório 17 pode ser uma boa opção. A condição cultura atual não é perfeito. Ele não suporta o crescimento disco. celular proliferation só é suportada por até 12 h 3. Após 12 h em cultura ex vivo, a taxa de diferenciação de fotorreceptores começa a diminuir 3. Isto pode ser devido à falta de determinados nutrientes ou hormônios. Uma vez que a principal diferença neste meio de cultura, é a elevada concentração de insulina, a insulina de mamero pode ser parcialmente imitar a função de péptidos endógenos do tipo insulina. A adição de extracto de mosca, a trealose de açúcar no sangue de insectos, e várias concentrações da hormona de muda de 20-hidroxiecdisona, não eram benéficas 3. No entanto, o período de cultura de 12-18 horas é suficiente para estudar muitos processos de desenvolvimento. Métodos de cultivo alternativos para cultivar discos imaginais larvas foram comparados 3, e nossa condição de cultura e imagem fornece a janela de tempo mais longo e mais clareza para imagens ao vivo. Embora os discos dentro de larvas vivas e pupas podem ser visualizados diretamente18, 19, 20, 21, 22, a janela de tempo para resolução e observações são limitados. Larvar tardio e discos de pupa podem ser cultivadas durante um longo período de tempo 23, 24, mas os discos passam por morfogénese significativa. Para aproveitar os, discos larvais 2D planas, nosso método de cultivo e de imagem é a melhor solução até agora.

Os discos imaginais de Drosophila larvais ter sido um sistema experimental favorecida para o estudo de uma grande variedade de mecanismos biológicos. Estes discos invaginar a partir do epitélio embrionário e tornar-se estruturas de saco construídas por duas camadas epiteliais, Peripodial Epitélio (PE) e Disco adequada (DP) 1, 2. As células de discos imaginais proliferam e diferenciam-se progressivamente, durante as fases de larvas e de pupas e, eventualmente, tornar-se as estruturas do corpo adulto. Devido à estrutura de duas camadas plana e simples dos discos imaginais, elas são fáceis de observar quando dissecados a partir de larvas. No entanto, apesar de vários esforços por muitos grupos, os métodos atuais para a cultura de longo prazo dos discos imaginais não têm sido satisfatórios. Recentemente, desenvolvemos um método de cultura que pode sustentar o desenvolvimento normal de vários discos imaginais por até 18 h e que permite que imagens ao vivo 3 </s-se&gt;. O método de cultura pode suportar a diferenciação das células e a migração, mas ele pode suportar a proliferação celular por apenas 7-12 h e não pode suportar o crescimento do disco. A principal diferença no meio de cultura é a elevada concentração de insulina 3. O método é simples, e não é necessária nenhuma aeração especial ou a circulação média. Um dos discos imaginais mais estudado é o disco olho-antenal. O olho de Drosophila é construída de aproximadamente 800 ommatidia. Cada omatídeo é composta por oito células fotorreceptoras (R1-R8). No disco olho das larvas, as células fotorreceptoras diferenciam na sequência da passagem da Morfogenética Sulco (MF), que varre o disco olho de posterior para anterior 4, 5. Os fotorreceptores em um omatídeo diferenciar em sequência, começando com R 8, seguido por R2 / R5, R3 / R4, R 1 / R6, e R7 6. O ommatidia no dorsal e vemetades ntral do disco olho submetido a uma rotação de 90 ° em sentidos opostos, o que resulta em quiralidade oposta 7, 8. O processo de rotação ocorre em duas etapas: em primeiro lugar, uma rotação de 45 ° começa no e é completada a sexta linha ommatidia atrás do MF; a segunda rotação de 45 ° está concluída em cerca de linha 16 9, 10. Este estudo utilizou rotação ommatidial, marcado pela R3 / 4-específico mδ0.5-GA4 11, para demonstrar a diferenciação celular normal e dinâmica que pode ser observada através deste método para a cultura e vive-imagem do disco olho.

<table><tbody><tr><td>Ágara de baixo ponto de fusão</td><td>AMRESCO&nbsp;</td><td>0815-25G</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td><td>AMRESCO</td><td>0780-2PK</td><td></td></tr><tr><td>42 mm x 0.17 mm lamínulas&nbsp;</td><td>PST</td><td>G401-42</td><td></td></tr><tr><td>Schneider' s Drosophila médio&nbsp;</td><td>Thermo</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>759</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de Cultura&nbsp;</td><td>Sistema</td><td>de Cultivo de Células</td>PECON <td></td> POC-R2</tr><tr><td>40X objetiva</td><td></td><td></td><td>C-Apocromata 40X/1.2W Korr objetiva&nbsp;</td></tr><tr><td>Tensão da mosca: nls. GFP</td><td>Bloominggton</td><td>4775</td><td></td></tr></tbody></table>

longo prazo imagens ao vivo de<em&gt; drosophila</em&gt; disco para os olhos

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

imagens ao vivo fornece a capacidade de monitorar continuamente os processos celulares e de desenvolvimento dinâmicos em tempo real. Drosophila discos imaginais das larvas foram usadas para estudar muitos processos biológicos, tais como a proliferação celular, a diferenciação, o crescimento, a migração, a apoptose, a competição, a sinalização célula-célula, e formação limite compartimental. No entanto, métodos para a ex vivo da cultura a longo prazo e imagens ao vivo dos discos imaginais não têm sido satisfatórios, apesar de muitos esforços. Recentemente, desenvolvemos um método para o longo prazo ex vivo da cultura e imagem ao vivo de discos imaginais para até 18 h. Além da utilização de uma elevada concentração de insulina no meio de cultura, uma agarose de baixo ponto de fusão também foi utilizado para incorporar o disco para impedir que deriva durante o período de imagem. Este relatório usa os discos olho-antenal como um exemplo. expressão mδ0.5-GA4 / 4-específica de fotorreceptores R3 foi seguido para demonstrar que fotorreceptores differenA rotação ommatidial pode ser observada durante um período de 10 h de imagem ao vivo. Este é um protocolo detalhado que descreve este método simples.

<html> Neste exemplo, os fotorreceptores R3 / R4 foram marcadas com mδ0.5-GA4 para monitorar a diferenciação de fotorreceptores. mδ0.5-GA4 dirige uma forte express em R4 e expressão mais fraca em R3 11, tornando-a um excelente marcador para R3 e R4, bem como para o processo de rotação ommatidial. Em Filme 1, R3 e R4 foram marcadas com GFP. No início da sessão de imagens ao vivo de 10 h, havia 8 linhas de aglomerados ommatidial (Figura 2A e um filme) e 14 linhas de aglomerados ommatidial no final (Figura 2B). A taxa de diferenciação ommatidial foi de 1,67 h por fila, que é próximo da taxa de 1,5-2 h / linha em in vivo discos 7, 8, 9, 10, 11,s = &quot;xref&quot;&gt; 12, 13, 14. Com base nas posições relativas dos R3 e R4, rotação ommatidial ocorrido no disco ex vivo em cultura durante a imagem ao vivo (Figura 2A &#39;A &#39;&#39;, B&#39; e B &#39;&#39;). Um conjunto R3 / R4 único foi marcado com uma esfera em branco do primeiro quadro de filme 2. No início, o eixo R3 / R4 parece ser perpendicular ao equador (Figura 2C e Filme 2). Em seguida, ele parece rodar 15 °, 30 °, 45 ° e no 3 (Figura 2C &#39;), 6 (Figura 2C &#39;&#39;), e 9 (Figura 2C &#39;&#39;&#39;) h, respectivamente. Estes dados sugerem que este método pode sustentar a diferenciação de fotorreceptores durante as imagens ao vivo 10 h. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55748/55748fig1.jpg" /> Figure 1: Diagrama esquemático de montagem de câmara. Diagrama esquemático da montagem de câmara de: (1) Coloque a lamela de camada dupla do anel-O-ligado no receptor de fase. (2) Colocar o silício anel de vedação sobre a lamela de cobertura. (3) Colocar a base. (4) Bloquear o armário de vedação. (5) carregar a amostra no centro do anel de vedação e colocar a tampa. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55748/55748fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55748/55748fig2.jpg" /> Figura 2: imagem ao vivo de R3 / R4 Diferenciação e rotação. R3 / R4 marcado com mδ0.5-Gal4-expressando GFP forma nuclear durante 10 h de imagens ao vivo. Todos os valores foram capturados a partir de filme 1. (A) A imagem obtida no início. ( <strong<html> &gt; A&#39;-A&quot;) imagem ampliada da área de box à esquerda (A&#39;) e direito (A&quot;). (B) A imagem obtida no final do período de 10 h. (B&#39;-B&quot;) imagem ampliada da área de box na esquerda (B&#39;) e direito (B&quot;). (CC &#39;&#39; &#39;) Um par R3 / R4 único (assinalado por uma seta em A&#39;) é seguida ao longo do tempo para demonstrar a rotação do par de R3 / R4. Barras de escala = 15? m, 10? m, e 5? M em A, B, e C, respectivamente. Todas as figuras são z projecções de intensidade máxima. A escala de tempo é mostrado em h: min. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55748/55748fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="filme 1" src="/files/ftp_upload/55748/55748mov1.jpg" /> Filme 1:Rce.jove.com/files/ftp_upload/55748/Movie_1.avi &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para fazer o download deste filme. <img alt="Filme 2" src="/files/ftp_upload/55748/55748mov2.jpg" /> Filme 1: <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55748/Movie_2.avi" target="_blank">Clique aqui para fazer o download deste filme.</a>

Este protocolo descreve um método detalhado para a longo prazo ex vivo cultura e imagens ao vivo de um disco imaginal Drosophila. Ele demonstra a diferenciação de fotorreceptores e rotação ommatidial dentro do período de 10 h de imagens ao vivo do disco olho. O protocolo é simples e não requer instalação caros.

Longo prazo Imagens ao vivo de<em&gt; Drosophila</em&gt; Disco para os olhos

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

O objetivo geral deste método é demonstrar a imagem em tempo real de discos imaginais, que são assuntos experimentais populares para o estudo de uma ampla variedade de fenômenos biológicos, incluindo proliferação celular, diferenciação, apoptose e competição. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo da biologia do desenvolvimento, como a morfologia celular e a migração em tecidos específicos. A principal vantagem desta técnica é que a imagem contínua pode revelar mais informações do que tecidos fixados, como a migração celular.Em geral, indivíduos novos neste método terão dificuldades, pois a dissecação e o montagem são etapas complexas. A demonstração visual deste método é essencial, já que a etapa de rotação e transferência é difícil de aprender, pois uma dissecação inadequada resulta em baixa resolução. Para iniciar o protocolo, desinfete o equipamento com etanol a 70% e deixe o equipamento secar ao ar.Em seguida, selecione uma larva de terceiro estádio de um frasco de moscas e lave a larva em solução salina tamponada com fosfato 1X, ou PBS, para prevenir contaminação proveniente do frasco de moscas. Coloque a larva limpa em um mililitro de meio de cultura à temperatura ambiente em uma placa de vidro com nove poços sob um microscópio de dissecação. Segure a larva com um par de pinças a um terço do caminho a partir da extremidade posterior e, com outro par de pinças, segure o gancho bucal.Puxe as duas pin&ccedil;as em dire&ccedil;&otilde;es opostas para liberar os tecidos internos. Em seguida, remova as gl&acirc;ndulas salivares, o corpo gorduroso e a cut&iacute;cula do complexo olho-c&eacute;rebro preso ao gancho bucal. Se o cord&atilde;o nervoso ventral ainda estiver preso, corte-o com tesoura.Use um par de pin&ccedil;as para segurar o gancho bucal. Use o outro par de pin&ccedil;as para remover o tecido que conecta o c&eacute;rebro e os discos oculares na regi&atilde;o dorsal. Em seguida, gire todo o complexo de modo que o lado ventral fique voltado para cima.Remova o filamento que conecta o gancho ou disco ao cérebro. Em seguida, remova o gancho bucal, tomando cuidado para não danificar o disco ocular durante o processo. O disco ocular agora está livre no meio e conectado ao cérebro apenas pelo pedúnculo óptico.Fixe uma dupla camada de anéis O no centro de um lamínula de 42 milímetros por 0,17 milímetros para segurar o agarose. Em seguida, monte a câmara com o lamínula. Coloque o lamínula no receptor da platina.Em seguida, coloque a junta de vedação de silicone sobre a lamínula. Depois, posicione a base, feche o travamento de vedação e coloque a tampa. Usando uma micropipeta de 20 microlitros com ponteira de 10 a 200 microlitros, transfira cuidadosamente o complexo olho-cérebro dissecado para o centro da junta de vedação.Remova a maior parte do meio e adicione 12 microlitros de agarose de baixo ponto de fusão a 0,7%, a 37 graus Celsius, à amostra. Incline levemente a extremidade do agar para que a amostra permaneça próxima a uma lamínula e evite que ela se solte. Adicione um mililitro de meio de cultura à temperatura ambiente ao centro do anel O.Certifique-se de que a agarose está colada ao anel O para evitar o deslocamento da amostra. Coloque a câmara preparada sobre a platina de um microscópio confocal invertido durante 30 minutos para equilibrar a temperatura. Antes da imagem viva de longo prazo, verifique se o tecido está intacto por meio de microscopia de contraste de interferência diferencial.Altere a objetiva para 40x para a aquisição de imagens. Por fim, adquira imagens em Z-stack de 62 micrômetros em 12 minutos com um intervalo óptico de um micrômetro. Adquira 40 ciclos de varreduras ao longo de um total de 10 horas e certifique-se de que cada ciclo contenha 12 minutos de aquisição de imagens e três minutos de repouso.R3 e R4 foram marcados com GFP. No início da sessão de imagemagem vital de 10 horas, havia oito fileiras de aglomerados de omarídios, e no final, 14 fileiras de aglomerados de omarídios. Com base nas posições relativas de R3 e R4, a rotação dos omarídios ocorreu no disco cultivado ex vivo durante a imagemagem vital.No início, o eixo R3/R4 parece ser perpendicular ao equador. Em seguida, parece girar 15 graus em três horas, 30 graus em seis horas e 45 graus em nove horas, sugerindo que este método pode sustentar a diferenciação de fotorreceptores durante 10 horas de imagem viva. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como dissecar corretamente o disco ocular de Drosophila e realizar a imagem viva.

long-term-live-imaging-of-drosophila-eye-disc

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Aqui nós descrevemos um protocolo para analisar a migração de células gliais no olho Drosophila desenvolvimento, utilizando análise microscópica ao vivo emparelhado com GFP tag células gliais.

Imagens ao vivo da migração das células da glia no Disco Drosophila Eye Imaginal

Nós descrevemos um romance vermelho proteína fluorescente repórter (RFP) que se expressa especificamente...

A Novel Reporter RFP para ajudar na visualização do Disco Imaginal Eye em Drosophila</em

Hemócitos Drosophila dispersam sobre a totalidade do embrião em desenvolvimento. Este protocolo demonstra como montar e imagem essas migrações usando embriões com hemócitos fluorescente etiquetado.

Imagens ao vivo de Drosophila melanogaster Embrionárias Migrações hemócitos

Preparação de Desenvolvimento e Adultos Drosophila Brains e retina de imagens ao vivo

Fonte: Hellerman, M. B., et al. Imagens ao vivo do  olho de pupa  de Drosophila. J. Vis. Exp. (2015)O vídeo demonstra uma técnica de imagem ao vivo para estudar o padrão dos olhos em uma pupa de Drosophila melanogaster. Os marcadores marcados com proteína fluorescente verde (GFP) permitem a visualização da organização e diferenciação celular durante a formação da estrutura ocular em desenvolvimento.

Imagens ao vivo do olho de pupa de Drosophila usando microscopia de fluorescência

O método de tomate / GFP-FLP / FRT envolve visualizando células fotorreceptoras mosaico em viver Drosophila. Ele pode ser usado para seguir os destinos das células fotorreceptoras individuais na retina durante dias ou semanas. Este método é ideal para estudos de degeneração da retina e doenças neurodegenerativas ou o desenvolvimento de células fotorreceptoras.

O tomate / GFP-FLP / FRT Method for Imaging ao vivo de Mosaico Adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; As células fotorreceptoras

Este protocolo detalha um método simplificado utilizado para conduzir imagem de células vivas, no contexto de um cérebro de larvas intacta. Abordagens imagens de células vivas são de valor inestimável para o estudo de células-tronco neurais divisões assimétricas, bem como outros processos neurogênicas e de desenvolvimento, de forma consistente descobrir mecanismos que anteriormente eram negligenciados.

Imagens ao vivo de<em&gt; Drosophila</em&gt; larval Neuroblastos

As estruturas adultas de Drosophila são derivadas de estruturas semelhantes a sacos chamadas discos imaginais. A análise desses discos fornece informações sobre muitos processos de desenvolvimento, incluindo determinação de tecidos, estabelecimento de limites de compartimentos, proliferação celular, especificação do destino celular e polaridade celular planar. Este protocolo é usado para preparar discos imaginais para microscopia de luz / fluorescente.

Dissecção e Imunocoloração do Imaginário discos de Drosophila melanogaster

Este protocolo apresenta um método eficiente para obter imagens do neuroepitélio do olho pupal de Drosophila vivo. Este método compensa o movimento do tecido e a topologia irregular, melhora a visualização dos limites celulares por meio do uso de várias proteínas de junção marcadas com GFP e usa um equipamento de imagem facilmente montado.

Vivo-imaging da Drosophila Pupal Eye

Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para realizar imagens ao vivo da divisão assimétrica de células-tronco germinativas (GSCs) no nicho ovariano de Drosophila. Usamos uma linhagem transgênica que expressa de forma ubíqua uma fusão de proteína fluorescente verde (GFP) da proteína do espectrossomo Par-1.

Imagem ao vivo estendida de nichos de células-tronco germinativas de Drosophila melanogaster fêmea

Aqui, um protocolo é apresentado para imagens ao vivo de longo prazo da perna de Drosophila durante o estágio de pupa, envolvendo a remoção completa do pupário. Este protocolo também pode ser aplicado a outros tecidos.

Imagem ao vivo de longo prazo do desenvolvimento da perna de pupa de Drosophila após a remoção do pupário

Aprenda a realizar imagens ao vivo de longo prazo de discos imaginais de Drosophila para estudar diferenciação de fotorreceptores e rotação omatidial. Este método permite observar processos celulares dinâmicos por 10 horas.

Longo prazo Imagens ao vivo de

Explorar mais vídeos