Name: Detecção de ligantes estrogênicos em produtos de cuidados pessoal usando uma tela de estrogênio de levedura otimizada para o laboratório de ensino de graduação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 13 s
Description: Aprenda a usar uma tela de estrogênio de levedura otimizada para quantificar atividade estrogênica em produtos de cuidados pessoal. Este método ensina habilidades laboratoriais essenciais em toxicologia e disrupção endócrina.

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Este projecto foi financiado pelo arranque financiamento TME e AMR de Louisiana Tech University e Universidade de Furman, respectivamente. Financiamento adicional foi fornecido por uma concessão de avanço de faculdade de 2015 para AMR e TME de The faculdades associadas do Sul, um subsídio de Louisiana EPSCoR Pfund para TME da National Science Foundation e o Conselho de regentes de Louisiana e um prêmio de viagem ao TME do Universidade do Sul. Agradecemos a Dr. David Eubanks (Furman) para obter assistência com análises estatísticas e Sr. Christopher Moore por "nos dar uma mão" durante as filmagens.

1 fazer reagentes
<ol>
	<li>Preparar a mídia de glicose e galactose pela mistura de nitrogênio de levedura 6,7 g base de dextrose 20g ou galactose, sulfato de adenina 20 mg (adicionado como 10 mL de uma solução aquosa de 200 mg/100 mL), uracil 20 mg (adicionado como 10 mL de uma solução aquosa de 200 mg/100 mL) , leucina 60 mg (adicionado como 6 mL da solução aquosa a 1 g/100 mL) e histidina 20 mg (adicionado como 2 mL da solução aquosa a 1 g/100 mL) em água destilada até um volume final de 1 L. Esterilize por filtração (filtro de 0,2 µm). Meios de comunicação podem ser armazenados a 4 ° C durante várias semanas.</li>
	<li>Preparar o estradiol (E2) padrões por dissolução em pó E2 em etanol anidro e diluir para as concentrações adequadas de trabalho (227.5 nM &#38; 9.75 nM) em etanol a 50%. Nota: Se o estradiol é comprado como um frasco de 1 mg, adicione 1 mL de etanol diretamente para o frasco para dissolver o pó de estradiol. Isso resulta em um estoque de 3,67 mM #1.  Dilua 10 μL de estoque #1 em 990 etanol μL tornar-se 1 mL de caldo μM 36.71 #2.  Em seguida, dilua 10 μL de stock #2 em etanol a 50% 990 μL tornar-se 1 mL de caldo de nM 367.13 #3.  Para tornar o trabalho de estoques, dilua 619.7 estoque μL #3 em etanol a 50% μL 380.3 tornar-se 1 mL de 227.5 nM trabalho estoque usados para criar curvas padrão com fermento expressando ERα.  Dilua o estoque μL 26.56 #3, em etanol a 50% 973.44 μL tornar-se 1 mL de 9,75 nM trabalho estoque usados para criar curvas padrão com fermento expressando ERβ. Selo padrões com parafilm e loja -20-70 ° c. Cuidado: E2 é um suspeito cancerígeno e toxicidade reprodutiva. É prejudicial se inalado, ingerido ou absorvido pela pele. E2 pode causar danos para amamentar crianças e fetos. E2 é muito tóxico para a vida aquática. Usar proteção pessoal apropriada (luvas, coifa, máscara de pó) e evitar a exposição durante a gravidez e lactação. Descarte-E2 como resíduos perigosos e não liberam no meio ambiente.</li>
	<li>Prepare o buffer de LacZ misturando 8,52 g Na2HPO4, 5,52 g NaH2PO4•H2O, 95,21 mg MgCl2, mg 745,5 KCl, sal de sódio de 2 g N-lauroylsarcosine e ONPG (400 mg) ou CPRG (77,7 mg) em água desionizada para um final volume de 1 L. loja LacZ tampão em alíquotas de 20 mL a-20 ° C. Nota: Uma alíquota de 20 mL é suficiente para uma placa de 96 poços.</li>
	<li>Prepare o carbonato de sódio misturando 105,9 g de carbonato de sódio em água desionizada até um volume final de 1 L. loja no RT</li>
	<li>Prepare 1 M ditiotreitol (DTT) em água. Congelar 25 alíquotas µ l de TDT a-20 ° C. Cuidado: TDT é uma pele agudo e irritante para os olhos. Use equipamento de proteção pessoal apropriado (luvas, coifa, máscara de pó) para evitar a pele e olhos, inalação e ingestão. Nota: Cada alíquota é suficiente para uma placa de 96 poços.</li>
</ol>
2. preparar as amostras e controles de extração
<ol>
	<li>Selecione as amostras para testar. Nota: Este artigo apresenta dados para quinze PCP, incluindo sabonete, creme de cabelo, champô, protetor solar, protetor labial, Fundação, creme de barbear, unha polonês e loção.</li>
	<li>Combine 1 g da amostra com 10 mL de etanol anidro em um tubo cônico de 15 mL. Prepare um controle negativo extração consistindo de 11 mL de etanol em um tubo cônico de 15 mL. Prepare-se repetições conforme necessário. Nota: Para o projeto experimental apresentado, foram preparadas três alíquotas de todos os 15 PCP e soluções de controle de extração triplicado, rendendo um total de 48 amostras, cada uma delas foi analisada em triplicata, utilizando o protocolo na seção 4. Um prato único pode acomodar até 23 amostras em triplica. Etanol anidro é usado nesta etapa porque evapora facilmente. Use controles de extração negativo para verificar que os estrogênios não são lixiviação em amostras dos tubos cónicos.</li>
	<li>Homogeneizar o conteúdo do tubo por 30 min por uma combinação de agitação manual e num Vortex ou agitando os tubos em um tubo multi reaccional.</li>
	<li>Tubos de centrifuga cónicos na velocidade máxima permitida em uma centrífuga de balde de 10 min. decantar o sobrenadante de cada tubo através de um filtro de célula de 40 µm para um tubo cónico de 50 mL. Conteúdo vazio de cada tubo de 50 mL em um frasco de cintilação.</li>
	<li>Deixe os frascos abrir em um capuz ventilado por uma semana permitir que o álcool evapore completamente. Alternativamente, seca as amostras em uma campânula ventilada em atmosfera de azoto ou com um evaporador rotativo. Para evitar a degradação dos componentes sensíveis luz, protege amostras de secagem de luz (por exemplo, lugar de tecido opaco sobre porta de campânula ventilada).</li>
	<li>Reconstitua as amostras em 1,0 mL de etanol a 50% e o vórtice para homogeneizar.</li>
</ol>
3. cultivo e repicagem fermento14
<ol>
	<li>Manter as culturas de levedura ativa (estirpe recombinante W303a de S. cerevisiae14) incubando fermento em mídia de filtro-esterilizados glicose a 30 ° C. Fermento de subcultura semanalmente na mídia fresco glicose filtro esterilizado.</li>
	<li>Duas noites (cerca de 42 h) antes de preparar as placas Sim, subcultura levedura adicionando 0,1 mL de culturas de levedura ativa a 10 mL de mídia de filtro-esterilizados glicose utilizando uma técnica estéril.  Incube a 30 ° C por duas noites.  Tremendo não é necessário se levedura é crescida como culturas superficiais em estéril 250 mL Erlenmeyer frascos. Nota: Levedura também pode ser armazenado em placas de ágar refrigerado por vários meses. Para armazenamento a longo prazo (anos), aliam-se culturas O/N 15-50% de glicerol estéril, vórtice e congelar a-70 ° C. Para preparar o glicerol estéril, use uma seringa para transferir 300 glicerol µ l para uma cryovial e autoclave com a tampa soltada. Em seguida, adicione 1.200 cultura de levedura do / N µ l utilizando uma técnica estéril.</li>
</ol>
4. preparar placas Sim (dia 1 do ensaio)
<ol>
	<li>Em um recipiente estéril e utilizando uma técnica estéril, diluir o fermento da etapa 3.2 para uma densidade óptica de 0,065 ±0.005 em 610 nm (OD610) em mídia de filtro-esterilizados galactose.<ol>
		<li>Confirmar a densidade óptica por pipetagem 120 μL de cada amostra de levedura em triplicado juntamente com espaços em branco de galactose triplicado em uma placa de poliestireno clara (placa não precisa ser estéril).  Use um espectrofotómetro de placa para verificar se a cultura do fermento diluído tem um líquido OD610 de 0,065 ±0.005 OD610 subtrair leituras de espaços em branco de galactose de leituras de610 OD fermento para determinar líquido OD610 da levedura. Prepare um volume final de pelo menos 30 levedura mL diluido para cada placa de 96 poços. Nota: Filtros de espectrofotômetro medir a absorvância entre 595 e 610 nm podem ser usados para esta medição.</li></ol></li></ol>Uma aproximada rácio de 1:6 v: v de levedura: mídia normalmente produz uma OD610 perto 0.065, então comece adicionando fermento 4,5 mL para mídia de 30 mL e adicionar mais fermento ou mídia conforme apropriado para alcançar um netOD610 entre 0.060 e 0.070.
	
	
	<li>Utilizando uma técnica estéril, adicione esta suspensão de fermento diluído aos poços de uma estéril, polipropileno, microplacas de 96 poços, de acordo com o layout da placa (Figura 1). Durante a pipetagem, manter a fonte fermento suspendido por continuamente agitando o recipiente ou mistura com a pipeta. Para esta etapa, é útil usar uma pipeta de repetição com uma ponta de seringa estéril. Nota: As placas de polipropileno são esterilizadas por duas placas empilhadas autoclave embrulhadas em papel alumínio.  A placa superior serve como uma tampa para a placa da amostra pode ser re-esterilizado, lavados e reutilizados.</li>
	<li>Adicione mídia de filtro-esterilizados galactose 120 µ l 3 poços adicionais (H10 - 12) de acordo com o layout da placa (Figura 1). Esses poços servem como controles de mídia para contabilizar absorvância contribuída pela mídia sozinha.</li>
	<li>Construir uma curva padrão em cada placa diluindo serialmente triplica de padrões a E2 (227.5 nM para ERα, 9.75 nM para ERβ) em poços contendo a suspensão de levedura (A1 - G3), de acordo com o layout da placa (Figura 1).  Comece adicionando 5 µ l de E2 padrões para poços A1 a A3. Misturar o conteúdo de microplacas pipetando e em seguida serialmente diluir esta suspensão movendo µ l 205 de poços A1 - 3 para poços B1 - 3. Repetir a mistura e a transferência de 205 µ l por meio de linha G. Nota: Depois de concluída a diluição serial, descarte 205 μL de poços G1 - 3. No final desta etapa, todos os poços padrão devem conter 120 μL. A diluição serial renderá as concentrações finais de E2 listadas na tabela 1. Para as etapas de diluição serial, é útil usar uma pipeta multicanal com dicas estéril.</li>
	<li>Adicione 5 µ l de veículo (50% de etanol) para poços de controle do veículo que contém a suspensão de levedura (H1 - 3) de acordo com o layout da placa (Figura 1). Nota: Poços de controle do veículo são usados para quantificar a absorvância de fundo associada com mídia e células de levedura. Além disso, citotoxicidade ou crescimento promovendo efeitos de teste, as amostras podem ser detectadas, comparando os valores de610 OD de testar poços com aqueles dos poços de controle do veículo.</li>
	<li>Adicione 5 µ l triplica de amostras e controles negativos extração poços contendo a suspensão de levedura de acordo com o layout da placa (Figura 1). Nota: Tome nota de que amostras ou extração negativo controles são adicionados a cada poço.  Para controlar quais poços têm amostras e que não, começar com uma caixa de dicas e usar dicas dos mesmos locais na caixa como as localizações dos poços correspondentes na placa. Uma placa de 96 poços pode acomodar até 23 amostras em triplicata.</li>
	<li>Misture o conteúdo de amostra, controle de extração e poços de controle do veículo por pipetagem. Ajuste os volumes desses poços a 120 µ l removendo 205 µ l de cada um, conforme descrito na legenda para Figura 1.</li>
	<li>Sele as placas com um filme estéril, adesivo, porosa. Rotular as placas e incubar durante 17 h a 30 ° C. A placa não precisa ser sacudido durante a incubação</li>

5. processamento Sim placas (dia 2 do ensaio)
<ol>
	<li>Após a incubação h 17 a 30 ° C, retire as placas da incubadora. Se placas serão processadas imediatamente, prossiga para a etapa 5.1.1. Se placas serão processadas em uma data posterior, prossiga para o passo 5.1.2.<ol>
		<li>Usar uma pipeta multicanal para misturar o conteúdo de cada linha de poços e depois transferir 50 µ l de suspensão de levedura de cada poço para o correspondente bem de uma microplaca clara, poliestireno, 96 poços. Nota: Placas de poliestireno não precisa ser estéril, mas devem ter uma tampa. Use novas pontas de pipeta para cada linha de poços para evitar Cruz-contaminando poços, embora se pipetagem através de triplica com uma pipeta multicanal 8-ponta, dicas, só precisam ser alterado entre conjuntos de três vias.<ol>
			<li>Rotule a nova chapa. Siga para o passo 5.2.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Para armazenar as placas antes do processamento, embrulhe em filme plástico. Leve à geladeira embrulhadas placas a 4 ° C por 6 m. depois disso, retire as placas da geladeira, desembrulhá-los e transferir o conteúdo de todos os poços pipetando etapa 5.1.1. Siga para o passo 5.2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Adicione 20 µ l de 1m TDT para 20 mL de tampão de LacZ de temperatura descongelada, para uma concentração final de 1 mM DTT. Buffer de LacZ mistura bem. Se usando uma pipeta multicanal, dispensá-los em um reservatório de reagente. Cuidado: Use luvas e trabalhar com TDT em uma capa, se possível</li>
	<li>Usando qualquer uma pipeta multicanal ou repetindo a pipeta, adicione 200 µ l de tampão de LacZ contendo DTT e ONPG ou CPRG a todas as cavidades da placa de poliestireno e imediatamente medir e gravar o OD610 de todos os poços utilizando um Espectrofotômetro de placa. Repita conforme necessário para placas adicionais. Nota: As leituras de610 OD são usadas no denominador do cálculo LacZ (etapa 6.1). Por este motivo, obter as leituras imediatamente depois de pipetagem e antes de resolver as células ou lysed por buffer LacZ. Se valores de610 OD para poços de amostra são visivelmente superior ou inferior valores de610 OD para poços de controle do veículo, os extratos de amostra são promover o crescimento ou citotóxicos para levedura, respectivamente. O LacZ cálculo irá corrigir pequenas diferenças de densidades de célula através de poços, mas se exceder 30% em qualquer direção, então diluir a amostra de leite reconstituído (da etapa 2.6) em etanol a 50% adicionais e teste novamente a amostra, retornando para a etapa 3.2 12.</li>
	<li>Cobrir as placas com uma tampa. Incube as placas contendo levedura que ERα expresso14 a 30 ° C por 40 min (para ONPG) ou 3h (para CPRG). Incube as placas contendo levedura que expressa ERβ14 a 30 ° C para 70 min (ONPG) ou 4h (para CPRG). Nota: Quando se trabalha com CPRG, tempos de incubação são flexíveis; incubação de 2-4 h produz resultados adequados com ambos os receptores, com incubação do mais tempo, aumentando a sensibilidade do ensaio.</li>
	<li>Depois incubar as placas, use uma pipeta multicanal ou pipeta de repetição para adicionar 100 µ l de carbonato de sódio a cada poço. Carbonato de sódio eleva o pH e interrompe a reação de β-galactosidase.</li>
	<li>Medir e registar a OD405 (para ONPG) ou OD574 (para CPRG) de todos os poços utilizando um Espectrofotômetro de placa.</li>
</ol>
6.Cálculo dos valores LacZ
Nota: Valores de LacZ quantificar o grau de mudança de cor para cada amostra e oferecem um método normalizado de comparar valores entre ensaios separados pela contabilidade para diversas variáveis (por exemplo, densidade óptica de levedura, densidade óptica de mídia e incubação tempo se Isto difere entre poços no mesmo prato)12.
<ol>
	<li>Calcular significa dos valores de610 OD triplicadas para poços de controle de mídia (galactose) (H10-12) e calcular o meio de três vias OD405 ou valores de574 OD para veículo (50% de etanol) controles (H1-3). Usar esses meios e o tempo de incubação (t) em horas para a placa para alterar cor (passo 5.5) para calcular valores de LacZ (correspondente ao grau de mudança de cor em cada poço) para todos os padrões e amostra de poços utilizando as seguintes equações: 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/55754/55754eq1.jpg"> 
	<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/55754/55754eq2.jpg">
	<ol>
		<li>Como alternativa, use o aplicativo automatizado no Apêndice 1 para calcular valores de LacZ para padrões e amostras. Nota: O layout da placa usado com o aplicativo deve ser idêntico para o layout da placa apresentado na Figura 1. Se alguns poços da amostra não foram usados, reter as leituras de absorvância dos poços vazios como detentores de lugar no dataset absorvância sendo colado no Apêndice 1 aplicativo LacZ.  Isso preserva o layout espacial da placa no aplicativo e garante que os poços de controle de mídia estão em seu local necessário.  Além disso, o aplicativo não será executado se houver células vazias.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Calcule o meio de três vias LacZ valores para cada padrão de E2 e cada amostra. Relatório de valores médios de LacZ como µ l-1h-1. Log-transformar as concentrações de cada padrão de E2 e gerar um documento de planilha formatado como no arquivo template.csv (Apêndice 2).</li>
</ol>
7. interpolação amostra Estradiol equivalentes (EEQs) usando 4-parâmetro regressão logística
Nota: EEQs relacionar valores de LacZ de amostra (mudança de cor) para os valores de LacZ da curva padrão criado com E2. EEQs assim determinar quanto amostra é necessária para eliciar a mesma resposta de mudança de cor como uma concentração conhecida de E2.
<ol>
	<li>Para calcular EEQs para amostras de teste, primeiro traça a curva padrão. Ajuste os valores médios LacZ para padrões de E2 (eixo y) e log-transformadas E2 concentrações correspondentes (eixo x) para um modelo de regressão logística quatro-parâmetro.</li>
	<li>Use o modelo para interpolar EEQs para valores de LacZ de amostra de teste. Realizar cálculos de regressão logística de EEQs usando o software estatístico, conforme descrito no Apêndice 2.</li>
</ol>
8. padronização EEQs (ng/mL), a massa de amostra de PCP
<ol>
	<li>Para relacionar a quantidade de amostra de PCP adicionada ao EEQs cada um bem na etapa 4.5, multiplicar EEQ (ng/mL) pelo volume total chapeado em poços da amostra (325 µ l) e depois dividir pelo volume de amostra coletada adicionado a cada poço (5 µ l). Nota: Estes valores representam EEQ / mL da amostra coletada. Se as amostras foram preparadas usando 1 g de PCP, esses valores representam também EEQ por grama de PCP (ng/g). Expressa-se desta forma, valores EEQ (ng/g) podem ser comparados em diferentes valores de PCP. EEQ (ng/g) para os produtos de cuidados pessoais testados neste estudo são mostrados na tabela 2, e coletados em todo o protocolo inteiro de dados de exemplo estão incluídos no Apêndice 3.</li>
</ol>

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<li>Buller, C., Zang, X. P., Howard, E. W., Pento, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+beta-galactosidase+tissue+levels+in+a+tumor+cell+xenograft+model%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Find+Exp+Clin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Measurement of beta-galactosidase tissue levels in a tumor cell xenograft model.</a> Methods Find Exp Clin Pharmacol. 25 (9), 713-716 (2003).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O sim é um método de baixo custo usado para detectar ligantes estrogênicos em amostras ambientais, tais como água, comida, tecidos vegetais ou produtos de cuidados pessoais. Dados apresentados aqui comparar 2 receptores de estrógeno (ERα e ERβ), 2 substratos (ONPG e CPRG) e 2 cronogramas (2 d protocolo sem refrigeração) e protocolo de sete dias com refrigeração para medir estrogenicity em produtos de cuidados pessoais através do ensaio de Sim. A 7D, protocolo refrigerado usando CPRG e levedura expressando ERα e/ou ERβ melhor quantifica EEQs enquanto também compatível com as restrições de tempo impostas pelos cursos de graduação do laboratório que atendem apenas uma vez / semana por várias horas. Na verdade, comparado com o ensaio 2 d sem refrigeração, o ensaio de sete dias refrigerado foi associado com variância reduzida através de repetições de placa. Além disso, a parte linear da curva padrão foi ligeiramente ampliada para dados coletados usando o ensaio de refrigerados. A porção linear da curva padrão define a escala da deteção do ensaio e é a única parte da curva padrão que pode ser usada para interpolar EEQs amostra.
Em todos, mas uma das amostras testadas, EEQs medidos usando CPRG eram inferiores aos quantificado com ONPG. Com um maior coeficiente de extinção e baixa Km e Vmax, CPRG é dez vezes mais sensível que ONPG17. Assim, CPRG pode ser usado em concentrações inferiores e pode ser usado para detectar a menor quantidade de β-galactosidase. Por estas razões, CPRG é geralmente preferível ONPG18,19. No entanto, maior sensibilidade de substrato não explica os valores mais baixos de EEQ detectado com CPRG. Os valores mais elevados de EEQ detectados com ONPG poderiam ser devido à interferência de matriz com o ensaio, como foi observado por outros autores2,18. Pigmentos amarelos de extratos de produtos de cuidados pessoais podem inflar valores EEQ detectados com ONPG. Outros têm contornado esse problema, incluindo controles de pigmento em seu projeto experimental2, uma abordagem que dobra o número de placas em um experimento. Quando a interferência de matriz pode ser problemática, CPRG pode ser um substrato preferível para o ensaio de Sim, porém é mais caro e exige tempos de incubação mais do que de ONPG. Além disso, a mudança de cor induzida pela clivagem de substrato por β-galactosidase é mais dramática com CPRG, tornando mais fácil para os alunos a Visualizar resultados.
Miller et al . (2010), quem projetou o fermento utilizado no presente protocolo, observou aquele fermento expressando ERβ foram 30 x mais sensíveis ao 17 β-estradiol que fermento expressando ERα, uma conclusão fundamentada por nossos dados14. Além de nuances possíveis na construção do plasmídeo, Miller et al . (2010) não poderia explicar essa diferença de sensibilidade14. Uma diferença entre as duas construções de plasmídeo é que a expressão ERα é regulada pela galactose, enquanto expressão de ERβ é regulada por glicose ou galactose. O fermento utilizado no ensaio de Sim são cultivadas em meios de glicose e só dado galactose, quando eles são diluídos no início do ensaio. Portanto, levedura expressando ERβ pode acumular maior número de cópias das proteínas do receptor antes do início do ensaio, conferindo assim maior sensibilidade para ligantes estrogênicos.
A baixa sensibilidade de levedura ERα-expressando pode explicar as maiores taxas de não-detecção de estrogenicity em amostras medidos com ERα comparado com ERβ. Para aumentar a probabilidade de que a amostra EEQs será detectado, usuários poderiam empregar métodos e solventes de extracção diferentes ou adicionar mais elevados volumes de amostra para o fermento. Se maiores volumes de amostra são usados, as concentrações dos padrões E2 devem ser ajustadas de tal que o mesmo volume de amostras e padrões pode ser usado no ensaio. Uma limitação da adição de amostra mais é que o fermento pode tolerar apenas 6-10% de etanol, com melhor tolerância a temperaturas de incubação de 30 vs 35 ° C20. Para controlar para os efeitos do álcool na levedura, os investigadores devem adicionar triplicado "fermento apenas" poços para o layout da placa e confirmar que o OD610 desses poços "fermento apenas" é comparável do OD610 dos poços de controle do veículo imediatamente após a adição de buffer de LacZ. Alternativamente, as amostras em etanol podem ser adicionadas a placas de micropoços seco e o etanol evaporado fora antes de levedura são adicionados. Dimetilsulfóxido (DMSO) é também usado como um solvente da amostra em Sim ensaios, mas a concentração de trabalho final de DMSO com fermento deve ser limitada a 1%12.
O ensaio de Sim é uma ferramenta poderosa de triagem para detecção de estrogenicity em amostras ambientais. Especificamente, o Sim detecta ligandos que se ligam a receptores de estrogênio nuclear que interagir com elementos de resposta de estrogênio para direcionar a expressão de gene14. No entanto, o sim também tem limitações importantes. O sim não detecta EEs que funcionam através de mecanismos não-nucleares, tais como receptores de estrogênio de membrana ou mecanismos que envolvem elementos adicionais tais como fatores de transcrição de ativador da proteína 1 (AP-1). Além disso, porque o fermento não têm a mesma capacidade metabólica como células de mamíferos, o sim não consegue detectar ligantes que requerem ativação metabólica para ser estrogênicos.
Além disso, o ensaio é prontamente não pode diferenciar entre estrogênicas e anti-estrogênicas ligantes em amostras complexas. Em vez disso, mede estrogenicity líquido , que é o efeito de soma de ligantes estrogênicas e anti-estrogênicas. Para quantificar a concentração dos antagonistas de ER ou avaliar a atividade inibitória de misturas, o ensaio pode ser modificado por incubando a levedura com o agonista padrão (17 β-estradiol) e um intervalo de teste de amostra concentrações12. Este processo determina se antagonistas nas amostras podem diminuir a atividade de repórter induzida pelo agonista e fornece uma tela útil para identificar a presença de antagonistas de ER em amostras.
O protocolo apresentado aqui pode acomodar uma variedade de tipos de amostra, embora algumas amostras podem exigir modificações para as etapas de preparação de extração e amostra. Por exemplo, EEQs variadas amplamente entre repetições de alguns produtos de cuidados pessoais. As amostras mais variáveis tendem a conter gotículas de óleo, ou caso contrário não eram inteiramente homogêneas, indicando que um solvente mais lipofílico como éter dietílico seria útil. Alternativamente, óleos e cera em produtos de cuidados pessoais podem ser excluídas por extrair amostras com 50% de etanol em vez de 100% de etanol.Uma extração de etanol 50% também irá capturar mais ligantes estrogênicos solúvel em água (por exemplo, alguns pigmentos). No entanto, 50% etanol evapora mais lentamente do que o etanol 100% e assim pode estender o tempo de extração. Além disso, algumas amostras (tais como sabões) foram citotóxicas para levedura, resultando em medições de densidade celular reduzida (OD610). Fox et al . (2008) sugerem que tais amostras devem ser diluídas e retestadas se as diferenças de densidade celular excederem 30% em relação ao veículo controle poços12.
Se o ensaio de Sim é usado para fins de investigação analítica, curvas de diluição das piscinas de amostra podem ser testadas para determinar preventivamente volumes adequados de extrato para ser adicionado a levedura na etapa 4.5. Alternativamente, extractos podem ser testados simultaneamente em vários volumes (por exemplo, 5 µ l e 20 µ l extrato adicionado ao fermento na etapa 4.5) ou diluições que abrangem ordens de magnitude (por exemplo, 0,2 µ l, 2 µ l e 20 µ l). "Apropriados" volumes do extrato são aquelas que identificam estrogenicity combinando LacZ valores ao longo da parte linear da curva padrão. Otimização evita problemas causados pela adição de amostra demasiado ou demasiado pouco para o fermento, como citotoxicidade, falso-negativos ou estrogenicity que excede a curva padrão. Como mencionado acima, os volumes de amostras e padrões de E2 devem ser ajustados quando diferentes quantidades de ligante são utilizadas tal que fermento estão expostos a um volume consistente e concentração de etanol ou outro veículo através da placa.
Apesar do potencial para falsos negativos, o ensaio de Sim foi identificado como uma ferramenta de teste de nível 3 para os desreguladores endócrinos por Schug et al (2013), que desenvolveu um abrangente protocolo hierárquico para disrupção endócrina (TiPED)21. Para o ensino de graduação, o ensaio é valioso para o ensino de conceitos relacionados à disrupção endócrina, cultura celular, ligação ao receptor, atividade enzimática, engenharia genética, estatística e delineamento experimental. Os alunos que usam o ensaio também praticam habilidades fundamentais e amplamente aplicável laboratório tais como diluir serialmente padrões; extração de amostras; fazendo soluções; construir e interpolação curvas padrão; cálculo de concentração; fazendo soluções; demonstrando a técnica estéril; cultivo de células; identificação de variáveis e controles; coletar, organizar e analisar dados; construção e interpretação de gráficos; e utilizando equipamentos comuns de laboratório tais como micropipettors e espectrofotômetros.

A tela de estrogênio de levedura (Sim) é amplamente utilizado para quantificar ligantes que imitam o estradiol (E2 ou 17 β-estradiol) em uma variedade de matrizes, incluindo água, tecidos vegetais, produtos de consumo e alimentos1,2,3, 4. Coletivamente, esses ligantes são denominados "Estrogênios ambientais (EEs)." O sim foi originalmente desenvolvido como um baixo custo, em vitro alternativa para testes in vivo como o roedor uterotrophic ensaio5,6 e a truta de arco-íris alimentação ensaio7. O objectivo destes testes é para determinar se um produto contém substâncias químicas que estimulam ou bloqueiam os mecanismos dependentes de estrogênio. Detecção de EEs é crítica, porque eles podem interferir com o normal estrógeno endógeno, sinalização, particularmente durante o desenvolvimento fetal. Esta interferência compromete a saúde, aumentando o risco de obesidade, infertilidade, câncer e perda cognitiva8.
Apesar da importância da EEE e outras CDE para a saúde pública, endócrina não é comumente incluída nos currículos de graduação. Essa deficiência é em parte devido a uma escassez de actividades que ilustram os princípios envolvida estando também acessível para estudantes de graduação. Além disso, diversas variações do protocolo Sim existem9,10,11,12,13, e essa diversidade faz ensaio otimização demorado para coordenadores de laboratório não especificamente treinados nas técnicas relevantes. Finalmente, sim ensaios são geralmente completou mais de 1 dia ou 2 dias consecutivos, com uma incubação O/N. Neste momento não é compatível com o formato dos cursos de graduação do laboratório, que normalmente satisfazem uma vez / semana por várias horas.
Em resposta a essas necessidades, este manuscrito relata um protocolo otimizado de Sim 96 poços que inclui métodos de extração de etanol para produtos de higiene pessoal (PCP)3 e uma etapa de refrigeração de 6 dias para acomodar reuniões semanais de laboratório. Etanol absoluto é um solvente orgânico versátil que pode dissolver uma variedade de solutos polares e apolares. Além disso, é apropriado para cursos de graduação, porque é prontamente disponível, relativamente não tóxico, acessível e miscível com a água; também evapora facilmente sem equipamentos especiais. No entanto, o etanol não é ideal para extrair fortemente hidrofóbicos desreguladores endócrinos ou muitos óleos e ceras, os dois últimos sendo ingredientes comuns em PCP. eficiência de extração pobre aumenta o risco de resultados negativos falsos. Com essa restrição em mente, investigadores devem escolher procedimentos de extração (por exemplo, extração etanólica ou extração de fase sólida) esse endereço amostra características e objetivos do estudo (pesquisa contra graduação instrução).
O Sim depende recombinante Saccharomyces cerevisiae , originalmente criado por Dr. Charles Miller, na Universidade de Tulane. Por favor veja Miller et al (2010) para um mapa completo do plasmídeo engenharia14. Fermento transformado com estes plasmídeos constitutivamente expressa humana ERα nuclear ou ERβ (também chamado ESR1 e ESR2, respectivamente) quando cultivadas em meios contendo galactose (para ERα) ou glicose ou galactose (para ERβ). Se produtos químicos estrogênicos estão presentes na mídia, eles se ligam aos receptores, criando complexos ligante-receptor que ativam a expressão de β-galactosidase (lacZ) a um nível proporcional à concentração de químicos estrogênicos. Células de levedura lysed então para liberar a β-galactosidase acumulada. A Lise contém ONPG ou CPRG, que são clivados por β-galactosidase para produzir produtos de amarelos ou vermelhos, respectivamente. Produtos colorimétricos podem ser quantificados, medindo a absorbância usando um Espectrofotômetro de placa de micropoços. O grau de mudança de cor é proporcional à concentração de ligantes estrogênicos, aos quais o fermento foi exposto.
A escolha do substrato (CPRG ou ONPG) varia de acordo com o potencial de absorvância fundo decorrentes as amostras sendo testadas. Por exemplo, extratos de plantas muitas vezes irão adicionar uma tonalidade amarela para a mídia que infla artificialmente medidas estrogenicity se ONPG (quantificado em 405 nm) é usado como substrato para a β-galactosidase. Com extractos vegetais, CPRG (quantificado em 574 nm) pode ser um substrato colorimétrico mais apropriado. CPRG é mais caro que ONPG mas é usado em um décimo a molaridade. Este artigo apresenta estrogenicities de PCP extratos quantificados usando ONPG e CPRG.
Quantificar estrogenicity de amostras ambientais usando ERα e ERβ é uma abordagem mais abrangente do que usando apenas um destes receptores. Em animais, estes receptores apresentam distribuição tecidual diferencial, actividades regulamentares e afinidades de ligação por ligantes estrogênicas e anti-estrogênicas15. Por exemplo, fitoestrogênios à base de plantas tipicamente bind ERβ mais fortemente2, Considerando que os produtos químicos sintéticos podem mostrar preferência por ERα ou ERβ ou podem ligar os dois receptores igualmente bem15. Por conseguinte, ligação ao receptor de estrogênio de uma não necessariamente prever vinculação ao outro.
Embora EEs são encontrados em muitos produtos de consumo (por exemplo, pesticidas, detergentes, adesivos, lubrificantes, plásticos, alimentos e produtos farmacêuticos), assim como as plantas, os dados apresentados foram obtidos usando uma seleção de PCP. PCP é convincentes, prontamente disponível, orçamento-friendly e ambientalmente relevantes para alunos de graduação. Os alunos podem ser convidados a trazer seus favoritos PCP de casa para testar no laboratório. Eles também podem procurar o banco de dados Skin Deep desenvolvido pelo grupo de trabalho ambiental16 para gerar comparações orientado a hipótese de PCP com alta e baixa partituras de toxicidade. Desta forma, os alunos podem simultaneamente desenvolver habilidades de laboratório avançado; envolver-se na aprendizagem auto-dirigida, baseada em inquérito; e explorar questões emergentes em ciências ambientais e saúde.

<table><tbody><tr><td><forte>Equipamento</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Misturador de vórtice (para tubos únicos ou múltiplos)</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>02-215-365</td><td>Qualquer misturador será suficiente.</td></tr><tr><td>Centrífuga de balde</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>75-063-839</td><td>Qualquer centrífuga de balde será suficiente se for capaz de centrifugar tubos cônicos a 4000 rpm.</td></tr><tr><td>Bico de Bunsen</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>17-012-823</td><td>Qualquer bico de Bunsen será suficiente, ou um queimador de álcool (Fisher Scientific 04-245-1) pode ser usado.</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>50125590H</td><td>Qualquer incubadora será suficiente se for capaz de manter 30 °C.</td></tr><tr><td>Leitor de microplacas</td><td>BioTek (www.biotek.com)</td><td>EPOCH2</td><td>Uma marca diferente de leitor de placas será suficiente se puder medir a absorbância em comprimentos de onda de 405, 574 e 610 nm.</td></tr><tr><td>Software de leitor e gerador de imagens de microplacas Gen5</td><td>Software BioTek (www.biotek.com)</td><td>GEN5</td><td>necessário depende da marca e modelo do leitor de placas; O software GEN5 destina-se ao uso com o leitor de placas BioTek.</td></tr><tr><td>Geladeira</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>05LREEFSA</td><td>Qualquer geladeira será suficiente se for capaz de manter 4 °C.</td></tr><tr><td>Pipetador ou PipetAid compatível com pipetas sorológicas de 1 a 10 mL</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>13-681-15E</td><td>Quaisquer pipetadores serão suficientes se forem compatíveis com pipetas sorológicas de 1 e 10 mL.</td></tr><tr><td>Micropipetador P10</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>F144562G</td><td>Qualquer micropipetador será suficiente se for capaz de dispensar 5 μl.</td></tr><tr><td>Micropipetador P200</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>F144565G</td><td>Qualquer micropipetador será suficiente se for capaz de dispensar até 200 μl.</td></tr><tr><td>Pipetador multicanal P300</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>FBE1200300</td><td>Qualquer pipetador multicanal será suficiente se for capaz de dispensar 50 - 205 μl.</td></tr><tr><td>Pipetador de repetição</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>F164001G</td><td>Deve ser capaz de entregar 100 - 320 &micro; l; Esse pipetador é opcional porque um pipetador multicanal pode ser usado.</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Suprimentos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos cônicos estéreis de 15 mL com tampas</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>05-539-801</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de cintilação de vidro</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>03-337-4</td><td></td></tr><tr><td>Microplacas de Poliestireno 96-poço, fundo plano com tampa (não estéril)</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>12565501</td><td></td></tr><tr><td>Polipropileno 96-poço, microplacas de fundo plano sem tampa&nbsp;</td><td>Cole-Parmer (www.coleparmer.com)</td><td>EW-01728-81</td><td></td></tr><tr><td>Copos de vidro de 100 mL</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>02-539H</td><td>Qualquer copo de vidro será suficiente se for autoclavável.</td></tr><tr><td>Balões de vidro Erlenmeyer de 250 mL</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>FB500250</td><td>Qualquer frasco de vidro Erlenmeyer será suficiente se for autoclavável.</td></tr><tr><td>Filme estéril, adesivo, poroso&nbsp;</td><td>VWR (www.vwr.com)</td><td>60941-086</td><td></td></tr><tr><td>Pinça metálica</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>12-000-157</td><td>Qualquer pinça metálica é suficiente.</td></tr><tr><td>Reservatório de reagente</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>07-200-127</td><td></td></tr><tr><td>Unidades de filtração (0.2 &micro; m)</td> <td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td> <td>09-761-52</td><td></td></tr><tr><td>Garrafa de esguicho (para etanol)</td> <td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td> <td>02-897-10</td><td>Qualquer garrafa de esguicho de laboratório será suficiente.</td></tr><tr><td>Garrafas de armazenamento autoclaváveis</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>06-414-1D</td><td>Qualquer garrafa de armazenamento de vidro autoclavável será suficiente.</td></tr><tr><td>Pipetas sorológicas de vidro de 10 mL (estéreis)</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>13-678-27F</td><td>Qualquer pipetas sorológicas de vidro será suficiente.</td></tr><tr><td>1 mL de pipetas sorológicas de vidro (estéreis)</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>13-678-27C</td><td>Qualquer pipetas sorológicas de vidro será suficiente.</td></tr><tr><td>Pontas de micropipetador P10</td><td>USA Scientific (www.usascientific.com)</td><td>1120-3810</td><td>Quaisquer pontas serão suficientes se forem compatíveis com o micropipetador acima.</td></tr><tr><td>Pontas de micropipetador P200</td><td>USA Scientific (www.usascientific.com)</td><td>1120-8810</td><td>Qualquer dica será suficiente se for compatível com o micropipetador acima.</td></tr><tr><td>Pontas de micropipetador P300</td><td>USA Scientific (www.usascientific.com)</td><td>1120-9810</td><td>Quaisquer pontas serão suficientes se forem compatíveis com o micropipetador acima.</td></tr><tr><td>Pontas de seringa para pipetador de repetição</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>F164150G</td><td>Necessário apenas se for usado um pipetador de repetição.</td></tr><tr><td>Placas de Petri estéreis</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>FB0875712</td><td>Qualquer placa de Petri estéril será suficiente.</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>S37440</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Yeast&nbsp; Cepas </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saccharomyces cerevisiae que não possuem o produto do gene TRP1 (e.g., W303a)</td><td>American Type Culture Company (ATCC) (www.ATCC.org)</td><td>MYA-151</td><td>Levedura recombinante também estão disponíveis mediante solicitação dos autores.</td></tr><tr><td>Plasmídeo receptor/repórter para ER&alfa;</td><td>Addgene (www.addgene.org)</td><td>pRR-ERalpha-5Z (Plasmídeo #23061)&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Plasmídeo receptor/repórter para ER&beta;</td><td>Addgene (www.addgene.org)</td><td>pRR-ERbeta-5Z (Plasmídeo #23062)&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Difco agar</td><td>BD (www.bd.com)</td><td>214530</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>D0632</td><td>CUIDADO:&nbsp; O ditiotreitol é um irritante agudo para a pele e os olhos. Use equipamento de proteção individual adequado (luvas, exaustor, máscara contra poeira) para evitar contato com a pele e os olhos, inalação e ingestão.</td></tr><tr><td>Orto-nitrofenil-&beta;-D-galactopiranosídeo</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>N1127</td><td></td></tr><tr><td>Vermelho de clorofenol-&beta;-D-galactopiranosídeo</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>10884308001</td><td></td></tr><tr><td>Base de nitrogênio de levedura</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>Y0626</td><td></td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Galactose</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td> <td>G5388</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de adenina</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td> <td>A9126</td><td></td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td> <td>U0750</td><td></td></tr><tr><td>Leucina</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td> <td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>Histidina</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td> <td>H8000</td><td></td></tr><tr><td>17 &beta; -Estradiol & nbsp;</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; MP Biomedicals&nbsp;</td><td>E8875-250 mg&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 0219456401 - 1 mg</td><td>CUIDADO:&nbsp; O estradiol é suspeito de ser cancerígeno e tóxico para a reprodução. É prejudicial se inalado, ingerido ou absorvido pela pele.&nbsp; O estradiol pode causar danos a crianças amamentadas e fetos. O estradiol é muito tóxico para a vida aquática. Use proteção individual adequada (luvas, exaustor, máscara contra poeira) e evite a exposição durante a gravidez e lactação. O estradiol deve ser descartado como resíduo perigoso e não liberado no meio ambiente.</td></tr><tr><td>100% etanol</td><td>Pharmco-Aaper (www.pharmcoaaper.com)</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio monobásico monohidratado</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico (anidro)</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>S0876</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto</td> <td>de potássioSigma (www.sigmaaldrich.com)</td> <td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Sarkosyl (sal de sódio N-lauroylsarcosina)</td> <td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td> <td>L5125</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato de sódio</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td> <td>S7795</td><td></td></tr> <tr><td> Nome</td> <td> Empresa </td> <td> Número de catálogo </td> <td> Comentários </td></tr><tr><td><software>forte</software de planilha forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft&nbsp;</td><td></td><td>O Excel é um software de planilha conveniente para gerenciar saídas de dados e gerar arquivos .csv para análise R.</td></tr><tr><td>Software Java (necessário para o aplicativo do Apêndice 1)&nbsp;</td><td>Oracle Corporation</td><td></td><td>Para calcular os valores LacZ usando o aplicativo no Apêndice 1, primeiro baixe o software Java gratuito (https://www.java.com/en/download/) e, em seguida, abra o aplicativo LacZ no Apêndice 1. Os resultados do LacZ criados pelo aplicativo podem ser copiados pressionando "control (ctrl) + c" nos teclados do PC ou "command + c" nos teclados do Mac.</td></tr><tr><td>O software estatístico JMP versão 13.0.0</td><td>SAS Institute</td><td></td><td>Apêndice 2 inclui instruções sobre como usar o JMP para ajustar os dados LacZ a uma curva de regressão logística de quatro parâmetros. A curva é usada para interpolar os equivalentes de estradiol (EEQs) da amostra de teste, em relação à curva padrão de estradiol.</td></tr><tr><td>Software gráfico e de computação estatística R</td><td>Foundation</td><td></td><td>O software R gratuito pode ser baixado do https://www.r-project.org/.&nbsp; As instruções e o código para usar R para ajustar os dados LacZ a uma curva de regressão logística de quatro parâmetros são fornecidos no Apêndice 2.</td></tr></tbody></table>

detecção de ligantes estrogênicos em produtos de cuidados pessoais, usando uma tela de estrogênio de levedura otimizado para o laboratório de ensino de graduação

Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory

A tela de estrogênio de levedura (Sim) é usado para detectar ligantes estrogênicos em amostras ambientais e tem sido amplamente aplicada em estudos de disrupção endócrina. Estrogênicos ligantes incluem tanto natural como artificial "ambiental estrógenos" (EEs) encontrado em muitos bens de consumo, incluindo alimentos, plásticos, pesticidas e produtos de cuidados pessoais (PCP). EEE perturbar hormônio sinalização em seres humanos e outros animais, potencialmente reduzindo a fertilidade e aumentar o risco de doença. Apesar da importância da EEs e outros endócrino perturbar químicos (CDE) para a saúde pública, endócrina não está normalmente incluída em currículos de graduação. Esta lacuna é em parte devido à falta de atividades de laboratório pertinente que ilustram os princípios envolvida estando também acessível para estudantes de graduação. Este artigo apresenta um otimizado Sim para quantificação dos ligands em produtos de cuidados pessoais que ligam alfa de receptores de estrógeno (ERα) e/ou beta (ERβ). O método incorpora um dos dois substratos colorimétricos (orto- nitrofenil-β-D-galactopyranoside (ONPG) ou clorofenol vermelho-β-D-galactopyranoside (CPRG)) que são clivados por β-galactosidase, uma incubação refrigerada 6 dias passo para facilita a utilização em cursos de graduação do laboratório, uma aplicação automatizada para cálculos de LacZ e código R para a análise de regressão logística de 4 parâmetros associados. O protocolo foi projetado para permitir que os alunos de graduação, desenvolver e conduzir experimentos nos quais eles tela produtos de sua escolha para estrogênio imita. No processo, eles aprendem sobre endócrina, cultura celular, ligação ao receptor, atividade enzimática, engenharia genética, estatística e delineamento experimental. Simultaneamente, também praticam as habilidades fundamentais e amplamente aplicável de laboratório, tais como: cálculo de concentração; fazendo soluções; demonstrando a técnica estéril; diluição em série normas; construir e interpolação curvas padrão; identificação de variáveis e controles; coletar, organizar e analisar dados; construção e interpretação de gráficos; e utilizando equipamentos comuns de laboratório tais como micropipettors e espectrofotômetros. Assim, implementar este ensaio incentiva os alunos a se envolver em aprendizagem baseada em inquérito enquanto explora questões emergentes em ciências ambientais e saúde.

Este artigo apresenta uma tela de estrogênio fermento otimizado para quantificação dos ligands em produtos de cuidados pessoais (PCP) que ligam alfa de receptores de estrógeno (ERα) e/ou beta (ERβ). O método incorpora duas opções de substrato colorimétrico, uma seis dias incubação refrigerada para uso em cursos de graduação e ferramentas estatísticas para análise de dados.

Detecção de ligantes estrogênicos em produtos de cuidados pessoais, usando uma tela de estrogênio de levedura otimizado para o laboratório de ensino de graduação

The Yeast Estrogen Screen (YES) is used to detect estrogenic ligands in environmental samples and has been broadly applied in studies of endocrine ...

O objetivo geral deste procedimento é utilizar um teste de triagem de estrogênio em levedura para quantificar agonistas do receptor de estrogênio humano extraídos de produtos de cuidados pessoais. Este método pode ajudar a responder perguntas importantes na área de toxicologia, perturbação endócrina e ecofisiologia, pois detecta e quantifica estrogênios ambientais em água, alimentos e produtos de cuidados pessoais. As principais vantagens desta técnica in vitro são seu baixo custo, uso amplamente difundido e a oferta de uma excelente plataforma para o ensino de habilidades técnicas laboratoriais.A detecção de estrogênios ambientais é essencial porque eles podem alterar a sinalização hormonal, especialmente durante o desenvolvimento fetal e períodos de transição fisiológica, como a puberdade. As partes mais difíceis deste método são os cálculos e a análise de dados, que simplificamos ao desenvolver uma aplicação de fácil uso. Além disso, a pipetagem precisa é essencial.Este protocolo começa com o preparo dos reagentes. Prepare os meios de glicose e galactose, controles de veículo com etanol 50%, e padrões de estradiol que serão utilizados no primeiro dia do ensaio, bem como tampão LacZ, ditiotreitol e carbonato de sódio para o segundo dia. Esterilize os meios de glicose e galactose por filtração através de um filtro de 0,2 micrômetro.Até 23 produtos de cuidados pessoais diferentes ou PCPs e controles de extração podem ser testados em triplicata em uma única placa de 96 poços. Os PCPs incluem sabonetes, cremes para cabelo, xampus, protetores solares, maquiagens, espumas de barbear e loções. Para fins de filmagem, as amostras serão preparadas a partir de apenas oito PCPs.Combine um grama de cada amostra com 10 mililitros de etanol anidro em um tubo cônico de 15 mililitros. Além disso, prepare um controle negativo de extração consistindo em 11 mililitros de etanol anidro em um tubo cônico de 15 mililitros. Homogeneíze o conteúdo de cada tubo cônico durante 30 minutos por meio de agitação manual combinada com vortex.Centrifugue os tubos cônicos na velocidade máxima permitida em uma centrífuga de rotor pendular durante 10 minutos. Decante o sobrenadante de cada tubo através de um filtro celular de 40 micrômetros para um tubo cônico de 50 mililitros. Em seguida, transfira o conteúdo de cada tubo de 50 mililitros para um frasco de vidro para cintilação.Deixe o etanol evaporar completamente deixando os frascos abertos em uma cabine ventilada durante uma semana. Proteja as amostras em secagem da luz para evitar a degradação de constituintes sensíveis à luz. Quando as amostras estiverem secas, reconstitua cada amostra em um mililitro de etanol a 50% e, em seguida, vortexe para homogeneizar.Duas noites ou cerca de 42 horas antes de preparar as placas do ensaio de estrogênio em levedura ou placas YES, utilize técnica estéril para subcultivar a levedura, adicionando 0,1 mililitro de cada cultura ativa de levedura a 10 mililitros de meio de glicose esterilizado por filtração em um frasco Erlenmeyer estéril. Incube a 30 °C e continue a incubar as culturas originais como estoques. Dois dias depois, no primeiro dia do ensaio YES, utilize técnica estéril para diluir as culturas de levedura suspensas e o meio de galactose esterilizado por filtração em um béquer estéril.Confirme a densidade óptica pipetando 120 microlitros de cada amostra de levedura em triplicata, juntamente com meios de galactose em branco em triplicata, em uma placa de poliestireno transparente. Utilize um espectrofotômetro de placa para verificar se o cultivo de levedura diluído apresenta uma densidade óptica líquida de 0,065 ± 0,005 em um comprimento de onda de 610 nanômetros. Determine a OD610 líquida da levedura subtraindo a OD610 dos brancos de meio de galactose.Usando uma pipeta repetidora com uma ponteira de seringa estéril, adicione a suspensão de levedura diluída aos poços de uma placa microplaqueta estéril de polipropileno de 96 poços de acordo com este esquema da placa. Durante a pipetagem, mantenha a suspensão de levedura homogênea agitando continuamente o béquer ou misturando com a pipeta. Por fim, adicione 120 microlitros de meio de galactose esterilizado por filtração aos poços H10 a H12, indicados em verde no esquema da placa, para servir como controles de meio que levarão em conta os absorventes provenientes apenas do meio.Prepare placas separadas para cada combinação de linhagem de levedura e substrato calorimétrico que será testada. Em seguida, construa uma curva padrão em cada placa por meio de diluição seriada de acordo com o esquema da placa. Utilize uma pipeta de canal único com ponteiras estéreis para adicionar cinco microlitros de padrão de estradiol aos poços A2, A2 e A3. Use uma pipeta multicanal para misturar o conteúdo dos poços por pipetagem e, em seguida, transfira 205 microlitros dos poços A1 a A3 para os poços B1 a B3. Repita a transferência de 205 microlitros até a linha G. Após a conclusão da diluição seriada, descarte 205 microlitros dos poços G1 a G3. Ao final desta etapa, todos os poços padrão devem conter 120 microlitros.Adicione cinco microlitros de etanol a 50% a cada poço do controle de veículo contendo a suspensão de levedura, poços H1, H2 e H3, indicados em azul neste esquema da placa. O próximo passo é adicionar alíquotas de cinco microlitros em triplicata das amostras ou controles negativos de extração aos poços contendo a suspensão de levedura, indicados em roxo no esquema da placa. Anote quais amostras ou controles de extração são colocados em quais poços.Para acompanhar quais poços contêm amostras e quais não contêm, comece com uma caixa nova de ponteiras e use ponteiras das mesmas posições na caixa correspondentes às posições dos poços na placa. Misture o conteúdo dos poços da amostra, controle de extração e controle de veículo por pipetagem. Ajuste os volumes desses poços para 120 microlitros removendo 205 microlitros de cada um.Selar cada placa com um filme poroso adesivo estéril, rotular e incubar a 30 graus Celsius por 17 horas. Após a incubação de 17 horas, retirar as placas do incubador. Caso as placas não possam ser processadas imediatamente, envolvê-las com filme plástico e refrigerar as placas envolvidas a quatro graus Celsius por seis dias.Quando estiver pronto para processar as placas, remova o envoltório. Use um pipetador multicanal para misturar o conteúdo de cada linha de poços e, em seguida, transfira 50 microlitros da suspensão de levedura de cada poço para o poço correspondente de uma microplaca de 96 poços de poliestireno transparente. Identifique a nova placa.Para evitar a contaminação cruzada entre poços, use ponteiras novas para cada poço, mas as ponteiras não precisam ser estéreis. Em uma cabine de segurança, adicione 20 microlitros de DTT a um molar a 20 mililitros de tampão LacZ descongelado e em temperatura ambiente, obtendo uma concentração final de um milimolar de DTT. Misture bem o tampão LacZ.Usando uma pipeta repetidora, adicione 200 microlitros de tampão LacZ contendo DTT e ONPG ou CPRG a todas as cavidades da placa de poliestireno e, imediatamente, meça e registre a densidade óptica a 610 nanômetros de todas as cavidades utilizando um leitor de placas. Repita conforme necessário para placas adicionais. Cubra as placas com tampa e incube-as a 30 graus Celsius pelos tempos indicados.Quando a incubação estiver concluída, retire as placas do incubador. Utilize uma pipeta repetidora para adicionar 100 microlitros de carbonato de sódio a cada poço, a fim de interromper a reação de beta-galactosidase. Meça e registre a densidade óptica a 405 nanômetros para ONPG ou a 574 nanômetros para CPRG de todos os poços, utilizando um espectrofotômetro de placa.O cálculo dos valores de LacZ pode ser realizado usando um aplicativo automatizado que exige a instalação do Java. Para começar, abra o aplicativo automatizado de LacZ descrito no apêndice um. Cole as leituras de densidade óptica em 405 nanômetros para ONPG ou em 574 nanômetros para CPRG de todas as poças, utilizando um layout de placa idêntico ao mostrado na figura um.Insira o tempo de incubação e as horas para o ensaio desenvolver cor e clique em Avançar. Cole as leituras de densidade óptica em 610 nanômetros para todas as poças. Clique em Enviar para exibir os resultados de LacZ.Os resultados de LacZ podem ser copiados usando comandos do teclado e colados em uma planilha ou outros arquivos conforme necessário. Inicie esta análise abrindo a aplicação online de análise de dados do ensaio YES. Faça o upload de um arquivo de dados CSV formatado conforme descrito na primeira guia.Digitalize a curva padrão de estradiol na segunda guia e estime os parâmetros de regressão. Visualize os resultados do modelo de regressão na terceira guia e, em seguida, localize os valores interpolados no eixo x correspondentes aos valores de LacZ das amostras na quarta guia. Clique na quinta guia para visualizar os valores de equivalente de estrogênio (EEQ) das amostras.Por fim, padronize os valores de EEQ à massa original da amostra conforme descrito no protocolo textual. São apresentados exemplos de curvas padrão após uma incubação de 17 horas de levedura com 17 beta-estradiol. Pelas razões discutidas no manuscrito, o CPRG é frequentemente uma escolha de substrato melhor do que o ONPG.Conforme observações anteriores, os ensaios com levedura que expressava ER Beta foram mais de uma ordem de grandeza mais sensíveis do que os ensaios com levedura que expressava ER Alpha. Por isso, a atividade estrogênica foi detectada com maior frequência na levedura que expressava ER Beta. Um objetivo adicional do estudo foi testar durações de incubação compatíveis com a programação de um curso laboratorial de graduação.Quando foi introduzido um período de refrigeração de seis dias após a incubação de 17 horas, as curvas padrão obtidas a partir das placas refrigeradas foram comparáveis às das placas não refrigeradas. Os erros padrão dos parâmetros estimados por meio de modelos de regressão logística de quatro parâmetros foram todos menores para as placas refrigeradas do que para as não refrigeradas. Assim, o armazenamento refrigerado das placas por seis dias reduz o erro e melhora a precisão das estimativas de EEQ.Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em duas a três ou quatro sessões. Ao realizar o procedimento, é importante lembrar-se de empregar técnica estéril em todas as etapas realizadas antes do período de incubação de 17 horas, de pipetar com cuidado e precisão, e de seguir o esquema da placa apresentado na figura um. Após este procedimento, outros métodos, como ensaios em animais in vivo, podem ser realizados para investigar mecanismos adicionais de ação estrogênica e efeitos em organismos inteiros.Após seu desenvolvimento, o teste de triagem de estrogênio em levedura passou a ser aceito como uma medida de baixo custo para detectar ligantes estrogênicos em amostras ambientais, como alimentos, tecidos vegetais e produtos de cuidados pessoais. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar extrações simples de produtos de cuidados pessoais, cultivar leveduras, preparar curvas de diluição padrão, executar o ensaio YES em uma placa de 96 poços e concluir os cálculos associados. E não se esqueça de que o trabalho com estradiol pode ser extremamente perigoso, e precauções, como o uso de luvas e outros equipamentos de proteção individual, bem como a garantia de descarte adequado, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo descreve um ensaio repórter baseado em células para determinar a atividade estrogênica de compostos derivados de plantas. Um composto com atividade semelhante ao estrogênio imita sua ligação aos receptores de estrogênio e impulsiona a transcrição do gene da enzima repórter a jusante. A enzima repórter gera bioluminescência em uma reação, indicando a atividade estrogênica do composto.

Ensaio de atividade do receptor-repórter de estrogênio para rastrear a atividade estrogênica do fitoestrogênio

Desreguladores endócrinos (EDC) representam um risco significativo para o ambiente aquático. plantas municipais de tratamento de esgoto são grandes contribuintes para a potência estrogênica das águas superficiais. A metodologia prevista neste artigo permite uma avaliação da eficácia e adequação dos processos de tratamento de águas residuais em relação à remoção de EDC.

O uso de uma bateria de métodos químicos e ecotoxicológicos para a avaliação da eficácia dos Processos de Tratamento de Águas Residuais remover estrogénica Potência

Um protocolo para rastrear a atividade endócrina em extratos orgânicos de amostras de água, incluindo efluentes de águas residuais tratadas e águas superficiais (receptoras), foi adaptado usando bioensaios de transativação in vitro com prisão por divisão ("congelamento e descongelamento") disponíveis comercialmente.

Triagem para Endocrine Atividade em Água Utilizando disponíveis comercialmente<em&gt; In Vitro</em&gt; Transativação Bioensaios

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Detectando a actividade de dimerização de domínio ligante-ligação do Receptor de estrogênio alfa usando o ensaio dos mamíferos do dois-híbrido

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Microvolume amostras são quantificados por um sistema de espectrofotômetro que utiliza tensão superficial natural para manter as amostras sem o uso de tinas ou capilares. A gama dinâmica das concentrações de proteína e velocidade, que pode ser medido aumentam consideravelmente com este método.

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Cuidados e manutenção regular de um peixe-zebra (<em&gt; Danio rerio</em&gt;) Laboratório: Uma Introdução

Aprenda a usar uma tela de estrogênio de levedura otimizada para quantificar atividade estrogênica em produtos de cuidados pessoal. Este método ensina habilidades laboratoriais essenciais em toxicologia e disrupção endócrina.

Detecção de ligantes estrogênicos em produtos de cuidados pessoal usando uma tela de estrogênio de levedura otimizada para o laboratório de ensino de graduação (Vídeo) | JoVE Journal

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