Detecção de ligantes estrogênicos em produtos de cuidados pessoais, usando uma tela de estrogênio de levedura otimizado para o laboratório de ensino de graduação

O objetivo geral deste procedimento é utilizar um teste de triagem de estrogênio em levedura para quantificar agonistas do receptor de estrogênio humano extraídos de produtos de cuidados pessoais. Este método pode ajudar a responder perguntas importantes na área de toxicologia, perturbação endócrina e ecofisiologia, pois detecta e quantifica estrogênios ambientais em água, alimentos e produtos de cuidados pessoais. As principais vantagens desta técnica in vitro são seu baixo custo, uso amplamente difundido e a oferta de uma excelente plataforma para o ensino de habilidades técnicas laboratoriais.

A detecção de estrogênios ambientais é essencial porque eles podem alterar a sinalização hormonal, especialmente durante o desenvolvimento fetal e períodos de transição fisiológica, como a puberdade. As partes mais difíceis deste método são os cálculos e a análise de dados, que simplificamos ao desenvolver uma aplicação de fácil uso. Além disso, a pipetagem precisa é essencial.

Este protocolo começa com o preparo dos reagentes. Prepare os meios de glicose e galactose, controles de veículo com etanol 50%, e padrões de estradiol que serão utilizados no primeiro dia do ensaio, bem como tampão LacZ, ditiotreitol e carbonato de sódio para o segundo dia. Esterilize os meios de glicose e galactose por filtração através de um filtro de 0,2 micrômetro.

Até 23 produtos de cuidados pessoais diferentes ou PCPs e controles de extração podem ser testados em triplicata em uma única placa de 96 poços. Os PCPs incluem sabonetes, cremes para cabelo, xampus, protetores solares, maquiagens, espumas de barbear e loções. Para fins de filmagem, as amostras serão preparadas a partir de apenas oito PCPs.

Combine um grama de cada amostra com 10 mililitros de etanol anidro em um tubo cônico de 15 mililitros. Além disso, prepare um controle negativo de extração consistindo em 11 mililitros de etanol anidro em um tubo cônico de 15 mililitros. Homogeneíze o conteúdo de cada tubo cônico durante 30 minutos por meio de agitação manual combinada com vortex.

Centrifugue os tubos cônicos na velocidade máxima permitida em uma centrífuga de rotor pendular durante 10 minutos. Decante o sobrenadante de cada tubo através de um filtro celular de 40 micrômetros para um tubo cônico de 50 mililitros. Em seguida, transfira o conteúdo de cada tubo de 50 mililitros para um frasco de vidro para cintilação.

Deixe o etanol evaporar completamente deixando os frascos abertos em uma cabine ventilada durante uma semana. Proteja as amostras em secagem da luz para evitar a degradação de constituintes sensíveis à luz. Quando as amostras estiverem secas, reconstitua cada amostra em um mililitro de etanol a 50% e, em seguida, vortexe para homogeneizar.

Duas noites ou cerca de 42 horas antes de preparar as placas do ensaio de estrogênio em levedura ou placas YES, utilize técnica estéril para subcultivar a levedura, adicionando 0,1 mililitro de cada cultura ativa de levedura a 10 mililitros de meio de glicose esterilizado por filtração em um frasco Erlenmeyer estéril. Incube a 30 °C e continue a incubar as culturas originais como estoques. Dois dias depois, no primeiro dia do ensaio YES, utilize técnica estéril para diluir as culturas de levedura suspensas e o meio de galactose esterilizado por filtração em um béquer estéril.

Confirme a densidade óptica pipetando 120 microlitros de cada amostra de levedura em triplicata, juntamente com meios de galactose em branco em triplicata, em uma placa de poliestireno transparente. Utilize um espectrofotômetro de placa para verificar se o cultivo de levedura diluído apresenta uma densidade óptica líquida de 0,065 ± 0,005 em um comprimento de onda de 610 nanômetros. Determine a OD610 líquida da levedura subtraindo a OD610 dos brancos de meio de galactose.

Usando uma pipeta repetidora com uma ponteira de seringa estéril, adicione a suspensão de levedura diluída aos poços de uma placa microplaqueta estéril de polipropileno de 96 poços de acordo com este esquema da placa. Durante a pipetagem, mantenha a suspensão de levedura homogênea agitando continuamente o béquer ou misturando com a pipeta. Por fim, adicione 120 microlitros de meio de galactose esterilizado por filtração aos poços H10 a H12, indicados em verde no esquema da placa, para servir como controles de meio que levarão em conta os absorventes provenientes apenas do meio.

Prepare placas separadas para cada combinação de linhagem de levedura e substrato calorimétrico que será testada. Em seguida, construa uma curva padrão em cada placa por meio de diluição seriada de acordo com o esquema da placa. Utilize uma pipeta de canal único com ponteiras estéreis para adicionar cinco microlitros de padrão de estradiol aos poços A2, A2 e A3. Use uma pipeta multicanal para misturar o conteúdo dos poços por pipetagem e, em seguida, transfira 205 microlitros dos poços A1 a A3 para os poços B1 a B3. Repita a transferência de 205 microlitros até a linha G. Após a conclusão da diluição seriada, descarte 205 microlitros dos poços G1 a G3. Ao final desta etapa, todos os poços padrão devem conter 120 microlitros.

Adicione cinco microlitros de etanol a 50% a cada poço do controle de veículo contendo a suspensão de levedura, poços H1, H2 e H3, indicados em azul neste esquema da placa. O próximo passo é adicionar alíquotas de cinco microlitros em triplicata das amostras ou controles negativos de extração aos poços contendo a suspensão de levedura, indicados em roxo no esquema da placa. Anote quais amostras ou controles de extração são colocados em quais poços.

Para acompanhar quais poços contêm amostras e quais não contêm, comece com uma caixa nova de ponteiras e use ponteiras das mesmas posições na caixa correspondentes às posições dos poços na placa. Misture o conteúdo dos poços da amostra, controle de extração e controle de veículo por pipetagem. Ajuste os volumes desses poços para 120 microlitros removendo 205 microlitros de cada um.

Selar cada placa com um filme poroso adesivo estéril, rotular e incubar a 30 graus Celsius por 17 horas. Após a incubação de 17 horas, retirar as placas do incubador. Caso as placas não possam ser processadas imediatamente, envolvê-las com filme plástico e refrigerar as placas envolvidas a quatro graus Celsius por seis dias.

Quando estiver pronto para processar as placas, remova o envoltório. Use um pipetador multicanal para misturar o conteúdo de cada linha de poços e, em seguida, transfira 50 microlitros da suspensão de levedura de cada poço para o poço correspondente de uma microplaca de 96 poços de poliestireno transparente. Identifique a nova placa.

Para evitar a contaminação cruzada entre poços, use ponteiras novas para cada poço, mas as ponteiras não precisam ser estéreis. Em uma cabine de segurança, adicione 20 microlitros de DTT a um molar a 20 mililitros de tampão LacZ descongelado e em temperatura ambiente, obtendo uma concentração final de um milimolar de DTT. Misture bem o tampão LacZ.

Usando uma pipeta repetidora, adicione 200 microlitros de tampão LacZ contendo DTT e ONPG ou CPRG a todas as cavidades da placa de poliestireno e, imediatamente, meça e registre a densidade óptica a 610 nanômetros de todas as cavidades utilizando um leitor de placas. Repita conforme necessário para placas adicionais. Cubra as placas com tampa e incube-as a 30 graus Celsius pelos tempos indicados.

Quando a incubação estiver concluída, retire as placas do incubador. Utilize uma pipeta repetidora para adicionar 100 microlitros de carbonato de sódio a cada poço, a fim de interromper a reação de beta-galactosidase. Meça e registre a densidade óptica a 405 nanômetros para ONPG ou a 574 nanômetros para CPRG de todos os poços, utilizando um espectrofotômetro de placa.

O cálculo dos valores de LacZ pode ser realizado usando um aplicativo automatizado que exige a instalação do Java. Para começar, abra o aplicativo automatizado de LacZ descrito no apêndice um. Cole as leituras de densidade óptica em 405 nanômetros para ONPG ou em 574 nanômetros para CPRG de todas as poças, utilizando um layout de placa idêntico ao mostrado na figura um.

Insira o tempo de incubação e as horas para o ensaio desenvolver cor e clique em Avançar. Cole as leituras de densidade óptica em 610 nanômetros para todas as poças. Clique em Enviar para exibir os resultados de LacZ.

Os resultados de LacZ podem ser copiados usando comandos do teclado e colados em uma planilha ou outros arquivos conforme necessário. Inicie esta análise abrindo a aplicação online de análise de dados do ensaio YES. Faça o upload de um arquivo de dados CSV formatado conforme descrito na primeira guia.

Digitalize a curva padrão de estradiol na segunda guia e estime os parâmetros de regressão. Visualize os resultados do modelo de regressão na terceira guia e, em seguida, localize os valores interpolados no eixo x correspondentes aos valores de LacZ das amostras na quarta guia. Clique na quinta guia para visualizar os valores de equivalente de estrogênio (EEQ) das amostras.

Por fim, padronize os valores de EEQ à massa original da amostra conforme descrito no protocolo textual. São apresentados exemplos de curvas padrão após uma incubação de 17 horas de levedura com 17 beta-estradiol. Pelas razões discutidas no manuscrito, o CPRG é frequentemente uma escolha de substrato melhor do que o ONPG.

Conforme observações anteriores, os ensaios com levedura que expressava ER Beta foram mais de uma ordem de grandeza mais sensíveis do que os ensaios com levedura que expressava ER Alpha. Por isso, a atividade estrogênica foi detectada com maior frequência na levedura que expressava ER Beta. Um objetivo adicional do estudo foi testar durações de incubação compatíveis com a programação de um curso laboratorial de graduação.

Quando foi introduzido um período de refrigeração de seis dias após a incubação de 17 horas, as curvas padrão obtidas a partir das placas refrigeradas foram comparáveis às das placas não refrigeradas. Os erros padrão dos parâmetros estimados por meio de modelos de regressão logística de quatro parâmetros foram todos menores para as placas refrigeradas do que para as não refrigeradas. Assim, o armazenamento refrigerado das placas por seis dias reduz o erro e melhora a precisão das estimativas de EEQ.

Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em duas a três ou quatro sessões. Ao realizar o procedimento, é importante lembrar-se de empregar técnica estéril em todas as etapas realizadas antes do período de incubação de 17 horas, de pipetar com cuidado e precisão, e de seguir o esquema da placa apresentado na figura um. Após este procedimento, outros métodos, como ensaios em animais in vivo, podem ser realizados para investigar mecanismos adicionais de ação estrogênica e efeitos em organismos inteiros.

Após seu desenvolvimento, o teste de triagem de estrogênio em levedura passou a ser aceito como uma medida de baixo custo para detectar ligantes estrogênicos em amostras ambientais, como alimentos, tecidos vegetais e produtos de cuidados pessoais. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar extrações simples de produtos de cuidados pessoais, cultivar leveduras, preparar curvas de diluição padrão, executar o ensaio YES em uma placa de 96 poços e concluir os cálculos associados. E não se esqueça de que o trabalho com estradiol pode ser extremamente perigoso, e precauções, como o uso de luvas e outros equipamentos de proteção individual, bem como a garantia de descarte adequado, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.