Name: Itoforese em tempo real com tetrametilamônio para quantificar fração de volume e tortuosidade do espaço extracelular cerebral (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Aprenda a técnica de iontoforese em tempo real com tetrametilamônio para quantificar a fração de volume e a tortuosidade do espaço extracelular cerebral em tecido vivo.

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<ol><li>Sykova, E., Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+in+brain+extracellular+space%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Diffusion in brain extracellular space.</a> Physiol Rev. 88 (4), 1277-1340 (2008).</li>
<li>Nicholson, C. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/230904011_Diffusion_and_related_transport_mechanisms_in_brain_tissue">Diffusion and related transport mechanisms in brain tissue.</a> Rep Prog Phys. 64 (7), 815-884 (2001).</li>
<li>Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion-selective+microelectrodes+and+diffusion+measurements+as+tools+to+explore+the+brain+cell+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Ion-selective microelectrodes and diffusion measurements as tools to explore the brain cell microenvironment.</a> J Neurosci Methods. 48 (3), 199-213 (1993).</li>
<li>Nicholson, C., Phillips, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+diffusion+modified+by+tortuosity+and+volume+fraction+in+the+extracellular+microenvironment+of+the+rat+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ion diffusion modified by tortuosity and volume fraction in the extracellular microenvironment of the rat cerebellum.</a> J Physiol. 321, 225-257 (1981).</li>
<li>Nicholson, C., Sykova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+space+structure+revealed+by+diffusion+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Extracellular space structure revealed by diffusion analysis.</a> Trends Neurosci. 21 (5), 207-215 (1998).</li>
<li>Xie, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleep+drives+metabolite+clearance+from+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sleep drives metabolite clearance from the adult brain.</a> Science. 342 (6156), 373-377 (2013).</li>
<li>Hrabetova, S., Nicholson, C. Biophysical properties of brain extracellular space explored with ion-selective microelectrodes, integrative optical imaging and related techniques. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Biophysical+properties+of+brain+extracellular+space+explored+with+ion-selective+microelectrodes%2C+integrative+optical+imaging+and+related+techniques">Electrochemical Methods for Neuroscience Neuroscience</a>. Michael, A. C., Borland, L. M. , CRC press. 167-204 (2007).</li>
<li>Rice, M. E., Okada, Y. C., Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropic+and+heterogeneous+diffusion+in+the+turtle+cerebellum%3A+implications+for+volume+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Anisotropic and heterogeneous diffusion in the turtle cerebellum: implications for volume transmission.</a> J Neurophysiol. 70 (5), 2035-2044 (1993).</li>
<li>Vargova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+parameters+of+the+extracellular+space+in+human+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Diffusion parameters of the extracellular space in human gliomas.</a> Glia. 42 (1), 77-88 (2003).</li>
<li>Haack, N., Durry, S., Kafitz, K. W., Chesler, M., Rose, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-barreled+and+concentric+microelectrodes+for+measurement+of+extracellular+ion+signals+in+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Double-barreled and concentric microelectrodes for measurement of extracellular ion signals in brain tissue.</a> J Vis Exp. (103), (2015).</li>
<li>Xiao, F., Hrabetova, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enlarged+extracellular+space+of+aquaporin-4-deficient+mice+does+not+enhance+diffusion+of+Alexa+Fluor+488+or+dextran+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Enlarged extracellular space of aquaporin-4-deficient mice does not enhance diffusion of Alexa Fluor 488 or dextran polymers.</a> Neuroscience. 161 (1), 39-45 (2009).</li>
<li>Sherpa, A. D., Pvan de Nes,, Xiao, F., Weedon, J., Hrabetova, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gliotoxin-induced+swelling+of+astrocytes+hinders+diffusion+in+brain+extracellular+space+via+formation+of+dead-space+microdomains%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Gliotoxin-induced swelling of astrocytes hinders diffusion in brain extracellular space via formation of dead-space microdomains.</a> Glia. 62 (7), 1053-1065 (2014).</li>
<li>Kume-Kick, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independence+of+extracellular+tortuosity+and+volume+fraction+during+osmotic+challenge+in+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Independence of extracellular tortuosity and volume fraction during osmotic challenge in rat neocortex.</a> J Physiol. 542 (Pt 2), 515-527 (2002).</li>
<li>Saghyan, A., Lewis, D. P., Hrabe, J., Hrabetova, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+diffusion+in+laminar+brain+structures+exemplified+by+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Extracellular diffusion in laminar brain structures exemplified by hippocampus.</a> J Neurosci Methods. 205 (1), 110-118 (2012).</li>
<li>Fedirko, N., Svichar, N., Chesler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+and+use+of+high-speed%2C+concentric+H%2B-+and+Ca2%2B-selective+microelectrodes+suitable+for+in+vitro+extracellular+recording%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophys%22%5BJournal%5D)">Fabrication and use of high-speed, concentric H+- and Ca2+-selective microelectrodes suitable for in vitro extracellular recording.</a> J Neurophys. 96 (2), 919-924 (2006).</li>
<li>Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+from+an+injected+volume+of+a+substance+in+brain+tissue+with+arbitrary+volume+fraction+and+tortuosity%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Diffusion from an injected volume of a substance in brain tissue with arbitrary volume fraction and tortuosity.</a> Brain Res. 333 (2), 325-329 (1985).</li>
<li>Nicholson, C., Tao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hindered+diffusion+of+high+molecular+weight+compounds+in+brain+extracellular+microenvironment+measured+with+integrative+optical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Hindered diffusion of high molecular weight compounds in brain extracellular microenvironment measured with integrative optical imaging.</a> Biophys J. 65 (6), 2277-2290 (1993).</li>
<li>Thorne, R. G., Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+diffusion+analysis+with+quantum+dots+and+dextrans+predicts+the+width+of+brain+extracellular+space%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vivo diffusion analysis with quantum dots and dextrans predicts the width of brain extracellular space.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (14), 5567-5572 (2006).</li>
<li>Wolak, D. J., Thorne, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+of+macromolecules+in+the+brain%3A+implications+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharm%22%5BJournal%5D)">Diffusion of macromolecules in the brain: implications for drug delivery.</a> Mol Pharm. 10 (5), 1492-1504 (2013).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

<img alt="Figura 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55755/55755fig10.jpg" /> Figura 10: Dados não ideais que demonstram problemas técnicos comuns. (A) Diagramas de problemas técnicos comuns com microeletrodos de iontoforese: Comparação da versão normal do TMA de um microeletrodo funcionamento iontoforese com três fontes demonstrando questões técnicas. [Ampliação alta, a1] A corrente em uma fonte iontoforética ideal é carregada igualmente pela liberação de TMA e absorção de ...

<html> O espaço extracelular (ECS) é a rede de canais interligados para todas as células cerebrais e contém fluido intersticial e matriz extracelular ( Figura 1a e Figura 1b ). A distribuição de muitas substâncias necessárias para a função das células cerebrais, incluindo nutrientes, hormônios e neurotransmissores, ocorre por difusão através da ECS. As mudanças nos parâmetros físicos deste espaço, incluindo o volume, a geometria e a matriz extracelular, podem afetar drasticamente a difusão através do ECS e as concentrações de íons locais que banham as células cerebrais, que têm um impacto profundo na função celular 1 , 2 do cérebro. A iontoforese em tempo real (RTI) é usada para determinar duas características estruturais de uma região do cérebro: fração volumétrica e tortuosidade 3 , 4 ,&quot;Xref&quot;&gt; 5. A fração de volume ( α ) é a proporção de volume de tecido ocupado pelo ECS ( V ECS ) em relação ao volume total de tecido ( tecido V ) em um volume elementar representativo; <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/55755/55755eq1.jpg" /> A tortuosidade ( λ ) é o impedimento relativo que uma substância encontra quando se difunde através de uma região do cérebro em comparação com um meio sem obstruções; <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/55755/55755eq2.jpg" /> Onde D * (cm 2 s -1 ) é o coeficiente de difusão efetivo da substância no cérebro e D (cm 2 s -1 ) é o coeficiente de difusão livre da substância em meio livre, como o gel de agarose diluído. Hoje, a substância de sonda mais usada para o RO método TI é o pequeno catião tetrametilamônio (TMA). TMA tem um peso molecular de 74 g / mol, dissocia-se completamente em solução e tem uma carga positiva. Os estudos RTI com este íon demonstraram que α <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/55755/55755eq3.jpg" /> 0,2 e λ <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/55755/55755eq3.jpg" /> 1.6 1 , 2 . Isso significa que o ECS é aproximadamente 20% do volume total do cérebro e que a difusão de uma molécula pequena e inerte ocorre aproximadamente 2,5 vezes mais devagar no ECS do que em um meio sem obstruções 3 . No entanto, tanto α como λ variam com a idade cerebral, região e estado e em condições patológicas 1 . As alterações desses parâmetros foram ligadas ao desenvolvimento do cérebro, envelhecimento, sono, epilepsia e muitos outros processos e doenças fundamentais do cérebro 1, 6 . Enquanto outras técnicas medem α e λ , RTI pode medir tanto em regiões localizadas de tecido vivo em tempo real. Por esta razão, RTI tornou-se uma ferramenta indispensável para investigar as mudanças em α e λ durante os desafios agudos e reversíveis. A teoria que suporta RTI foi originalmente validada por Nicholson e Phillips, e a técnica tem sido amplamente utilizada desde então 4 , 7 . As experiências que empregam RTI começam com a liberação de um pulso de TMA a partir de um microeletrodo de fonte por iontoforese em um gel de agarose diluído. Uma vez ejetados, os íons se difundem livremente da fonte pontual, escolhendo de um número potencialmente infinito de caminhos aleatórios ( Figura 1d ). A alteração da concentração do íon é medida ao longo do tempo usando um microeletrodo seletivo de íons (ISM) posicionado aproximadamente100 um de distância ( Figura 1c ). As mudanças na concentração de TMA são graficadas e ajustadas a uma curva que permite o cálculo tanto de D como do número de transporte do microeletrodo de iontoforese (parâmetros discutidos no Protocolo). Com estes valores, o procedimento é repetido numa região cerebral de interesse para obter D * e calcular tanto α como λ . O controle do microeletrodo de iontoforese, a coleta de dados, a representação gráfica e o ajuste da curva de concentração de TMA e o cálculo dos parâmetros experimentais são tipicamente realizados pelos programas Wanda e Walter, que foram especificamente projetados para esse fim (o software e seus manuais são Livremente disponível dos autores mediante solicitação). A seção de protocolo desta revisão descreve os procedimentos básicos necessários para projetar e executar RTI em fatias de cérebro de roedores. A técnica também foi usada em não-hasteent modelos, incluindo fatias de cérebro de humanos e em preparações in vivo cerebrais 1, 4, 6, 8, 9. A seção Resultados representativos fornece resultados ideais e não ideais para destacar nuances na interpretação de dados. Finalmente, a seção de Discussão abrange brevemente as técnicas de solução de problemas, as limitações de RTI, as técnicas alternativas utilizadas para estudar o ECS e as futuras aplicações de RTI. <img alt="figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55755/55755fig1.jpg" /> Figura 1: Diagramas de difusão através de ECS. (A) Diagrama de ECS: Demonstra o tamanho e localização do ECS em uma secção de cérebro normal. Amarelo marca o ECS entre os processos das células cerebrais cinzentas. O volume do ECS é aproximadamente 20% do volume total do tecido ( ou seja, fração volumétrica = 0.2) sob condições fisiológicas. ( B ) Diagrama ampliado do ECS: Destaca os parâmetros físicos que contribuem para a tortuosidade, incluindo a geometria das células cerebrais (cinza) e a matriz extracelular (diagrama como uma malha de glicosaminoglicanos e proteoglicanos multicoloridos). ( C ) Diagrama 3D de difusão a partir de uma fonte pontual: demonstra o movimento líquido de moléculas inertes de uma fonte iontoforética para um ISM. Excluindo barreiras de difusão e absorção celular, as moléculas se difundem para fora em todas as direções, produzindo uma frente de concentração esférica. O ISM quantifica a concentração local das moléculas inertes liberadas da fonte iontoforética. ( D ) Simulação computacional de difusão em ECS do cérebro: [Far left] Configuração para simulação de Monte Carlo; As esferas verdes representam processos de células cerebrais e a cruz vermelha representa uma fonte pontual. Esta configuração modela o tecido cerebral diagramado na Figura 1a . [Imagens do meio] 3 e6 moléculas que realizam movimentos aleatórios à medida que se difundem através do espaço extracelular do cérebro, mostrado em 2 dimensões. [Extremamente à direita] Caminhos aleatórios de muitas moléculas liberadas da fonte pontual. O movimento líquido de todas as moléculas da fonte pontual é para fora como descrito na Figura 1c . Os passeios aleatórios cumulativos descrevem os espaços entre as células ( ou seja, o ECS, veja a referência 5 para mais explicações). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55755/55755fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Conversor A/D e D/A</td><td>National Instruments Corporation NI</td><td>USB-6221 DAQ</td><td>O NI USB-6221 ainda é vendido como um dispositivo 'Legacy' pela NI. Eles recomendam o uso de DAQs NI USB-6341 X Series para novas instalações, no entanto, não testamos as unidades mais recentes. Descrevemos o uso do NI USB-6221 com MATLAB e Windows 7 (32 bits). Alternativas: o conversor A/D PCI-MIO-16E-4 muito mais antigo (usado apenas no Windows XP ou sistema operacional mais antigo) com painel de conectores BNC-2090 BNC e cabo SH68-68-EP. Conforme observado no Manual Wanda, um programa experimental do MATLAB para usar arquivos binários de axônio está disponível.</td></tr><tr><td>agarose</td><td>Lonza</td><td>NuSieve GTG Agarose #50081</td><td>para preparar gel de agarose diluído para medições RTI</td></tr><tr><td>amplificador para ISM</td><td>Dagan</td><td>Modelo IX2-700 Pré-amplificador intracelular duplo</td><td>amplificador de íons e tensão de referência com N=0,1 (para barril de referência) e N=0,001 (para barril de íon) headstages</td></tr><tr><td>miscroscópio composto biológico (com objetiva de 4x e 10x)</td><td></td><td></td><td>para lascar as pontas dos microeletrodos e inspecionar microeletrodos; vários fornecedores, e.g.</td></tr><tr><td>Tubo de vidro capilar de borossilicato</td> AmScope <td>Harvard Apparatus</td><td>Warner Instruments modelo TG200-4; pedido #64-0811</td><td>tubo de vidro de barril duplo para microeletrodos seletivos de íons e microeletrodos iontoforéticos; diâmetro externo 2,0 mm, diâmetro interno 1,4 mm, septo 0,2 mm, comprimento 10 cm</td></tr><tr><td>escova</td><td>Winsor & Newton</td><td>University Series 233,</td><td>escova de cabo shoft redondo tamanho 0, disponível na Amazon</td></tr><tr>Câmera <td>Fisher</td><td></td><td></td><td>bico de bunsen</td></tr><tr><td>para visualização de micropipetas</td><td>Olympus</td><td>OLY-150</td><td>requer monitor, filtro IR no iluminador de subestágio é gravador</td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>gráfico opcionalregistrar continuamente tensões em microeletrodos seletivos de íons durante a calibração em padrões de tetrametilamônio e durante o experimento RTI; por exemplo Kipp & Zonen tipo BD112 gráfico de canil duplo registrado, clorotrimetilsilano recondicionado disponível</td></tr><tr><td>, puriss., > 99%</td> <td>Catálogo Sigma-Aldrich</td><td># 92360</td><td>para silanização; CUIDADO: inflamável, toxicidade aguda (oral, dérmica, inalação), corrosão da pele, danos aos olhos, reage violentamente com a água, consulte as informações de segurança da Sigma-Aldrich para obter uma descrição completa</td></tr><tr><td>Software comercial</td><td>O MathWorks</td><td>MATLAB, caixa de ferramentas de aquisição de</td><td>dados para aquisição e análise de dados usando os programas Wanda e Walter. Observe que uma licença acadêmica está disponível.</td></tr><tr><td>óculos de proteção para os olhos</td><td>Microscópio</td> composto de estágio fixo Fisher <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td>pode usar outros microscópios compostos com fórceps de estágios fixos</td></tr><tr><td></td><td>Ferramentas de Belas</td> <td>Ciências#11251-10</td><td>para lascar capilares de vidro; Dumond # 5, preferencialmente usado e não mais necessário para</td></tr><tr><td>capela</td><td></td><td></td> de exaustão de trabalho fino <td>para silanização e enchimento da ponta do barril seletivo de íons com trocador de íons líquidos; vários supliers, e.g. Captair com filtro apropriado vendido pela</td></tr><tr><td>lâmina de microscópio de vidro</td><td>Erlab Fisher</td> <td># 12-550A</td><td>para chip de pontas de microeletrodo</td></tr><tr><td>aquecedor / agitador</td><td>Fisher</td><td>Corning PC-420D</td><td>para preparar gel de agarose diluído e agitar soluções</td></tr><tr><td>iontoforéticas</td><td>unidade Dagan</td><td>ION-100 e PS-100</td><td>ION-100 é uma unidade de iontoforese de canal único +/- 130 V conformidade; PS-100 é uma fonte de alimentação externa; alternativas: por exemplo Axoprobe-1A fabricado pela Axon Instruments (agora Molecular Devices), fora de produção, verifique a disponibilidade de unidades recondicionadas (eBay e outros sites)</td></tr><tr><td>trocador de íons líquido (LIX) para tetrametilamônio</td><td>World Precision Instruments</td><td>IE190 Trocador de íons de potássio</td><td>Nota: isso é equivalente ao trocador de potássio Corning original 477317 baseado em tetrafeniliborato - não confunda com trocador de potássio neutro originário do laboratório do Dr. Simon, ETH, Zurique, que não detecta tetrametilamônio e é vendido pela Fluka. Você também pode fazer trocador de íons líquido para tetrametilamônio: 3% em peso tetraquis de potássio = borato (p-clorofenil) dissolvido em 2,3-dimetilnitrobenzeno. Compre produtos químicos da Fluka (agora parte da Sigma). Veja Oehme e Simon (1976) Anal. Acta 86: 21-25; CUIDADO: As propriedades toxicológicas deste trocador de íons líquido não foram totalmente determinadas. A ingestão ou o contato com o corpo humano podem ser prejudiciais. Tenha o devido cuidado! Os trocadores de íons líquidos devem ser armazenados em local fresco, longe da luz solar direta.</td></tr><tr><td>o suporte WPI do microeletrodo</td><td></td><td>M3301EH</td><td>para guardar o microeletrodo íon-seletivo pré-fabricado para silanização e o enchimento da ponta do tambor íon-seletivo com o permutador de íon líquido; A WPI vende duas versões deste suporte, M3301EH transparente e M3301EH preto. Em nossa experiência, o M3301EH transparente parece ser mais resistente do que o M3301EH preto.</td></tr><tr><td>micromanipulador</td><td>Narishige</td><td>MM-3</td><td>para posicionar o microeletrodo íon-seletivo pré-fabricado durante a silanização e enchendo a ponta do barril íon-seletivo com trocador de íons líquido; pode ser substituído por qualquer micromanipulador de três eixos em boas condições de trabalho</td></tr><tr><td>extrator de micropipeta</td><td>Sutter Instruments</td><td>Modelo P-97</td><td>para puxar tubos de vidro de cano duplo; outros extratores podem ser usados desde que possam acomodar tubos de vidro de cano duplo de grande diâmetro</td></tr><tr><td>termômetro de microssonda</td><td>Physiotemp</td><td>Modelo BAT-12R</td><td>sonda fina deste termômetro é colocada perto da agulha do local de registro</td></tr><tr><td></td><td></td><td>Seringas e agulhas BD # 305122 (calibre 25)</td> <td>para silanização; Agulhas BD PrecisionGlide 25 G x 5/8 pol (0,5 mm x 16 mm)</td></tr> <tr><td>objetiva 5X seca</td><td>Olympus</td><td>MPlan N</td><td></td></tr><tr><td>objetiva 10X imersão em água</td><td>Olympus</td><td>UMPlan FL N</td><td>10X a objetiva é imersão em água, a abertura numérica é 0,3, a distância de trabalho é de 3,3 mm</td></tr><tr><td>recipientes de plástico (com tampas)</td> <td>Fisher</td><td>#14-375-148</td><td>para armazenar soluções padrão de tetrametilamônio e microeletrodos</td></tr><tr><td>plataforma e platina de translação x-y para microscópio de platina fixa</td><td>EXFO</td><td>Gibraltar A plataforma Burleigh</td><td>contém câmara de fatia, micromanipuladores e acessórios, a platina translacional x-y move o microscópio sem comprometer a estabilidade de gravação</td></tr><tr><td>minicup</td><td></td><td></td> poroso <td>para medições de RTI em gel de agarose diluído;</td></tr><tr><td>adesivo reutilizável</td> caseiro <td>Bostik</td><td>Blu-Tack</td><td>para prender microeletrodos ao recipiente de retenção e outros usos; vários fornecedores, disponíveis na Amazon</td></tr><tr><td>micromanipulador robótico com posicionamento preciso x, y, z</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-285</td><td>dois micromanipuladores são necessários para segurar separadamente o microeletrodo íon-seletivo e o microeletrodo iontoforético. Também é possível colar micropipetas em uma matriz espaçada (ver texto).</td></tr><tr><td>unidade de condicionamento de sinal com filtro passa-baixo</td><td>Axon Instruments</td><td>CyberAmp 320 ou 380</td><td>não está mais disponível no fabricante, mas pode estar disponível no E-Bay; alternativas: por exemplo Filtro/Amplificador FLA-01 da Cygnus Technology. Este é um instrumento de canal único com um corte mínimo de 10 Hz usando um filtro Bessel multipolar, mas a empresa pode estar disposta a modificá-lo para uma frequência de corte mais baixa (2 Hz), se necessário.</td></tr><tr><td>fio de prata</td><td>A-M Systems</td><td>#7830</td><td>diâmetro 0.015", câmara de fatia nua (sem revestimento)</td></tr> <tr><td></td><td>Harvard Apparatus</td><td>Warner Modelo RC-27L</td><td>esta é uma câmara de fatia de submersão; não use</td></tr><tr><td>estereomicroscópio</td><td></td><td></td> de câmara de fatia de interface <td>para silanização e enchimento da ponta do barril seletivo de íons com trocador de íons líquido; montado horizontalmente; seringa de vários fornecedores</td></tr><tr><td>, 10 mL</td><td></td><td>Seringas e agulhas BD #309604</td><td>para preenchimento de microeletrodos e para silanização; Filtro de seringa de ponta BD Luer-Lok</td></tr><tr><td>0.22 &micro; m pore</td><td>Whatman</td><td>#6780-1302</td><td>para filtrar soluções de aterro; disponível na</td></tr><tr><td>agulha de seringa Fisher, calibre 28, 97mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>MicroFil MF28G-5</td><td>para microeletrodos de aterro</td></tr><tr><td>Tubulação de teflon (=PTFE)</td><td>Fornecimento de componentes</td><td>STT-28 Parede de luz do tubo de PTFE (calibre 28)</td><td>para silanização de barril seletivo de íons; se encaixa em agulhas BD PrecisionGlide 25 G x 5/8 in. Nota: O teflon é essencial, a tubulação de PVC derreteria por cera quente.</td></tr><tr><td>sistema de controle de temperatura</td><td>Harvard Apparatus</td><td>Warner Models TC-344B e SH-27A</td><td>TC-344B é um controlador de temperatura automático duplo, SH-27A é um aquecedor em linha; controlador e aquecedor funcionam com Warner slice chambers</td></tr><tr><td>tetramethyammonium (TMA) cloreto</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-3411</td><td>5 M solução; CUIDADO: toxicidade aguda (oral, dérmica, inalação), carcinogenicidade, perigosa para o ambiente aquático, consulte as Informações de Segurança Sigma-Aldrich para obter a descrição completa</td></tr><tr><td>micrótomo de lâmina vibratória</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td>para cortar fatias de cérebro</td></tr><tr><td>xilenos</td><td>Fisher</td><td>X5-1</td><td>para silanização; CUIDADO: inflamável, toxicidade aguda (oral, dérmica, inalação), corrosão da pele, danos aos olhos, carcinogenicidade, consulte as informações de segurança da Fisher para obter a descrição completa</td></tr></tbody></table>

itoforese em tempo real com tetrametilamônio para quantificar fração de volume e tortuosidade do espaço extracelular cerebral

Real-time Iontophoresis with Tetramethylammonium to Quantify Volume Fraction and Tortuosity of Brain Extracellular Space

Esta revisão descreve os conceitos e protocolos básicos para executar o método de iontoforese em tempo real (RTI), o padrão-ouro para explorar e quantificar o espaço extracelular (ECS) do cérebro vivo. O ECS envolve todas as células cerebrais e contém fluido intersticial e matriz extracelular. O transporte de muitas substâncias necessárias para a atividade cerebral, incluindo neurotransmissores, hormônios e nutrientes, ocorre por meio da difusão através do ECS. Mudanças no volume e geometria deste espaço ocorrem durante processos cerebrais normais, como o sono e condições patológicas, como a isquemia. No entanto, a estrutura e a regulação das ECS cerebrais, particularmente em estados doentes, permanecem largamente inexploradas. O método RTI mede dois parâmetros físicos do cérebro vivo: fração volumétrica e tortuosidade. A fração de volume é a proporção de volume de tecido ocupado pela ECS. A tortuosidade é uma medida do impedimento relativo que uma substância encontra ao difundir através de um cérebro reEm comparação com um meio sem obstruções. Em RTI, uma molécula inerte é pulsada a partir de um microeletrodo de origem no ECS do cérebro. À medida que as moléculas se difundem para longe desta fonte, a mudança da concentração do íon é medida ao longo do tempo usando um microeletrodo seletivo de íons, localizado a aproximadamente 100 um de distância. A partir da curva de difusão resultante, tanto a fração de volume quanto a tortuosidade podem ser calculadas. Esta técnica tem sido utilizada em fatias de cérebro de múltiplas espécies (incluindo seres humanos) e in vivo para estudar alterações agudas e crônicas para ECS. Ao contrário de outros métodos, RTI pode ser usado para examinar mudanças reversíveis e irreversíveis no ECS do cérebro em tempo real.

A utilidade da técnica RTI é demonstrada em um experimento projetado para medir as mudanças em α e durante um desafio hipoosmolar ( Figura 8 e Figura 9 ). Já foi demonstrado que a redução da osmolaridade do ECS por lavagem na ACSF hipotônica produzirá uma diminuição em α e um aumento em λ 13 . Nesta experiência, o RTI...

Este protocolo descreve a iontoforese em tempo real, um método que mede os parâmetros físicos do espaço extracelular (ECS) dos cérebros vivos. A difusão de uma molécula inerte liberada no ECS é utilizada para calcular a fração de volume ECS e tortuosidade. É ideal para estudar alterações reversíveis agudas na ECS cerebral.

Itoforese em tempo real com tetrametilamônio para quantificar fração de volume e tortuosidade do espaço extracelular cerebral

This review describes the basic concepts and protocol to perform the real-time iontophoresis (RTI) method, the gold-standard to explore and quantify the ...

O objetivo geral deste procedimento é quantificar a fração de volume e a tortuosidade do espaço extracelular no tecido cerebral. Este método responde a questões-chave sobre a relação entre o espaço extracelular e a fisiologia e a doença. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a caracterização em tempo real de dois parâmetros importantes do espaço extracelular.Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades porque o microeletrodo iontoforético exibe uma tendência a mudar suas propriedades durante os experimentos e freqüentemente requer solução de problemas durante os experimentos. A demonstração visual deste método é crítica, pois a manipulação precisa de um microeletrodo seletivo de íons, um eletrodo iontoforético em várias etapas, é necessária para obter uma gravação bem-sucedida. Para iniciar este procedimento, execute o ACSF contendo tetrametilamônio, ou TMA, através da câmara de submersão a dois mililitros por minuto.Defina o controlador de temperatura para a temperatura desejada e borbulhe o ACSF com 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono durante o experimento. Em seguida, monte o eletrodo de aterramento em um suporte e mergulhe sua ponta no ACSF que passa pela câmara de submersão. Em seguida, encha o copo poroso com 0,3% de agarose contendo TMA preparado anteriormente e coloque-o na câmara de submersão.Agora, prenda um microeletrodo de iontoforese ao porta-pipeta de um micromanipulador. Conecte o fio do microeletrodo de iontoforese ao estágio principal da unidade de iontoforese. Em seguida, prenda um ISM calibrado ao segundo micromanipulador e conecte o ISM ao seu cabeçote stages.Em seguida, ligue o computador que contém os programas Wanda e Walter. Na GUI do Wanda, clique em Calibrar. Em seguida, na caixa Calibração, preencha as tensões medidas durante a calibração do ISM e clique em Ajustar dados.Em seguida, clique em Aceitar na caixa Calibrar para transferir automaticamente a inclinação e a interferência geradas para a GUI principal. No lado esquerdo da GUI, certifique-se de que todos os parâmetros experimentais estejam definidos nas entradas correspondentes. Em seguida, coloque uma sonda de temperatura no copo de ágar.Registre a temperatura medida na entrada Temperatura na caixa Eletrodo de medição da GUI. Em seguida, abaixe os microeletrodos pelo menos 1.000 micrômetros de profundidade na agarose e centralize-os no copo. Visualize-os ao microscópio usando uma objetiva de 10X.No amplificador de dois canais, mova manualmente o conector do canal ISM para a saída de subtração de tensão para definir a subtração entre os canais de referência e ISM. Centralize as pontas uma na outra em todos os três eixos direcionais. Em seguida, zere as posições relativas de ambos os microeletrodos nas caixas de controle do micromanipulador e certifique-se de que os microeletrodos estejam centralizados com precisão e precisão.Em seguida, afaste o MI 120 micrômetros do microeletrodo de iontoforese em um eixo. Posteriormente, inicie uma gravação clicando em Adquirir na GUI e permita que o programa seja executado para uma gravação completa. Neste procedimento, abra o programa Walter no computador.No menu Zero Registros de, clique no botão Wanda Voltoro para ler os registros gerados por Wanda. Na próxima janela pop-up, selecione um ou mais registros a serem lidos e clique em Abrir. No menu One Write Excel, clique em Planilha 1.3 e siga as instruções até que os registros sejam representados graficamente automaticamente.Para iniciar o procedimento de ajuste, no menu Duas opções, clique no botão selecionar gravação. Em seguida, na janela pop-up da figura dois, use o mouse para mover a mira sobre o primeiro registro a ser processado e pressione um dos botões do mouse para escolher o registro. Depois disso, clique em curva de ajuste no menu e use pelo menos 20 iterações de ajuste para obter um ajuste preciso dos dados.Em seguida, selecione tudo para ajustar todos os pontos de dados e selecione continuar. O programa se ajustará à curva exibida. Em seguida, selecione a opção para gravar o resultado no programa de planilha apropriado clicando em Excel no menu de sete resultados.Nomeie o arquivo do Excel. Anote e registre os dados gerados que serão usados para determinar a funcionalidade do microeletrodo de iontoforese. Se o microeletrodo de iontoforese for considerado adequado para o experimento, registre o número médio de transporte de todos os testes no campo final TransportNum na GUI do Wanda.Neste procedimento, coloque uma fatia de cérebro de 400 micrômetros de espessura na câmara de registro, garantindo que ela esteja totalmente submersa no fluxo de ACSF. Em seguida, mova o microeletrodo de iontoforese e o ISM acima do campo de interesse na fatia do cérebro. Mergulhe os dois eletrodos no fluxo de ACSF, mas acima da fatia.Em seguida, desloque a tensão para os canais de referência e sensor de íons para zero milivolts. Aguarde até que a tensão em ambos os canais se estabilize. No registrador gráfico, marque a tensão medida no canal de detecção de íons do ISM.Em seguida, coloque os microeletrodos ISM e iontoforese a 200 micrômetros de profundidade na fatia e a 120 micrômetros de distância um do outro. Calcule a diferença de tensão entre os sinais TMA medidos no fluxo ACSF e no cérebro e insira esse valor no campo Baseline Volt Millivolt na caixa Measuring Electrode da GUI Wanda. No lado esquerdo da GUI, certifique-se de que todos os parâmetros experimentais sejam inseridos corretamente.Inicie a gravação clicando em Adquirir e permita que ela faça uma gravação completa. Depois de mover os dois microeletrodos para fora da fatia, use o registrador gráfico para determinar qualquer mudança entre a tensão medida agora e sua medição anterior. Para analisar as gravações do cérebro, repita os procedimentos de análise de dados de agarose usando o programa Walter.Escreva os dados no programa de planilha clicando em Excel no menu Walter. Em seguida, registre a fração de volume do ECS cerebral, a tortuosidade do ECS cerebral e a depuração inespecífica. Para verificar o número de transporte, faça novas gravações em agarose e repita os procedimentos do programa Walter para obter o número de transporte.Inspecione a planilha e verifique se o número de transporte mudou em mais de 10% em relação ao número de transporte obtido antes das medições cerebrais. Nesse caso, os dados obtidos com o microeletrodo iontoforético não são confiáveis. O número de transporte medido nesta etapa deve corresponder ao obtido antes das medições cerebrais, caso contrário, a fração de volume não pode ser considerada precisa.Use os dados de calibração ISM recém-obtidos como entrada na caixa Wanda Calibrate e verifique se o valor da inclinação difere em menos de 10% da calibração anterior. Aqui estão os dados representativos de um único ensaio obtido em ágar demonstrando a curva de concentração de TMA. E esta é uma curva ajustada obtida a partir do processamento de dados em Walter.A sobreposição dos dados na curva ajustada demonstra que o ajuste da curva feito por Walter modela com precisão a difusão neste ensaio. Aqui está a tabela de medições de ágar antes da experimentação no cérebro. Aqui está um resumo das medições feitas em uma fatia de cérebro de camundongo sob as condições de controle e experimentais.O alfa diminuiu durante um desafio hipoosmolar, enquanto a tortuosidade aumentou conforme o esperado. Alpha ultrapassou os valores de controle nas condições de recuperação. E aqui está a tabela de medições de agra após a experimentação no cérebro.Os números médios de transporte antes e depois do experimento estavam dentro de 10% um do outro, o que indica que os valores registrados no cérebro eram confiáveis. Uma vez dominado, este procedimento pode ser realizado em 14 horas ao longo de dois dias. No primeiro dia, os ISMs são fabricados e calibrados.No segundo dia, os ISMs são recalibrados e a iontoforese em tempo real é realizada. Ao tentar este procedimento, é importante primeiro ser preciso no espaçamento de seus eletrodos. Em segundo lugar, é importante aceitar um experimento apenas se o número de transporte do microeletrodo iontoforético permanecer estável ao longo do experimento.Seguindo este procedimento, que caracteriza a difusão de pequenos cátions no espaço extracelular, você pode realizar outras técnicas, como o método de imagem óptica integrativa, que permite responder à questão de como grandes micromoléculas se movem no espaço extracelular. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar o método de iontoforese em tempo real para quantificar o volume do espaço extracelular cerebral e a tortuosidade no cérebro vivo na saúde e na doença. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

O vídeo demonstra a dinâmica evocada da concentração de íons potássio na estimulação elétrica de fatias de cérebro coronal do hipocampo de camundongos. Um eletrodo estimulante bipolar é inserido no estrato radiato da região CA3 no hipocampo e um eletrodo seletivo de íons de potássio é colocado no estrato radiato CA1. A estimulação elétrica causa um potencial de ação, resultando na liberação de íons potássio. Finalmente, a falta de resposta evocada do íon potássio na presença de uma molécula...

Medição da Dinâmica da Concentração de Íons Evocados de Potássio em Fatias Coronais do Hipocampo

Este vídeo demonstra como caracterizar o espaço extracelular em uma fatia cerebral usando microeletrodos seletivos de íons e iontoforese para medir e comparar sinais elétricos. Esse processo ajuda a determinar a fração de volume e o grau de torção do espaço.

Caracterização do espaço extracelular em uma fatia cerebral usando microeletrodos íon-seletivos e iontoforese

Fonte: Moye, S. L., et.al.  Visualizando a morfologia dos astrócitos usando a iontoforese amarela de Lúcifer. J. Vis. Exp. (2019).  Este vídeo demonstra o uso de iontoforese de corante fluorescente para estudar a morfologia de astrócitos em fatias fixas de cérebro. Ele detalha a perfuração do soma do astrócito com um eletrodo para fornecer um corante aniônico e hidrofílico no citoplasma sob uma corrente de baixa voltagem, permitindo que o corante se difunda e rotule o soma e os ramos. A...

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Aqui, descrevemos um método na vivo microdialysis analisar a liberação de aspartato e glutamato no hipocampo ventral de ratos epilépticos e não-epiléptica, em combinação com gravações de EEG. Concentrações extracelulares de aspartato e glutamato podem ser correlacionadas com as diferentes fases da doença.

Microdialysis de aminoácidos excitatórios durante as gravações de EEG em ratos movimentando-se livremente

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Um método de Micro-CT-baseado para caracterizar as lesões e localização de eletrodos nos cérebros de animais pequenos

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Visualizando morfologia Astrocitante usando Lúcifer iontoforese amarela

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Microscopia Multifotol Intravital em Tempo Real para visualizar tratamentos focados de ultrassom e microbolhas para aumentar a permeabilidade da barreira hematoencefálica

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Colocação de eletrodos estimuladores extracranianos e mensuração do fluxo sanguíneo cerebral e campos elétricos intracranianos em camundongos anestesiados

Aprenda a técnica de iontoforese em tempo real com tetrametilamônio para quantificar a fração de volume e a tortuosidade do espaço extracelular cerebral em tecido vivo.

Itoforese em tempo real com tetrametilamônio para quantificar fração de volume e tortuosidade do espaço extracelular cerebral

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