In Vitro Diferenciação de células-tronco mesenquimais humanas em células casos funcionais

O objetivo geral deste procedimento experimental é induzir e observar a indução cardiomiogênica de células-tronco mesenquimais. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo das células-tronco mesenquimais, como quais remédios podem ser induzidos por sinais ambientais para gerar cardiomiócitos funcionais. A principal vantagem desta técnica, é que ela aplica formação de agregados e camadas fetais cardíacas, em vez de agentes farmacológicos ou material genético.

As implicações dessa técnica se estendem à terapia de doenças cardiovasculares porque elabora o potencial cardiomiogênico das células-tronco mesenquimais. Demonstrando este procedimento comigo estarão a Srta. Farwah Iqbal, aluna de doutorado de nosso laboratório, Max Librach e Nadav Gasner, ambos estagiários de nosso laboratório. Depois de isolar as partes do filhote de rato de acordo com o protocolo de texto, corte os ventrículos ao meio e transfira-os para um prato de 10 centímetros com 10 mililitros de PBS e risca de giz no gelo, para deixar o sangue sair.

Em seguida, usando uma tesoura curva, corte as paredes ventriculares em pequenos pedaços com um diâmetro de dois a três milímetros. Usando uma pipeta sorológica, transfira os pedaços de coração de 10 a 12 animais para um tubo de 50 mililitros e deixe-os assentar. Remova o máximo possível de PBS P/S, sem remover nenhum pedaço de coração.

Em seguida, adicione 10 milímetros de PBS P / S fresco. Para isolar os cardiomiócitos, depois que as peças do coração se assentarem, use 0,15% de tripsina em PBS, para substituir o PBS P / S e incubar o tecido a 37 graus Celsius com agitação, por 10 minutos. Descarte o sobrenadante.

Em seguida, repita a digestão da tripsina mais três vezes, exceto, sobrenadantes decantadores em tubos de coleta de 50 mililitros contendo 10 mililitros de 100% FBS. Em seguida, centrifugue os tubos das células e aspire o sobrenadante. Em seguida, use DMEM-F12 com 10% FBS e 1% P / S para ressuspender as células e semeá-las em uma placa de seis poços.

Uma vez que as células tenham se fixado, substitua o meio por dois mililitros de meio fresco. Para preparar MSCs pré-coradas, remova o meio das culturas de MSC que atingiram 70% a 80% de confluência em placas de 10 centímetros e adicione três mililitros de solução de dissociação celular. Incube os pratos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por cinco minutos.

Transferir as células dissociadas para um tubo de 15 mililitros e centrifugar a 400 x G durante cinco minutos. Aspirar o sobrenadante sem perturbar o sedimento celular e ressuspender as células. Em seguida, use um contador de células automatizado para contar as células.

Diluir as células a uma concentração de 1 x 10 elevado ao sexto MSCs por mililitro, em DMEM-F12 contendo 10% de FBS e 1% de P/S. Em seguida, às células em tubos de centrífuga de 1,5 mililitro, adicione corante fluorescente viável e intransferível e incube as MSCs por meia hora. Depois de centrifugar os tubos a 400 x G durante cinco minutos, aspirar o sobrenadante e voltar a suspender o sedimento a uma concentração de 1 x 10 até ao sexto MSC por mililitro.

Em seguida, transfira as MSCs para cardiomiócitos na concentração de 10 x 10 para as quartas células por poço da placa de seis poços. Para fazer co-culturas agregadas, prepare uma suspensão de célula única de MSCs em alfa MEM, suplementada com 10% FBS e 1% P / S. Inicie a formação de agregados, colocando gotas de 25 microlitros de suspensão celular na superfície interna das tampas de placas de cultura de tecidos de 10 centímetros.

Coloque as tampas em suas contrapartes inferiores contendo PBS P / S. Incube os pratos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Sob um microscópio estéreo, observe a formação de agregados nas gotas após três dias.

Se mais de 80% das gotas contiverem agregados formados, use uma micropipeta de um mililitro para coletar as gotas das tampas e transfira os agregados diretamente para as monocamadas primárias de cardiomiócitos de ratos. Incubar as coculturas agregadas por até duas semanas. Alterar o volume total do meio a cada 72 horas.

Diariamente, use a microscopia de campo claro para observar agregados que se ligam às camadas de células fetais. Registre agregados de contratação quando observados. Os agregados ativos se contraem de forma sincronizada, sugerimos uma condutância entre eles em toda a camada fetal, que não possui atividade física.

Aspire o meio e adicione dois mililitros de PBS por poço do prato de seis poços. Em seguida, remova o PBS e adicione dois mililitros de solução de dissociação por poço. Incube os pratos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por três minutos.

Como mostrado aqui, HMSCs de três tipos diferentes exibiram abundância e aparência semelhantes em co-culturas diretas. Dois a três dias após a transferência de gotas suspensas para células cardíacas em co-culturas agregadas, FTMs e PBCs de huck a termo apareceram em agregados maiores em comparação com aqueles observados em BMSCs. Neste experimento, a análise por citometria de fluxo da expressão de CD49F em MSCs indiferenciadas mostrou que 96% das PBCs FTM huck, denominadas 89% das PBCs huck e 53% das BMSCs, foram positivas para CD49F de superfície celular.

A citometria de fluxo no TRA ganhou 85 células, mostrou a regulação positiva do marcador associado ao cardiomiócito, SIRPA em FTM huck PBCs e term huck PBCs, mas não em BMSCs de co-culturas diretas de cardiomiócitos. Como visto aqui, a regulação positiva de cx43 foi significativamente maior em FTM huck PBCs em comparação com termo, huck PBCs ou BMSCs em co-culturas diretas. A análise de microscopia fluorescente revelou que a diferenciação de FTM e termo, PBCs, ambas regularam positivamente cx43.

Com termo huck PBCs em uma porção maior do que FTMs. No entanto, a microscopia de fluorescência revelou que pontos positivos para cx43 foram observados na membrana celular de FTM huck PBCs e eram predominantemente citoplasmáticos em células a termo. Finalmente, como visto aqui, a microscopia de fluorescência de alta ampliação foi realizada em células humanas selecionadas, após co-cultura e a alta abundância de cx43 na membrana plasmática foi confirmada

Uma vez dominadas, as principais etapas deste procedimento podem ser executadas em uma hora cada, se forem executadas corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante manter precauções assépticas. Tecidos animais primários envolvidos que podem introduzir contaminação, se não forem manuseados adequadamente.

Seguindo este procedimento, outros métodos, como cultura adicional de agregados em contração, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como longevidade dessas estruturas. Após seu desenvolvimento, essa técnica permite que pesquisadores na área de MSCs explorem o potencial de diferenciação de fontes mais jovens de células-tronco mesenquimais, como tecidos embrionários extras. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como preparar agregados de MSC e combiná-los com camadas fetais de tecido primário direto, de uma maneira que forneça uma indução adequada para a diferenciação cardiomiogênica.

Não se esqueça de que trabalhar com BRDU pode ser extremamente perigoso e precauções como o manuseio adequado de resíduos citotóxicos devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.