Name: In Vitro Diferenciação de células-tronco mesenquimais humanas em células casos funcionais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Aprenda a diferenciação cardiomiogênica de células-tronco mesenquimais humanas em células funcionais usando sinais ambientais e formação de agregados. Este método oferece uma alternativa viável às abordagens farmacológicas para terapia cardiovascular.

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Os autores agradecer os seguintes membros de pessoal e investigação pessoal para suas contribuições: Matthew Librach, Leila Maghen, Tanya A. Baretto, Shlomit Kenigsberg e Andrée Gauthier-Fisher. Este trabalho foi financiado pelo fundo de pesquisa The Ontário - excelência em pesquisa (ORF-RE, rodada #7) e criar programa Inc..

Todos os estudos envolvendo animais foram conduzidos e relatados de acordo com as diretrizes ARRIVE48. Todos os estudos foram realizados com aprovação do conselho de ética em pesquisa institucional (REB número 454-2011, Sunnybrook Research Institute; REB 29889, Universidade de Toronto, Toronto, Canadá). Todos os procedimentos em animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados com Animais da University Health Network (Toronto, Canadá), e todos os animais receberam cuidados humanitários em conformidade com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório,8ª edição (National Institutes of Health 2011).
1. Cultura de tecidos
<ol>
	<li>Cultura FTM HUCPVCs, termo HUCPVCs (previamente estabelecido, n ≥ 3 linhas independentes para cada um)42 e BMSCs disponíveis comercialmente em meio essencial alfa-mínimo (MEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e um coquetel de penicilina/estreptomicina (P/S) a 1%. Cultura de cardiomiócitos primários de ratos e co-culturas de cardiomiócitos MSC no meio Eagle modificado de Dulbecco: Mistura de nutrientes F-12 (DMEM-F12) contendo 10% de FBS e 1% de P/S. 
	NOTA: Esterilize o meio usando um filtro de 0.2 μm. Conservar as soluções médias preparadas a 4 °C durante um período máximo de 3 semanas.</li>
	<li>Manter culturas de células em incubadoras umidificadas (95% de umidade relativa, 37 °C e 5% de CO2) e passagem a 70-80% de confluência, determinada por microscopia de contraste de fase. Use volumes apropriados de meio para o tamanho da placa de cultura de tecidos usada (por exemplo, 10 mL em uma placa de 10 cm e 2 mL por poço em uma placa de cultura de tecidos de 6 poços). Utilizar estas condições de cultura durante o período de vigência do protocolo.</li>
	<li>Dissocie as monocamadas de MSC para passagem ou estabelecimento de co-cultura de cardiomiócitos MSC usando uma solução enzimática de dissociação (2 mL / poço em uma placa de 6 poços) e incube a 37 ° C por 4 min.</li>
	<li>Transfira as células dissociadas para um tubo de 15 ml e centrifugue a 400 x g durante 5 min.</li>
	<li>Aspirar o sobrenadante sem perturbar o sedimento celular e ressuspender as células em 1 ml de um meio de cultura adequado para a contagem utilizando um contador de células automático. Semeie as células conforme descrito nas seções de protocolo a seguir.</li>
</ol>
2. Preparação de Co-culturas Primárias de Cardiomiócitos de Ratos-MSC
<ol>
	<li>Obtenha tecido cardíaco para isolamento primário de cardiomiócitos.
	<ol>
		<li>Eutanasiar filhotes de ratos (5-6 dias pós-parto) usando asfixia por CO2. Defina as câmaras de CO2 para 20% de reposição de gás (vazão = 0,2 x volume da câmara por minuto). Confirme o exitus pela ausência do reflexo de pinça.</li>
		<li>Remova os átrios com os principais vasos sanguíneos conectados usando instrumentos esterilizados (ou seja, fórceps e tesouras curvas)41. Transfira os corações para tubos de 50 mL contendo PBS estéril com 1% de P/S (PBS-P/S) no gelo.</li>
		<li>Corte os ventrículos ao meio e deixe o sangue sair em um prato de 10 cm com 10 mL de PBS-P/S no gelo. Corte as paredes ventriculares em pedaços pequenos (diâmetro = 2-3 mm) usando uma tesoura curva.</li>
		<li>Transfira os pedaços de coração de 10-12 animais para um tubo de 50 mL usando uma pipeta sorológica e deixe-os repousar.</li>
		<li>Remova o máximo possível de PBS-P / S sem remover nenhum pedaço de coração. Adicione 10 mL de novo PBS-P / S.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Digerir o tecido cardíaco para isolar os cardiomiócitos.
	<ol>
		<li>Deixe os pedaços do coração assentarem. Substitua o PBS-P/S por 10 mL de tripsina a 0,15% em PBS e agite a 37 °C por 10 min.</li>
		<li>Descarte o sobrenadante. Repita a digestão descrita na etapa 2.2.1 mais três vezes, mas decanta os sobrenadantes em tubos de coleta de 50 mL contendo 10 mL de FBS 100%.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Centrifugar as células (400 x g, 5 min) e aspirar o sobrenadante. Ressuspenda as células em DMEM-F12 contendo 10% de FBS e 1% de P/S e semeie em uma placa de 6 poços (1 x 10 5 células/cm2, 2 mL de meio por poço).</li>
	<li>Após 1 h, transfira o meio contendo células não anexadas para um tubo de 50 mL e descarte as células anexadas. Conte as células em suspensão e coloque-as novamente em novas placas de 6 poços (1 x 105 células/cm2, 2 mL de DMEM-F12 contendo 10% de FBS e 1% de P/S por poço).</li>
	<li>Inibir a proliferação celular com bromodeoxiuridina (BrdU). 
	Cuidado: BrdU é um forte teratogênico e suspeito de mutagênico. Certifique-se de que o treinamento adequado seja fornecido e consulte a ficha de dados de segurança antes de usar.
	<ol>
		<li>Uma vez que as células tenham se fixado, substitua o meio na placa de 6 poços por DMEM-F12 contendo 10% de FBS, 1% de P/S (2 mL de meio por poço) e 5 μM de BrdU. Incubar durante 16 h (37 °C, 5% CO2).</li>
		<li>Remova o meio contendo BrdU e substitua por DMEM-F12 contendo 10% de FBS e 1% de P/S (2 mL de meio por poço).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Prepare MSCs pré-coradas.
	<ol>
		<li>Quando as culturas de MSC estiverem a 70-80% de confluência em placas de 10 cm, remova o meio de cultura e adicione 3 mL de solução de dissociação celular. Incubar a cápsula a 37 °C e 5% de CO2 durante 5 min.</li>
		<li>Transfira as células dissociadas para um tubo de 15 ml e centrifugue a 400 x g durante 5 min.</li>
		<li>Aspire o sobrenadante sem interromper o pellet celular e ressuspenda as células em 1 mL de DMEM-F12 contendo 10% de FBS e 1% de P/S para contagem usando um contador de células automatizado.</li>
		<li>Dilua as células a uma concentração de 1 x 106 MSC / mL de DMEM-F12 contendo 10% de FBS e 1% de P / S.</li>
		<li>Incube as MSCs com corante fluorescente viável e intransferível (5 μM, 30 min, 37 °C, 5% CO2) em tubos de centrífuga de 1,5 mL por 1 h.</li>
		<li>Centrifugue os tubos a 400 x g por 5 min. Aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet em DMEM-F12 contendo 10% de FBS e 1% de P / S para uma concentração celular de 1 x 106 MSC / mL. Repita isso um total de 3 vezes.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transfira as MSCs para cardiomiócitos (etapa 2.5.2) a uma concentração de 10 x 104 células por poço da placa de 6 poços.</li>
</ol>
3. Preparação de coculturas agregadas
<ol>
	<li>Prepare uma suspensão unicelular de MSCs (2 x 104 células/mL de meio, passagem # ≤ 6) em alfa-MEM suplementada com 10% de FBS e 1% de P/S (consulte a etapa 2.6). 
	NOTA: Consulte a seção 1 do protocolo para a passagem de células. Como alternativa, pré-core as MSCs de acordo com a etapa 2.6.</li>
	<li>Inicie a formação de agregados colocando gotas de 25 μL de suspensão celular (500 células) na superfície interna das tampas de placas de cultura de tecidos de 10 cm (até 50 gotas por tampa). Coloque as tampas em suas contrapartes inferiores contendo PBS-P / S. Incube a 37 ° C e 5% CO2. 
	NOTA: Coloque 5-7 mL de PBS-P/S na placa de cultura abaixo das gotas suspensas para evitar a evaporação da gota.</li>
	<li>Observe a formação de agregados nas gotas após 3 dias usando um estereomicroscópio. Se mais de 40 das 50 gotas contiverem agregados formados, colete as gotas das tampas usando uma micropipeta de 1 mL e transfira os agregados diretamente para monocamadas primárias de cardiomiócitos de rato (preparadas nas etapas 2.1-2.7; 10 gotas/poço). Evite pipetagem vigorosa para preservar a integridade do agregado.</li>
	<li>Mantenha as coculturas agregadas nas incubadoras por até 2 semanas, alterando o volume total do meio (2 mL de DMEM-F12 contendo 10% de FBS e 1% de P/S por poço) a cada 72 h.
	<ol>
		<li>Observe diariamente os agregados que se ligam às camadas de células alimentadoras usando microscopia de campo claro. Registre agregados de contratação quando observados.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Prepare agregados para análise.
	<ol>
		<li>Remova o meio e adicione 2 mL de PBS por alvéolo de uma placa de cultura de tecidos de 6 poços. Remova o PBS e adicione 2 mL de solução de dissociação por poço. Incubar durante 3 min a 37 °C e 5% de CO2.</li>
		<li>Centrifugue a 400 x g por 5 min para obter um pellet de célula. Ressuspenda em meio, conforme especificado para as aplicações descritas nas etapas subsequentes (consulte as etapas 4.1, 5.1 e 6.1) e passe por um filtro de células de 70 μm.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Citometria de fluxo (FC) e classificação de células ativadas por fluorescência (FACS)
<ol>
	<li>Incubar suspensões celulares (1 x 105 células em 200 μL de PBS contendo 3% de FBS) com anticorpos primários conjugados com fluoróforo (FITC ou APC) (ou seja, CD49f, Cx43, TRA-1-85, HLA-A, HLA-G e SIRPA para FC ou TRA-1-85 para FACS; 1:40) a 4 ° C por 30 min, protegidos da luz.</li>
	<li>Centrifugar (400 x g, 5 min) e ressuspender as células em 1 mL de PBS com 3% de FBS para FC ou PBS com 0,5% de FBS para FACS. 
	NOTA: A FC das MSCs foi otimizada por Hong et al.41.</li>
	<li>Manter as células a 4 °C no escuro até que estejam prontas para serem analisadas por FC (pelo menos 1 x 104 eventos) ou FACS. Classifique as células conforme descrito41. Recoloque as células classificadas TRA-1-85 de alta positividade em placas de 6 poços (1 x 10,4 células/poço, 2 mL de DMEM-F12 contendo 10% de FBS e 1% de P/S) dentro de 1 h. 
	NOTA: Para a estratégia de gating do antígeno de superfície celular humana TRA-1-85, consulte a Figura Suplementar.</li>
</ol>
5. Imunocitoquímica (ICC) e Microscopia
<ol>
	<li>Recoloque as suspensões celulares obtidas das coculturas (etapa 3.5.2) ou FACS (seção 4) em lâminas de câmara (1 x 104 células/poço, 2 mL de DMEM-F12 contendo 10% de FBS e 1% P/S por poço). Deixe as células se fixarem durante a noite em uma incubadora de cultura de tecidos (consulte a seção 1 para as condições).</li>
	<li>Fixe as células usando 3 mL de paraformaldeído a 4% (PFA) em PBS por 15 min em temperatura ambiente. Lavar 3 vezes com 3 mL de PBS contendo 1% de albumina de soro bovino (BSA; PBS-BSA) por 5 min por lavagem. 
	Cuidado: Use equipamento de proteção individual adequado ao manusear o PFA.</li>
	<li>Permeabilize as células em 3 mL de PBS-BSA com 0,1% de Triton X-100. Incubar em temperatura ambiente por 10 min para antígenos intracelulares (ou seja, actinina alfa sarcomérica (aSarc) e Cx43) ou 25 min para antígenos intranucleares (ou seja, Mef2c e antígeno nuclear humano (HuNu)). Lave 3 vezes com 3 mL de PBS-BSA por 5 min por lavagem.</li>
	<li>Bloqueie as amostras contra reações de anticorpos não específicos com 3 mL de PBS contendo 5% de soro de cabra normal (NGS) e 1% de BSA por 15 min em temperatura ambiente. Lave 3 vezes com 3 mL de PBS-BSA por 5 min por lavagem.</li>
	<li>Incubar as células nos anticorpos primários (ou seja, Mef2c, aSarc, Cx43 e HuNu) diluídas a 1:200 em 3 mL de PBS-BSA a 4 °C durante a noite.</li>
	<li>Lave 3 vezes com 3 mL de PBS-BSA por 5 min por lavagem e incube com anticorpos secundários por 30 min em temperatura ambiente. Lave 3 vezes com 3 mL de PBS-BSA por 5 min por lavagem.</li>
	<li>Armazene as amostras coradas em 3 mL de meio de montagem.</li>
	<li>Adquira imagens usando um microscópio de fluorescência. Use uma objetiva de 10X (NA = 0,3) e uma objetiva de 20X (NA = 0,45) para imagens de menor ampliação. Use cubos de filtro de fluorescência e comprimentos de onda para GFP (ex = 470/22 nm, em = 525/50 nm) e RFP (ex = 531/40 nm, em = 593/40 nm) para os anticorpos secundários usados (consulte a Tabela de Materiais e Equipamentos).</li>
	<li>Quantifique as imagens usando software de imagem (consulte a Tabela de Materiais e Equipamentos para obter o software recomendado). Normalize as leituras de intensidade de fluorescência para as aquisições de controle secundário.</li>
</ol>
6. Isolamento de RNA e RT-PCR quantitativo
<ol>
	<li>Prepare amostras de RNA de culturas de MSC indiferenciadas ou MSCs classificadas de co-culturas usando isolamento de RNA baseado em coluna, de acordo com as instruções do fabricante. Prepare 1 x 104 a 1 x 106 células em 0,7 mL de tampão de lise celular (fornecido com o kit de isolamento de RNA) por amostra.</li>
	<li>Prepare o cDNA de até 2 μg de RNA por reação de RT de 100 μL.</li>
	<li>Realize qPCR usando 10 ng de cDNA por reação (40 ciclos, temperatura de recozimento/extensão de 60 °C).
	<ol>
		<li>Use primers para MY6H e cTnT humanos em uma concentração de 500 nM e 1-100 ng de cDNA por reação (consulte a Tabela de Materiais e Equipamentos). Use GAPDH, ACTB e HPRT como normalizadores internos de manutenção. Use cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos comercialmente disponíveis como controle positivo. 
		NOTA: Expresse a mudança de dobra da expressão em comparação com amostras indiferenciadas de cDNA derivadas de MSC.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Dr. Clifford L. Librach é co-titular da patente: métodos de isolamento e o uso de células derivadas de tecido de cordão umbilical do primeiro trimestre, concedido no Canadá e Austrália.

A diferenciação cardíaca de células-tronco tem sido sob desenvolvimento por mais de 2 décadas, com várias estratégias diferentes, sendo usadas para gerar células casos de fontes MSC. Muitas destas estratégias, no entanto, são ineficientes, e as condições usadas frequentemente não são representativas do ambiente transplantada células encontro na vivo.
Em contraste com os métodos existentes, o protocolo aqui apresentado utiliza uma combinação de camadas de alimentador cardíaca primária ...

Insuficiência cardíaca congestiva (ICC) persiste como das principais causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo. CHF ocorre frequentemente após a perda maciça de cardiomyocytes e o desenvolvimento do tecido de cicatriz sem célula como resultado patológico de um infarto do miocárdio (MI)1. Enquanto o coração é um órgão parcialmente auto renovadora, a residente tronco progenitoras célula piscina e responsável pela execução de regeneração tecidual significativamente diminui em abundância e função em pacientes idosos, muitas vezes tornando-se insuficiente para a recuperação ideal após a lesão. Assim, há grande interesse no desenvolvimento de tratamentos experimentais que envolvem o transplante de células de doadores saudáveis para o miocárdio danificado. É imperativo que as células do doador não só restaurar a estrutura do tecido, mas também alcançar a recuperação funcional do miocárdio afetado.
O coração nativo emprega coração tecido-residente e endógenas células-tronco da medula óssea-originou para pós-lesão reparar2,3,4. Regenerativa células-host e doador derivada de iguais, deve ter a capacidade de obter o fenótipo apropriado e a função do microambiente do miocárdio remodelação, juntamente com a capacidade de forma eficiente e segura a substituir as células perdidas. Métodos de diferenciação in vitro têm sido amplamente utilizados para alcançar alta eficiência, com base em células estaminais casos produção5,6. O perfil de expressão de marcadores de linhagem cardíaca é usado para definir o processo de diferenciação de células-tronco para a linhagem cardíaca7. Início diferenciação marcadores, tais como NKX2.5, factor potenciador de miócito 2C (Mef2c) e GATA48,9, podem ser uma indicação do início do processo de cardiomyogenic. Marcadores de casos maduro, comumente usados para avaliar a eficácia de diferenciação são sinal proteína reguladora α (SIRPA)10, troponina cardíaca T (miocardite)11, cadeia pesada miosina cardíaca (MYH6)8,12,13e connexin 43 (Cx43)14,15,16. Os métodos usando células-tronco embrionárias (CES) e as células-tronco pluripotentes (EPS) foram cuidadosamente otimizados e discutidos sobre os detalhes de fatores indutivos, oxigênio e nutrientes gradientes e o momento exato da ação5,6,7,17,18. No entanto, ESC e PSC-com base em tecnologias ainda apresentam várias preocupações éticas e de segurança, juntamente com características eletrofisiológicas e imunológicos suboptimal19,20. Hosts transplantados com estas células frequentemente experimentam immunorejection e requerem imunossupressão permanente. Isto é principalmente devido ao descasamento de histocompatibilidade (MHC) as moléculas complexas no host e o doador e o resultante de resposta de células T21. Enquanto indivíduo MHC classe I de correspondência é uma solução possível, uma prática clínica mais acessível exigiria uma fonte de celular que é universalmente immunoprivileged superar a preocupação de rejeição.
Como uma fonte alternativa de células para uso em aplicações clínicas, MSCs e em particular, BMSCs, têm sido investigados para uso na regeneração de tecidos desde sua descrição inicial em 199522. MSCs são acreditados para ser residentes células regenerativas que podem ser encontradas em quase qualquer tecido vascularizado23. Após o isolamento da fonte desejada, MSCs podem facilmente ser expandidos na cultura, têm capacidade extensa parácrina e frequentemente possuem immunoprivileged ou imunomoduladores propriedades24,25. Sua segurança e eficácia já foram mostrados em diversos estudos pré-clínicos, em particular para regeneração cardíaca3,26.
Muitas estratégias de diferenciação de MSC utilizam agentes farmacológicos, tais como azacytidine 522 e DMSO27e crescimento ou fatores morphogenic, BMPs5,7,28,29 ou da angiotensina-II30, com eficiência variável. Estas estratégias, no entanto, não se baseiam os obstáculos que um celular regenerativa ingênuo é provável encontrar depois de hospedagens ou sendo entregue para o local da lesão in vivo. Estratégias mais fisiologicamente relevantes, embora mais difícil de definir e manipular, baseiam-se na premissa de que a diferenciação de MSC pode ser induzida através de sinais do microambiente do tecido em si. Estudos anteriores mostraram que a exposição à célula cardíaca lysates31 ou32,de miocárdio ventricular33, ou direto contato com cardiomyocytes primária em vitro15,34, pode aumentar a expressão dos marcadores cardíacos no MSCs. Outros demonstraram cardiomyogenesis espontânea após o tratamento de lesões cardíacas com MSCs35,36,37,38, embora em parte, a fusão de BMSCs e cardiomyocytes39,40 gerado o miocárdio nascente. A nosso conhecimento, funcionais, espontaneamente contratantes cardiomyocytes do MSCs humanas (hMSCs) de qualquer fonte de tecidos ainda não foram relatados.
O consenso atual é que todos os MSCs surgem a partir de células perivasculares23. Young MSCs com Pericito propriedades podem ser isolados da região perivascular de4342,41,do tecido humano do cordão umbilical. Em comparação com BMSCs, HUCPVCs possuem potencial maior diferenciação e várias outras vantagens regenerativas, ambos em vitro41,44 e na vivo45,46,47. Notavelmente, a fonte, sendo a interface materno-fetal, HUCPVCs têm significativamente mais baixa imunogenicidade em comparação com adultas fontes do MSCs. Nossa pesquisa centra-se na caracterização e aplicações pré-clínicas de FTM HUCPVCs, a mais nova fonte de MSCs investigados, que mostramos anteriormente ter aumentado multilineage proliferativa e maior capacidade de diferenciação, incluindo a linhagem de cardiomyogenic41.
Aqui, apresentamos um protocolo que combina a formação de agregados e camadas de alimentador primário de células cardíacas como indutivas forças para alcançar a diferenciação de cardiomyogenic completa de MSCs. agregados fornecem um ambiente 3D, que modela melhor condições em vivo em comparação com as culturas aderentes 2D. Utilizar camadas cardíacas alimentador fornece um ambiente que é representante do site do transplante final para os MSCs. Demonstramos que fontes mais jovens de MSCs isoladas de cordões umbilicais de pré ou pós-natal têm uma maior capacidade para agregados de forma e atingir o fenótipo cardíaco em comparação com BMSCs adultos, mantendo ainda o seu privilégio imunológico. Além da elevação íngreme de genes marcadores de linhagem cardíaca e a expressão induzida de intracelular (i.e., miocardite e MYH6) e as proteínas da pilha-superfície (i.e., SIRPA e Cx43) específicos para cardiomyocytes, mostramos que o potencial de diferenciação da FTM HUCPVCs pode ser aproveitado com esse método e que eles podem dar origem a contratantes espontaneamente células casos.

<table><tbody><tr><td>0,25% Trypsin / EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>para dissociação celular</td></tr><tr><td>Alpha-MEM</td><td>Gibco</td><td>12571071</td><td>para meios de cultura HUCPVC e BMSC.</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-humano/camundongo conjugado com PE CD49f</td><td>Marcador de</td><td>integrina</td>Biolegend <td>313612</td> para</tr><tr><td>anticorpo humano Cx43/GJA1 conjugado com FC APC</td><td>R& D Systems</td><td>FAB7737A</td><td>marcador de conexina 43 para anticorpo</td></tr><tr><td>HLA-A2 conjugado com FC FITC</td><td>Genway Biotech Inc.</td><td>GWB-66FBD2</td><td>Marcador de imunogenicidade para</td></tr><tr><td>anticorpo anti-HLA-G [MEM-G/9] conjugado com FC FITC</td><td>Abcam</td><td>ab7904</td><td>Marcador de imunogenicidade para</td></tr><tr><td>anticorpo anti-SIRPA / CD172a de camundongo conjugado com FC FITC</td><td>AbD Serotec / Bio-Rad</td><td>MCA2518F</td><td>Marcador cardíaco para</td></tr><tr><td>anticorpo humano TRA-1-85 / CD147 conjugado com FC APC</td><td>R & D Systems</td><td>FAB3195A</td><td>Marcador de células humanas para anticorpos</td></tr><tr><td>TRA-1-85/CD147 humanos conjugados</td> com FC e FACS <td>FITC R& D Systems</td><td>FAB3195F</td><td>Marcador de células humanas para anticorpo FC e FACS</td></tr><tr><td>Anti-conexina 43 / GJA1</td><td>Abcam</td><td>ab11370</td><td>Cx43. Para anticorpo</td></tr><tr><td>secundário de absorção cruzada IgG (H+L) anti-coelho de cabra ICC, Alexa Fluor 555</td><td>Life Technologies</td><td>A-21428</td><td>Para anticorpo ICC</td></tr><tr><td>anti-sarcomérico alfa actinina [EA-53]</td><td>Abcam</td><td>ab9465</td><td>aSARC. Para o</td></tr><tr><td>anticorpo secundário de absorção cruzada de cadeia pesada IgM anti-rato de cabra ICC, Alexa Fluor 555</td><td>Life Technologies</td><td>A-21426</td><td>Para ICC</td></tr><tr><td>Mef2C (D80C1) XP anticorpo de coelho</td><td>New England BioLabs Ltd.</td><td>5030S</td><td>Para anticorpo</td></tr><tr><td>secundário IgG (H+L) anti-coelho ICC Donkey, Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A-21206</td><td>Para anticorpo ICC</td></tr><tr><td>Anti-núcleos (HuNu) (clone 235-1)</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB1281</td><td>Para estereomicroscópio ICC</td></tr><tr><td>MZ9.5</td><td>Leica</td><td></td><td>Para agregados de imagem.</td></tr><tr><td>Microtubos de centrífuga de 1,5 ml</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td>Para coloração de MSCs com corante fluorescente.</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>Software de processamento de imagem de código aberto.</td></tr><tr><td>Aria II&nbsp;</td><td></td><td>Instalação BD</td><td>UHN SickKids FC. Para classificação de células.</td></tr><tr><td>Células estromais mesequimais da medula óssea</td><td>Lonza</td><td>PT-2501</td><td>BMSCs</td></tr><tr><td>Albumina sérica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030-100G</td><td>BSA. Para preparar soluções para ICC</td></tr><tr><td>BrdU</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB3424</td><td>Cuidado: BrdU é um forte teratogênico e suspeito de mutagênico. Certifique-se de um treinamento adequado e consulte o SDS antes de usar.</td></tr><tr><td>Canto II</td><td>BD</td><td></td><td>UHN SickKids FC Facility. Para citometria de fluxo.</td></tr><tr><td>cDNA EcoDry Premix</td><td>Clontech/Takara</td><td>639570</td><td>Para preparação de cDNA para qPCR</td></tr><tr><td>CellTracker Green CMFDA Dye</td><td>Life Technologies</td><td>C7025</td><td>Imagem fluorescente do citoplasma celular</td></tr><tr><td>Contador de células automatizado Countess</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>C10227</td><td>Para contagem de células</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6421</td><td>Para meio de cultura de cardiomiócitos primários de ratos.</td></tr><tr><td>Gibco de solução salina tamponada com fosfato da Dulbecco</td><td></td><td>10010023</td><td>D-PBS, sem Ca2+, Mg2+</td></tr><tr><td>EVOS</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Microscópio fluorescente interno</td></tr><tr><td>FACSCalibur</td><td>BD</td><td></td><td>Interno. Para citometria de fluxo.</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (Hyclone)</td><td>GE Healthcare</td><td>SH3039603</td><td>FBS. Componente do meio de cultura celular.</td></tr><tr><td>Sondas de qPCR IDT Prime Time</td> Tecnologias <td>de Dados Integradas</td><td>FAM fluoróforo</td><td>http://www.idtdna.com/pages/products/gene-expression/primetime-qpcr-assays-and-primers</td></tr><tr><td>Lab Vision PermaFluor Meio de Montagem Aquosa</td><td>ThermoScientific</td><td>TA-030-FM</td><td>Para armazenamento de células a serem submetidas a ICC</td></tr><tr><td>LSR II&nbsp;</td><td></td><td>Instalação BD</td><td>UHN SickKids FC. Para citometria de fluxo.</td></tr><tr><td>MoFlo Astrios</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>UHN SickKids FC Instalação. Para classificação de células.</td></tr><tr><td>Tecnologia de sinalização celular</td> <td>de soro de cabra normal</td><td>5425S</td><td>NGS. Usado na solução de bloqueio para a</td></tr><tr><td>lamínula da câmara ICC Nunc Lab-Tek II, 8 poços</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>155409</td><td>Para preparar amostras para o</td></tr><tr><td>surfactante ICC OmniPur Triton X-100</td><td>EMD Millipore</td><td>9410-OP</td><td>Como um componente da solução permeabilizante ao preparar células para</td></tr><tr><td>ICC Paraformaldeído, solução a 16%,</td><td>ciências de microscopia eletrônica</td> de grau EM <td>15710</td><td>Para fixar células para ICC.</td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Componente do meio de cultura celular.</td></tr><tr><td>Primers</td><td>Sigma</td><td>Custom Standard DNA Oligos, Dessalinizado, 0.2 &mu; mol</td><td>CTnT_F: GGC AGC GGA AGA GGA TGC TGA A; CTnT_R: GAG GCA CCA AGT TGG GCA TGA ACG A; MYH6 F: GCA AAG TAC TGG ATG ACA CGC T; MYH6 R: GTC ATT GCT GAA ACC GAG AAT G</td></tr><tr><td>Quorum Spinning Disk Confocal</td><td>Zeiss</td><td></td><td>SickKids Imaging Facility</td></tr><tr><td>ReproCardio Cardiomiócitos derivados de células hiPS</td><td>ReproCell</td><td>RCD001N</td><td>Controle positivo para qPCR</td></tr><tr><td>RNeasy mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td>Para isolar RNA para qPCR</td></tr><tr><td>Rotor-Gene SYBR Green PCR Kit</td><td>Qiagen</td><td>204074</td><td>Para qPCR com master mix</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>A1049101</td><td>Para MSC, meio de cocultura de monócitos.</td></tr><tr><td>Ensaios de primer TaqMan qPCR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4444556</td><td>para qPCR</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Life Technologies</td><td>T10282</td><td>Coloração de células para viabilidade e contagem</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>272500108</td><td>Para dissociação celular</td></tr><tr><td>Volocidade</td><td>Perkin-Elmer</td><td>Volocidade 6.3</td><td>Software de imagem</td></tr><tr><td>0.2 &mu; filtro de poros m</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>566-0020</td><td>Para esterilizar meios de cultura de tecidos</td></tr><tr><td>HERAcell 150i CO2 Incubadora</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51026410</td><td>Para incubação de células</td></tr><tr><td>Dulbecco's fosfato tamponado salino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>PBS. 1X, Sem cloreto de cálcio e cloreto de magnésio</td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>Almedic</td><td>7727- A10-704</td><td>Para entregar coração de rato. Pode usar qualquer fórceps semelhante.</td></tr><tr><td>Tesoura</td><td>Fine Science Tools</td><td>14059-11</td><td>Para picar coração de rato. Tesouras curvas recomendadas.</td></tr><tr><td>Tubo de 50 mL</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>Para coleta durante a coleta de cardiomiócitos e procedimentos gerais de cultura de tecidos Tubo de</td></tr><tr><td>15 mL</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td>Para procedimentos gerais de cultura</td></tr><tr><td>de tecidos Placas de 6 poços</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>CA73520-906</td><td>Para cultura de</td></tr><tr><td>tecidos Placas de cultura de tecidos de 10 cm</td><td>Corning</td><td>25382-428</td><td>Para formação de agregados</td></tr><tr><td>Microscópio Axiovert 40C</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Para imagens de campo claro através da cultura de tecidos e do resto do protocolo</td></tr><tr><td>70 &mu; filtro de células m</td><td>Fisherbrand</td><td>22363548</td><td>Para garantir uma suspensão de célula única antes da citometria de fluxo ou classificação</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>EMD Millipore</td><td>9410-1L</td><td>Usado na solução de permeabilização para ICC</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H1399</td><td>Mancha usada durante a visualização da localização Cx43</td></tr></tbody></table>

in vitro diferenciação de células-tronco mesenquimais humanas em células casos funcionais

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

Infarto do miocárdio e a subsequente cascata isquêmica resultam na perda extensa de cardiomyocytes, levando à insuficiência cardíaca congestiva, a principal causa de mortalidade em todo o mundo. Células-tronco mesenquimais (MSCs) são uma opção promissora das terapias baseadas em células substituir as técnicas atuais, invasivas. MSCs podem diferenciar em linhagens mesenquimais, incluindo tipos de células cardíacas, mas completa diferenciação em células funcionais ainda não foi alcançada. Métodos anteriores de diferenciação foram baseados em agentes farmacológicos ou fatores de crescimento. No entanto, estratégias mais fisiologicamente relevantes também podem habilitar o MSCs submeter-se a transformação do cardiomyogenic. Aqui, apresentamos um método de diferenciação usando MSC agregados em camadas de alimentador de casos para produzir células contratantes casos.
Cordão humano perivasculares células (HUCPVCs) foram mostradas para ter uma maior diferenciação potencial do que comumente investigados tipos MSC, tais como a medula óssea MSCs (BMSCs). Como uma fonte de ontogenetically mais jovem, nós investigamos o potencial de cardiomyogenic de HUCPVCs de (FTM) do primeiro trimestre em comparação com as fontes mais antigas. FTM HUCPVCs são uma fonte rica, romance de MSCs que retêm suas no utero immunoprivileged Propriedades quando cultivadas em vitro. Usando este protocolo de diferenciação, FTM e termo HUCPVCs alcançado cardiomyogenic significativamente maior diferenciação em relação ao BMSCs, conforme indicado pelo aumento da expressão de marcadores de casos (ou seja, miócito factor potenciador 2C, troponina cardíaca T, cardíaco miosina de cadeia pesada, α proteína reguladora de sinal e connexin 43). Eles também mantiveram significativamente mais baixa imunogenicidade, como demonstrado pela sua menor expressão de HLA-A e HLA-G maior. Aplicação de diferenciação baseada no agregado, FTM HUCPVCs mostrou maior formação de agregados potenciais e gerado contratação aglomerados de células dentro de 1 semana de co-cultura sobre camadas cardíacas alimentador, tornando-se o primeiro tipo MSC a fazê-lo.
Nossos resultados demonstram que esta estratégia de diferenciação pode efetivamente aproveitar o potencial de cardiomyogenic da jovens MSCs, tais como FTM HUCPVCs e sugere que em vitro pre-diferenciação poderia ser uma estratégia potencial para aumentar sua eficácia regenerativa em vivo.

HUCPVCs Apresentam Maior Potencial de Formação de Agregados e Níveis de Expressão de CD49f em Comparação com BMSCs:
Para induzir a diferenciação de hMSCs (ou seja, FTM HUCPVCs, HUCPVCs do termo e BMSCs), suspensões celulares únicas de MSCs indiferenciadas ou gotas suspensas contendo MSCs (Tabela 1) foram transferidas para monocamadas de cardiomiócitos primários de rato para estabelecer ...

Aqui, apresentamos um método para eficientemente aproveitar o potencial de diferenciação cardíaca da jovens fontes de células-tronco mesenquimais humanas a fim de gerar células funcionais, contratantes, casos, como in vitro.

In Vitro Diferenciação de células-tronco mesenquimais humanas em células casos funcionais

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

O objetivo geral deste procedimento experimental é induzir e observar a indução cardiomiogênica de células-tronco mesenquimais. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área das células-tronco mesenquimais, como, quais remédios podem ser induzidos por sinais ambientais para gerar cardiomiócitos funcionais. A principal vantagem desta técnica é que ela aplica a formação de agregados e camadas cardíacas fetais, em vez de agentes farmacológicos ou material genético.As implicações dessa técnica estendem-se à terapia de doenças cardiovasculares, pois elucidam o potencial cardiomiogênico das células-tronco mesenquimais. Demonstrando este procedimento comigo estarão a Srta. Farwah Iqbal, aluna de doutorado do nosso laboratório, Max Librach e Nadav Gasner, ambos pesquisadores em treinamento no nosso laboratório. Após isolar as partes de filhotes de rato de acordo com o protocolo descrito no texto, corte os ventrículos ao meio e transfira-os para uma placa de 10 centímetros contendo 10 mililitros de PBS, mantida sobre gelo com pinças de aço, para permitir a lavagem do sangue.Em seguida, utilizando tesoura curva, corte as paredes ventriculares em pequenos pedaços com diâmetro de dois a três milímetros. Com uma pipeta serológica, transfira os fragmentos cardíacos de 10 a 12 animais para um tubo de 50 mililitros e deixe-os sedimentar. Remova o máximo possível de PBS P/S, sem remover nenhum fragmento cardíaco.Em seguida, adicione 10 milímetros de PBS P/S fresco. Para isolar os cardiomiócitos, após a sedimentação dos fragmentos cardíacos, utilize tripsina a 0,15% em PBS para substituir o PBS P/S e incube o tecido a 37 graus Celsius com agitação, durante 10 minutos. Descarte o sobrenadante.Em seguida, repita a digestão com tripsina mais três vezes, transferindo, no entanto, os sobrenadantes para tubos de coleta de 50 mililitros contendo 10 mililitros de FBS a 100%. A seguir, centrifugue os tubos com as células e aspire o sobrenadante. Então, use DMEM-F12 com 10% de FBS e 1% de P/S para ressuspender as células e semeie-as em uma placa de seis poços.Uma vez que as células tenham aderido, substitua o meio por dois mililitros de meio fresco. Para preparar MSCs pré-rotuladas, remova o meio de culturas de MSC que atingiram 70% a 80% de confluência em placas de 10 centímetros e adicione três mililitros de solução de dissociação celular. Incube as placas a 37 °C e 5% de CO₂ por cinco minutos.Transfira as células dissociadas para um tubo de 15 mililitros e centrifugue a 400 x G durante cinco minutos. Aspire o sobrenadante sem perturbar o pellet celular e re-suspenda as células. Em seguida, utilize um contador automático de células para contá-las.Dilua as células até uma concentração de 1 x 10⁶ MSCs por mililitro, em DMEM-F12 contendo 10% de FBS e 1% de P/S. Em seguida, em tubos cónicos de 1,5 mililitro contendo as células, adicione corante fluorescente viável e não transmissível e incube as MSCs por trinta minutos. Após centrifugar os tubos a 400 x g durante cinco minutos, aspire o sobrenadante e re-suspenda o pellet em uma concentração de 1 x 10⁶ MSCs por mililitro.Em seguida, transfira as CMM para os cardiomiócitos em uma concentração de 10 x 10 à quarta células por poço de uma placa de seis poços. Para criar culturas coagregadas, prepare uma suspensão simples de CMM em MEM alfa, suplementado com 10% de FBS e 1% de P/S. Inicie a formação de agregados, colocando gotas de 25 microlitros da suspensão celular na superfície interna das tampas de placas de cultura de tecidos de 10 centímetros.Coloque as tampas sobre as placas correspondentes contendo PBS P/S. Incube as placas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Sob um microscópio estereoscópico, observe a formação de agregados nas gotas após três dias.Se mais de 80% das gotas contiverem agregados formados, utilize uma micropipeta de um mililitro para coletar as gotas das tampas e transfira os agregados diretamente para monocamadas primárias de cardiomiócitos de rato. Incube as culturas co-cultivadas por até duas semanas, trocando o volume completo do meio a cada 72 horas.Diariamente, utilize microscopia de campo claro para observar agregados aderindo às camadas de células fetais. Registre os agregados contráteis quando forem observados. Os agregados ativos contraem de maneira sincronizada, o que sugere uma condução entre eles ao longo da camada fetal, a qual não apresenta atividade física.Aspire o meio e adicione dois mililitros de PBS por poço da placa de seis poços. Em seguida, remova o PBS e adicione dois mililitros de solução de dissociação por poço. Incube as placas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por três minutos.Como mostrado aqui, HMSCs de três tipos diferentes exibiram abundância e aparência semelhantes em culturas co-culturadas diretas. Dois a três dias após a transferência de gotas suspensas para células cardíacas em culturas co-culturadas em agregados, FTMs e PBCs huck termos apareceram em agregados maiores em comparação com aqueles observados em BMSCs. Neste experimento, a análise citométrica de fluxo da expressão de CD49F em MSCs indiferenciadas mostrou que 96% dos PBCs huck de FTM, 89% dos PBCs huck e 53% dos BMSCs eram positivos para a CD49F de superfície celular.A citometria de fluxo em células TRA won 85 mostrou a superexpressão do marcador associado a cardiomiócitos, SIRPA, em PBCs huck FTM e PBCs huck a termo, mas não em BMSCs provenientes de co-cultivos diretos de cardiomiócitos. Como visto aqui, a superexpressão de cx43 foi significativamente maior em PBCs huck FTM em comparação com PBCs huck a termo ou BMSCs em co-cultivos diretos. A análise por microscopia fluorescente revelou que PBCs huck FTM e a termo em diferenciação ambos superexpressaram cx43.Com PBCs do termo apresentando uma proporção maior do que as PBCs de FTM. No entanto, a microscopia de fluorescência revelou que pontos positivos para cx43 foram observados na membrana celular das PBCs de FTM, enquanto predominantemente citoplasmáticos nas células do termo. Por fim, como visto aqui, foi realizada microscopia de fluorescência de alta magnificação em células humanas classificadas, após co-cultivo, e foi confirmada a alta abundância de cx43 na membrana plasmática.Uma vez dominados, os passos principais deste procedimento podem ser realizados em uma hora cada, se forem executados corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante manter precauções assépticas. Os tecidos animais primários envolvidos podem introduzir contaminação, se não forem manipulados adequadamente.Após este procedimento, outros métodos, como o cultivo adicional de agregados contráteis, podem ser realizados para responder perguntas complementares, como a longevidade dessas estruturas. Após seu desenvolvimento, esta técnica permite que pesquisadores na área de CSMs explorem o potencial de diferenciação de fontes mais jovens de células-tronco mesenquimais, como tecidos extra-embrionários. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar agregados de CSMs e combiná-los com camadas teciduais primárias diretas fetais, de maneira que proporcione uma indução adequada para a diferenciação cardiomiogênica.Não se esqueça de que trabalhar com BRDU pode ser extremamente perigoso e precauções, como o manuseio adequado de resíduos citotóxicos, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Este vídeo demonstra como realizar a diferenciação in vitro de células-tronco embrionárias de camundongos para corpos embrióides usando o método da gota pendente.

Na diferenciação in vitro de rato-tronco embrionárias (MES) células usando o método da gota de suspensão

Nós estabelecemos um protocolo para indução de cardioblasts direta de pluripotentes células estaminais embrionárias humanas mantidas sob condições definidas com pequenas moléculas, que permite a derivação de uma grande oferta de recursos humanos progenitores cardíaca e funcional cardiovascular cardiomiócitos para reparação.

Derivação eficiente dos recursos humanos Precursores cardíaca e Cardiomyocytes pluripotentes a partir de células estaminais embrionárias humanas com a indução de moléculas pequenas

Células-tronco pluripotentes, tanto as células-tronco embrionárias ou pluripotentes induzidas (iPS), constituem uma valiosa fonte de células diferenciadas humanos, incluindo os cardiomiócitos. Aqui, vamos nos concentrar na indução cardíaco de células iPS, mostrando como usá-los para obter os cardiomiócitos humanos funcionais através de um protocolo de corpos baseada embryoid.

Geração de cardiomiócitos Humanos: Um Protocolo de Diferenciação de Feeder livres Humanos células-tronco pluripotentes induzidas

O artigo descreve a metodologia detalhada para diferenciar de forma eficiente as células estaminais pluripotentes em cardiomiócitos de modular selectivamente a via Wnt, seguido por análise de citometria de fluxo de marcadores de referência para avaliar a homogeneidade e a identidade da população.

Diferenciação de alta eficiência de pluripotentes humanas células-tronco para Cardiomyocytes e Caracterização por citometria de fluxo

Neste protocolo, será ilustrada a derivação de células progenitoras cardíacas de células-tronco embrionárias de camundongos e humanos. Uma estratégia importante neste protocolo é enriquecer as células progenitoras cardíacas com citometria de fluxo usando repórteres fluorescentes projetados nas linhagens de células-tronco embrionárias.

Derivação de Cardiac células progenitoras de células estaminais embrionárias

Aqui, descrevemos um protocolo robusto para derivação de cardiomiócitos humanos que combina diferenciação cardíaca modulada por pequenas moléculas e purificação de cardiomiócitos mediada por privação de glicose, permitindo a produção de cardiomiócitos purificados para fins de modelagem de doenças cardiovasculares e triagem de drogas.

Derivação de Cardiomyocytes altamente purificada de induzidas pelo homem pluripotentes células estaminais usando pequenos Diferenciação modulada-Molecule e Subsequente Glucose Fome

Este manuscrito descreve a criação de tecidos cardíacos projetados definidos usando expressão de marcadores de superfície e classificação celular. Os tecidos definidos podem então ser usados em um biorreator multitecido para investigar os mecanismos da terapia com células cardíacas, a fim de fornecer um sistema modelo funcional, mas controlado, do coração humano.

Construção de Engineered Definido cardíaca humana Tecidos para estudar os mecanismos da terapia celular cardíaca

A geração de cardiomiócitos a partir de células-tronco pluripotentes in vitro permite o acesso a grandes quantidades de tecido cardíaco in vitro para ciência básica e aplicações clínicas.  Este protocolo utiliza o fator atrializante Grem2 tanto para aumentar o número de cardiomiócitos obtidos quanto para gerar cardiomiócitos com fenótipo atrial.

Diferenciação de Atrial Cardiomyocytes de células-tronco pluripotentes Usando o BMP Antagonista Grem2

A caracterização eletrofisiológica de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC-CMs) é crucial para a modelagem de doenças cardíacas e para a determinação de respostas de fármacos. Este protocolo fornece as informações necessárias para dissociar e plaquear hPSC-CMs em matrizes de múltiplos eléctrodos, medir o seu potencial de campo e um método para analisar os intervalos QT e RR.

Análise eletrofisiológica de cardiomiócitos humanos derivados de células-tronco pluripotentes (hPSC-CMs) usando matrizes de múltiplos eletrodos (MEAs)

Aqui descrevemos e validamos um método para gerar consistentemente cardiomiócitos pluripotentes derivados de células-tronco induzidas por humanos robustos e caracterizar sua função. Essas técnicas podem ajudar no desenvolvimento de insights mecanicistas sobre as vias de sinalização, fornecer uma plataforma para o rastreamento de medicamentos em larga escala e doenças cardíacas de modelo confiável.

Geração de cardiomiócitos derivados de HiPSC semelhantes ao Ventricular e preparações celulares de alta qualidade para caracterização de manuseio de cálcio

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar e expandir robustamente os cardiomiócitos humanos a partir de células mononucleares de sangue periféricos do paciente.

Geração e Expansão de Cardiomiócitos Humanos a partir de células mononucleares de sangue periféricos do paciente

Aprenda a diferenciação cardiomiogênica de células-tronco mesenquimais humanas em células funcionais usando sinais ambientais e formação de agregados. Este método oferece uma alternativa viável às abordagens farmacológicas para terapia cardiovascular.

In Vitro Diferenciação de células-tronco mesenquimais humanas em células casos funcionais

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