Name: Efeitos de alogênico Plasma rico em plaquetas (PRP) sobre o processo de cicatrização dos tendões de Aquiles seccionados de ratos: uma descrição metodológica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Aprenda a avaliar a cicatrização tendínea em ratos após injeção de plasma rico em plaquetas (PRP) no tendão de Aquiles. Este método padronizado permite analisar a resistência mecânica e os efeitos terapêuticos em diferentes tempos.

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Este estudo foi suportado pelo Standard de Liège e Lejeune - Lechien concede dos fundos Leon Frédéricq.

Cuidados e tratamento dos animais foram realizados em conformidade com o guia para o cuidado e uso de animais de laboratório preparado pela Academia Nacional de Ciências e publicado pelos institutos nacionais de saúde (EUA). Legislação europeia e nacional foram seguidas com cuidado.
1. preparação animal
<ol><li>Use 132 ratos Sprague-Dawley machos 2 - meses de idade pesando 320-450 g (120 ratos para experimentação) e 12 ratos para amostragem de sangue, Figura 1. Com base na Dell13, 15 ratos para cada grupo foi o suficiente para uma potência de 0.8 (80% de chance de encontrar significância estatística, se existir o efeito especificado).</li>
	<li>Todos os ratos em gaiolas clássicas em condições de isolamento em uma instalação convencional equipado com uma estação de mudança de casa. Instigar a reprodução em um rack IVC (gaiola ventilada individualmente), com ratos SPF (livre de patógenos específicos) especificamente ser comprados.</li>
	<li>Use as seguintes condições de habitação: escala de temperatura de 19-24 ° C; umidade relativa: 40-60%; ventilação: frequência de renovação de ar: 10-15 por h; o ciclo claro/escuro: 12 h - 12 h.</li>
	<li>Esterilizar todos os equipamentos de enjaulamento e usar roupa de cama irradiada. Sistemicamente implemente o enriquecimento de gaiola, colocando toalhas e bandejas de papelão estéril dentro de jaulas.</li>
	<li>Permitir o acesso à zona sob condições restritas: chapéu casaco, máscara, luvas, calçados e cabelo do novo laboratório na entrada.</li>
	<li>Realizar monitoramento de integridade de colônia na sentinela animais alojados na roupa de cama suja numa base anual, de acordo com as recomendações de14 Felasa para instalações convencionais. Manter animais de quatro a cinco por gaiola, com o apropriado irradiados e fornecem dieta acidificadas água ad libitum. Monitore diariamente.</li>
	<li>Transferência de ratos eleitos para intervenção cirúrgica na filtragem superiores gaiolas para as salas cirúrgicas 2 h antes da cirurgia.</li>
</ol>2. ato cirúrgico
<ol><li>Preparar os instrumentos cirúrgicos: finas tesoura, uma pinça, duas Pinças hemostáticas e um porta-agulha. Durante todos os procedimentos, use luvas, máscara, uma capa e um jaleco.</li>
	<li>Aleatoriamente, divida os ratos em dois grupos (PRP e solução salina).</li>
	<li>Leve o rato sair da jaula e pesá-lo. Use marcas auriculares numerada para identificar os ratos. Para evitar a dessecação dos olhos, coloque gotas de água sobre a córnea.</li>
	<li>Anestesia o rato intraperitonealmente com xilazina (10mg/kg de peso corporal) e cetamina (80 mg/kg de peso corporal). Para confirmar anesthetization, coloque os animais sob monitorização cardio-respiratória e verificar se há quaisquer reflexos do olho.</li>
	<li>Injetar 50 µ l de buprenorfina por via subcutânea (0,01-0,05 mg/kg cada 8-12 h) na área do pescoço como um analgésico.</li>
	<li>O membro posterior esquerdo a barba com um barbeador elétrico, desinfectá-la com 3 alternando uniforme de solução de álcool/iso-betadine (diluídos 01:10) e coloque o rato sobre uma almofada quente (20 ° C) sob um microscópio de dissecação. Coloque o rato em decúbito lateral com a perna a ser operado em uma posição superior. Segure a pata com pinça cirúrgica.</li>
	<li>Usando a tesoura, faça uma pequena incisão lateral (20-25 mm) na pele ao redor do tendão de Aquiles esquerdo e dissecar a fáscia usando tesouras bem para expor o tendão de Aquiles complexo (Figura 2a).</li>
	<li>Retire o tendão plantar com uma tesoura (Figura 2b).</li>
	<li>Cortar o tendão de Aquiles transversalmente 5mm proximais à sua inserção no calcâneo e remover a porção longa de 5 mm, usando uma tesoura. Não sutura do tendão (Figura 2C, 2d).</li>
	<li>A fáscia e, em seguida, a pele da sutura com fios absorvíveis, fazendo uma sutura overjet (sutura contínua). Suturas monofilamento podem ser usadas também para evitar a absorção da pele para a incisão cirúrgica.</li>
	<li>Coloque o rato sob uma lâmpada de aquecimento até acordado e, em seguida, coloque o rato em uma gaiola (58 x 38 cm) (Nota bene: não imobilização é imposta).</li>
</ol>3. PRP preparação15
<ol><li>Anestesia os ratos de doador com xilazina (10mg/kg de peso corporal) e cetamina (80 mg/kg de peso corporal) por injeção intraperitoneal. A injeção de PRP é realizada por 2 h no pós-operatório sem qualquer re-anestésico.</li>
	<li>Injecte por via subcutânea 50 µ l de buprenorfina como um analgésico.</li>
	<li>Colher o sangue total (20 mL por rato, sangramento final) por punção cardíaca em tubos estéreis contendo 3,2% tamponada de citrato de sódio (0,109 M, anticoagulante). Então eutanásia o rato por Injeção intracardíaca.</li>
	<li>Para obter o PRP, centrifugar o sangue durante 10 minutos a 150 x g e temperatura de quarto. Esta etapa de centrifugação inicial baixa velocidade produz duas fases distintas: uma fase inferior, que consiste de glóbulos vermelhos (hemácias) que é responsável por cerca de 80-90% do volume total e uma fase superior consistindo de plasma rico em plaquetas (PRP) (tipicamente 10-20% do sangue amostra).</li>
	<li>Delicadamente, colete o PRP (fase superior) em um tubo de plástico secundário usando uma pipeta de transferência plástica. Como a interface entre o PRP e células vermelhas do sangue está muito solta, não pipete demasiado perto para a interface. Quando tratada adequadamente, contaminar hemácias em PRP deve estar abaixo de 0,05 x 103 células / µ l. descarte a fase inferior restante e o tubo de coleta primária de sangue.</li>
	<li>Determinar o volume de PRP coletado e medir a contagem de plaquetas em um analisador de hematologia. Esses valores são necessários para os cálculos ajustar a concentração de plaquetas na próxima etapa. Uma contagem de células do sangue também é útil para avaliar o potencial de contaminação com hemácias e a concentração de glóbulos brancos. plaquetas no PRP nesta fase é tipicamente 1-1.5 x106/µL.</li>
	<li>Realize uma segunda centrifugação do PRP durante 10 minutos a 1.000 g de x e a temperatura ambiente. Esta etapa de centrifugação de alta velocidade produz uma pelota de plaquetas solto e um sobrenadante consistindo de autólogo plasma pobre em plaquetas (PPP). Usando os valores determinados no passo 3.6, calcular o volume de sobrenadante para ser Descartado para concentrar o PRP e chegar a uma concentração final de 2.5 x106/µL.</li>
	<li>Delicadamente, recolha o sobrenadante (PPP) em um tubo de plástico secundário usando uma pipeta de transferência plástica, deixando cerca de dois terços do volume final calculado na etapa 3.7. Como a pelota é solta, uma quantidade significativa de plaquetas é perdida quando PPP é descartada, portanto, potencialmente reduzindo a concentração final desejada.</li>
	<li>Cuidadosamente resuspenda o pellet de plaquetas com o restante sobrenadante por pipetagem repetidas suave. Medir a contagem de plaquetas no PRP concentrado. Se necessário, adicione o volume apropriado de PPP autólogo para atingir a concentração alvo final. Nota: Use o PRP até 3 horas após preparação.</li>
	<li>Adicionar 50 µ l de CaCl2 (11 mEq 10ml) por mL de PRP para ativar as plaquetas.</li>
	<li>Injete 50 µ l de PRP fresco ou solução salina com uma agulha 21G diretamente no local da operação suturado cerca de 1h após a preparação. Durante este tempo, manter o PRP em temperatura ambiente.</li>
	<li>Acompanhar a recuperação funcional dos ratos de perto durante os dias após a cirurgia e antes da remoção do tendão de Aquiles.</li>
</ol>4. remoção do tendão de Aquiles e testes biomecânicos16
<ol><li>5, 15 ou 30 dias depois5, pesar o rato. Em seguida, anestesiamos com xilazina (10mg/kg de peso corporal) e cetamina (80 mg/kg de peso corporal) por injeção intraperitoneal.</li>
	<li>Injecte por via subcutânea 50 µ l de buprenorfina como um analgésico. Retire o tendão antes de sacrificar o animal para manter as condições fisiológicas para contanto que possível.</li>
	<li>Raspar o membro posterior esquerdo e colocar o rato sob um microscópio de dissecação. Coloque o rato em decúbito lateral com a perna a ser operado em uma posição superior. Segure a pata com os dedos.</li>
	<li>Faça uma pequena incisão (10 mm) no site da operação anterior e estender até a suralis de tríceps é exposta.</li>
	<li>Para remover o tendão de Aquiles a cura, corte o osso calcâneo transversalmente de 5-10 mm distal para sua fixação do tendão de Aquiles. Então disse uma parte do tríceps suralis, que é anexado ao tendão de Aquiles (Figura 3b). A parte do músculo tem que ser grande o suficiente para caber na cryo-mandíbula (Figura 3 c-d). Colocar a amostra imediatamente para o cryo-mandíbula usando fórceps (Figura 3e).</li>
	<li>Depois de remover o complexo músculo-tendão-osso, eutanásia o rato por Injeção intracardíaca com Nembutal (200 mg/kg). Confirme a morte, avaliando a ausência de ritmo cardíaco e a respiração durante 15 min.</li>
	<li>Coloque a unidade do músculo na mandíbula superior (Figura 3e), fechá-lo e colocá-lo verticalmente em uma máquina de teste de universal (106,2 kN, Figura 3a). Em seguida fixe o osso entre as pinças inferiores da máquina (Figura 3f).</li>
	<li>Adicione nitrogênio líquido em ambas as bacias do maxilar superior para congelar o músculo, que é uma ordem de magnitude mais duro que o tendão e não se deforma durante o ensaio de tracção.</li>
	<li>Quando a zona de congela atinge a borda da braçadeira de metal, começa o ensaio de tracção, o tendão vai preservar a sua estrutura. Defina a taxa de deslocamento da máquina a uma velocidade constante de 1 mm/s até a ruptura. Grave a resistência à tração (UTS) dada em Newtons (N) em um computador.</li>
	<li>Para calcular a área de seção transversal, coloque duas câmeras perpendiculares uns aos outros, formando uma forma elíptica e tirar fotos.</li>
	<li>Para compensar a diferença de área transversal dos tendões curativas, normalize as UTS para uma unidade de área (N por milímetro quadrado), que representa o esforço mecânico experimentado pelo tecido.</li>
</ol>5. histológica análise
Nota: 15 tendões de cada grupo foram submetidos a análise histológica.
<ol><li>Após sua remoção, mergulhe imediatamente em paraformaldeído 4%, para preservar a sua estrutura, o tendão de Aquiles (1mm de tecido é fixado por hora, então o tempo de fixação varia de acordo com o tamanho do tendão).</li>
	<li>Substituir o paraformaldeído por etanol a 70% e deixar a amostra pelo menos uma noite nesta solução.</li>
	<li>Coloque o tendão em um pequeno recipiente de plástico com furos e coloque o recipiente em uma solução de etanol 70% fresca por 1h.</li>
	<li>Coloque o recipiente em etanol a 95% por 1 h. repetir.</li>
	<li>Coloque o recipiente em etanol 100% para 1 h. repetir.</li>
	<li>Coloque o recipiente em 100% de xilol por 1 h. repetir.</li>
	<li>Agora coloque o recipiente de plástico, que contém o tendão, em parafina líquida (56 ° C) e deixe durante a noite.</li>
	<li>Usando uma estação de encaixe (equipada com cera derretida, um prato quente e um prato frio), escolher um molde metálico que melhor se adapta a amostra de tecido e encha-o com parafina líquida um pouco para que a base é coberta. Nota: Oriente a amostra para obter as seções verticais no micrótomo.</li>
	<li>Quando a amostra está corretamente posicionada, encher o molde com parafina líquida e coloque-a sobre a máquina de refrigerante. Deixe arrefecer durante pelo menos 15 minutos.</li>
	<li>Retire o bloco de parafina e coloque-o no gelo pelo menos 30 min.</li>
	<li>Preparar várias lâminas de vidro limpas e lhes colocamos algumas gotas de água desionizada.</li>
	<li>No micrótomo, cortar os blocos em seções de 5 µm (só uso seções da parte média do tendão) e colocar a seção em um slide.</li>
	<li>Coloque os slides em um forno de aquecimento a 65 ° C por vários minutos, para que a parafina só começa a derreter para unir o tecido para o vidro.</li>
	<li>Coloque os slides contendo cortes de parafina em um suporte de fatia.</li>
	<li>Agora deparaffinize e Re-hidratar o tecido, colocando-o nos seguintes banhos sucessivos: 8 min em xilol (banho 1) 4 min em xilol (2 de banho) 2 min em etanol 100% 2 min em etanol a 95% 2 min em etanol a 70% 2 min em água desionizada</li>
	<li>Para coloração de hematoxilina-eosina, coloque o tecido nas seguintes soluções.<ol>
<li>Mergulhe o tecido durante 8 min em solução de hematoxilina (monohidrato de hematoxilina de 1g, 0,2 g KIO3, 50g AIK (SO4)2.12h2O; glicerina 200ml; ajustar para 1 L com água destilada).</li>
		<li>Mergulhe o tecido durante 8 min sob água corrente.</li>
		<li>Mergulhe o tecido por 30 s em solução de eosina (eosina 0,25% em 100 mL de água destilada contendo 200 µ l de não diluída de ácido acético).</li>
		<li>Mergulhe o tecido por 2 min sob água corrente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para coloração tricromo de Masson, siga estas etapas.<ol>
<li>Após a reidratação, colocar as seções em um recipiente com alúmen de ferro (0,5 g (NH4) Fe (SO4)2.12h2O em 10 mL de H2O) e feche o recipiente. Aqueça-o por 3 min em 280 W em um microondas.</li>
		<li>Deixe esfriar por um minuto e em seguida, enxágue-o com água desionizada.</li>
		<li>Colocar as seções em um recipiente fechado com solução de hematoxilina de Regaud (hematoxilina de 0,5 g dissolvida em 50 mL de H2O a 50 ° C, em seguida, adicione 5 mL de etanol 95% e glicerina 5 mL), aquecê-lo por 90 s em 280 w.</li>
		<li>Enxágue com água desionizada.</li>
		<li>Colocar as seções em uma solução de ácido pícrico (a saturação em metanol) por 3 min, enxaguar por 5 min sob água corrente e coloque-o em água desionizada durante alguns segundos.</li>
		<li>Agora, colocar as seções em fucsina ácida (0,5 g em 50 mL de H2O contendo 0,25 mL de ácido acético diluído) durante 5 segundos e enxaguar sob água corrente até que a tinta desapareça.</li>
		<li>Incubar as secções em solução de ácido fosfomolíbdico (0,5 g em 50 mL de H2O) por 5 min, coloque-o por alguns segundos em água desionizada.</li>
		<li>Colocar as seções em solução de luz verde (0,5 g em 50 mL de H2O contendo 0,25 mL de ácido acético diluído) por mais 5 minutos e coloque-o sob água corrente até que a tinta desapareça.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Agora desidrate o tecido novamente.<ol>
<li>Mergulhe a seção por 1 min em etanol a 70%.</li>
		<li>Mergulhe a seção por 1 min em etanol a 95%.</li>
		<li>Mergulhe a seção por 1 min em 100% de etanol.</li>
		<li>Mergulhe a seção por 1 min em xilol (banho 1).</li>
		<li>Mergulhe a seção por 1 min em xilol (2 de banho).</li>
		<li>Remova as seções sem retirar demais xileno e coloque uma gota de meio de montagem na amostra.</li>
		<li>Colocar uma lamela por cima (sem provocar quaisquer bolhas) e deixe endurecer pelo menos 2 h.</li>
		<li>Hidrolisar 5 cortes histológicos (cada um de um tendão diferente) de cada grupo em 6 N HCl para 3h e determinar a concentração de colágeno medindo hidroxiprolina como um índice em 5 seções µm inocente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Normalize os resultados por área de seção utilizando o software do fabricante.</li>
	<li>Mancha de algumas seções com luz verde mancha para visualizar e quantificar fibrillar colágeno por análise de computador assistida.</li>
	<li>Digitalizar as seções e converter as fotos em nuances de cinza usando o software IrfanView. Use o software para quantificação semi (por exemplo, uma quantidade).</li>
</ol>6. molecular avaliação
<ol><li>Após a ruptura do tendão, que ocorre durante o ensaio mecânico, tirar as amostras, snap congelá-los em nitrogênio líquido e armazená-los no-80 ° C (PRP e solução salina)17.</li>
	<li>Use um kit de RNA Total comercial para isolar de RNA total17.</li>
	<li>Medir a expressão de colágeno (Col I e III Col), matriz metaloproteinases (MMP-2, MMP-3 e MMP-9) e tenomodulin (TNMD) por RT-PCR17,18.</li>
	<li>Normalize os níveis de expressão de RNAm para os níveis de 28S19.</li>
</ol>

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<li>Woodall, J., Tucci, M., Mishra, A., Benghuzzi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+effects+of+platelet+rich+plasma%3A+a+study+on+HL-60+macrophage-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Sci.+Instrum%22%5BJournal%5D)">Cellular effects of platelet rich plasma: a study on HL-60 macrophage-like cells.</a> Biomed. Sci. Instrum. 43, 266-271 (2007).</li>
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<li>Mazzocca, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+positive+effects+of+different+platelet-rich+plasma+methods+on+human+muscle%2C+bone%2C+and+tendon+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Sports+Med%22%5BJournal%5D)">The positive effects of different platelet-rich plasma methods on human muscle, bone, and tendon cells.</a> Am. J. Sports Med. 40, 1742-1749 (2012).</li>
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<li>Virchenko, O., Aspenberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+can+one+platelet+injection+after+tendon+injury+lead+to+a+stronger+tendon+after+4+weeks%3F%3A+Interplay+between+early+regeneration+and+mechanical+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Orthop%22%5BJournal%5D)">How can one platelet injection after tendon injury lead to a stronger tendon after 4 weeks?: Interplay between early regeneration and mechanical stimulation.</a> Acta Orthop. 77, 806-812 (2006).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

As plaquetas são essenciais para a fase inflamatória inicial do tendão processo de cura. Quando estas plaquetas estão expostas a um tecido ou fatores que induzem a coagulação, liberam fatores de crescimento que são estocados em grânulos α. Devido a essa interação, macromoléculas da matriz extracelular são synthetized e células mesenquimais proliferam. As plaquetas também têm uma atividade quimiotáctica em células progenitoras a circulação de sangue, aumentando a angiogênese e estimulando a diferenciação celular<sup class...

Coagulação, processos inflamatórios e as funções de modulação da imunidade de plaquetas são conhecidos1. Mais recentemente, foi demonstrado que eles também têm propriedades restauradoras2,3. Na verdade, vários fatores citocinas e crescimento (VEGF, PDGF, TGF-B e IGF-I e HGF) são liberados pelas plaquetas durante a degranulação. Estes fatores de crescimento promovem a angiogênese, remodela o tecido e ferida de cura (ossos, pele, músculo, tendão)2. Centrifugação de sangue autólogo produz plasma rico plaquetas (PRP) que contém concentrações de plaquetas alta dependendo do método de isolamento (entre 3 e 10 vezes sangue concentrações de linha de base). De fato, várias técnicas de preparação do PRP não podem fornecer um produto final idêntico. Até agora, não houve nenhum acordo geral internacional sobre esta questão. No geral, o PRP pode ser uma atraente opção terapêutica no tratamento de condições crônicas músculo-esqueléticas, tais como tendinopatia, fascite plantar, osteoartrite e pseudartrose4. Foi usado pela primeira vez em cirurgia oral e Implantologia4 para melhorar e acelerar a consolidação depois de colocar um implante dentário. Neste estudo, descrevemos um método reprodutível que permite a aquisição de PRP para experimentação animal4.
Desde lesões dos tendões são frequentemente observadas em esportistas e trabalhadores físicos, reforçar o processo de cura e reduzindo o tempo de recuperação são de grande interesse5. Novos métodos de tratamento que estão desenvolvendo frequentemente envolvem o uso de fatores de crescimento, e a administração do PRP é uma maneira simples e minimamente invasiva para entregar uma mistura de fatores de crescimento endógeno4.
Vários estudos em vitro ou em animais demonstraram que a administração de plasma que contém um alto nível de plaquetas, liberando mediadores biológicos, pode estimular a reparação do tendão e ligamento pela liberação de mediadores biológicos6 ,7,8,9. Além disso, outros estudos têm mostrado que o PRP pode estimular tipo eu e a síntese de colágeno III no tendão células de10,9,11. Também tem sido sugerido que o PRP pode diminuir a ativação de metaloproteinases de matriz (MMPs) e, portanto, reduzir a degradação da matriz. As células que estão envolvidas no processo de inflamação podem produzir MMP-9, que desempenha um papel no tecido remodelação (fisiológica e patológica) induzida por inflamação12.
Com base nesta informação, formulamos a hipótese que uma única injeção de PRP para os tendões de Aquiles seccionados de ratos poderia melhorar o processo de recuperação e a resistência mecânica do tecido reparado. Isso é testado medindo as propriedades biomecânicas dos tendões curativas durante o processo de recuperação e realizando análises histológicas e moleculares para avaliar colágeno remodelando o tecido recém-formado. O objetivo do estudo foi observar se uma única injeção de células alogénica PRP poderia influenciar a cicatrização dos tendões de Aquiles seccionados.

<table><tbody><tr><td>Xilazina (Xyl-M)</td><td>VMD</td><td>nenhum</td><td>anestésico</td></tr><tr><td>Cetamina (J&eacute; tamina 1000 CEVA)</td><td>CEVA Sant&eacute; Animale</td><td>nenhum</td><td>anestésico</td></tr><tr><td>Buprenorfina (Veterg&eacute; sic Multidose)</td><td>ALSTOE</td><td>nenhum</td><td>Analgésico</td></tr><tr><td>iso-Betadine</td><td>MEDA-Pharma</td><td>nenhum</td><td>Fio desinfetante</td></tr><tr><td>reabsorvível Vicryl 6/0</td><td>Johnson & Johnson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nembutal</td><td>CEVA Sant&eacute; Animale</td><td>none</td> Paraformaldeído <td>anestésico</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Preserva a estrutura do tecido</td></tr><tr><td>Isopropanol 100%</td><td>VWR</td><td>20.922.364</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 95%</td><td>VWR</td><td>20.823.362</td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td>VWR</td><td>28973.363</td><td></td></tr><tr><td>Parafina</td><td>VWR</td><td>LEIC3950.1006</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxilina</td><td>Millipore</td><td>1.15938.0025</td><td>Corante</td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Millipore</td><td>1.15935.0100</td><td>Corante</td></tr><tr><td>Eukitt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3989</td><td>Meio de Montagem</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

efeitos de alogênico plasma rico em plaquetas (prp) sobre o processo de cicatrização dos tendões de aquiles seccionados de ratos: uma descrição metodológica

Effects of Allogeneic Platelet-Rich Plasma (PRP) on the Healing Process of Sectioned Achilles Tendons of Rats: A Methodological Description

Este artigo descreve os procedimentos experimentais usados para observar se PRP pode afetar positivamente o tendão cicatrização. Há 4 etapas principais a seguir: induzir uma lesão no tendão de Aquiles; preparar o PRP e injetá-lo (ou a solução salina); remover o tendão; e realizar avaliações biomecânicas, moleculares e histológicas. Em cada etapa, todos os procedimentos e métodos são descritos em detalhe, para que possam ser reproduzidos facilmente.
Tendões de Aquiles tem sido seccionada cirurgicamente (remoção de uma seção longa de 5 mm). Depois, PRP ou solução salina foi injetada para estudar se o PRP tem um efeito positivo sobre a cicatrização do tendão. Três grupos de 40 animais (um total de 120 ratos foram utilizados neste estudo) foram subdivididos em 2 subgrupos: grupo de controle grupo de injeção de PRP e uma injeção de solução salina. Ratos foram sacrificados em aumentar os pontos de tempo (grupo r: 5 dias; Grupo b: 15 dias; Grupo c: 30 dias) e tendões foram removidos. 90 tendões foram submetidos a testes biomecânicos antes de executar a análise de transcriptomic e os 30 restantes tendões foram submetidos à análise histológica.

Os resultados são expressos como o média ± desvio-padrão da média e foram comparados com a análise de variância (ANOVA). Uma ANOVA bidirecional e post hoc testam de Scheffé, que é um teste paramétrico, foram usados.
A resistência à tração (UTS) necessária para provocar uma ruptura dos tendões de Aquiles não-feridas de ratos foi 42.0 ± 5,7 N (n = 10). A resistência à tração aumentou significativamente (p < 0,0001) em amb...

Este protocolo descreve o processo de avaliação de cura os tendões em ratos que foram injetados com plasma rico de alogênico plaquetas (PRP) ou solução salina após a remoção de parte do tendão de Aquiles. O progresso da cicatrização do tendão é avaliado em vários pontos de tempo usando diferentes tipos de análises.

Efeitos de alogênico Plasma rico em plaquetas (PRP) sobre o processo de cicatrização dos tendões de Aquiles seccionados de ratos: uma descrição metodológica

This article describes the experimental procedures used to observe if PRP can positively affect tendon healing. There are 4 main steps to follow: induce a ...

O objetivo geral deste procedimento é observar os efeitos de uma única injeção de Plasma Rico em Plaquetas, ou PRP, sobre a resistência e o processo de cicatrização de tendões de Aquiles de ratos seccionados cirurgicamente em diferentes momentos. Este método pode ajudar a responder rapidamente perguntas no campo musculoesquelético sobre lesões tendíneas. A principal vantagem desta técnica é que os procedimentos cirúrgicos, biomecânicos e de aplicação de PRP são bem padronizados.As implicações dessas técnicas estendem-se ao uso de PRP em humanos, porque esses tipos de lesão e o processo de cicatrização tendínea são semelhantes entre ratos e humanos. Embora este método possa fornecer informações sobre o preparo de PRP para lesões musculoesqueléticas, essa técnica de injeção também pode ser aplicada a outros sistemas, como doenças cardíacas ou da pele. A demonstração visual do método é muito importante, porque os passos cirúrgicos e biomecânicos exigem reprodutibilidade consistente para obter resultados ideais.Inicie pesando e colocando uma etiqueta na orelha do rato. Após confirmar o nível apropriado de sedação por meio do aperto dos dedos dos pés, aplique gotas de água nas córneas do animal e remova os pelos da pata traseira esquerda. Desinfete a pele exposta com uma diluição de um para dez da solução de iso-Betadine e posicione o animal sobre uma placa aquecida a 20 graus Celsius sob um microscópio estereoscópico, na posição decúbito lateral, com a pata traseira esquerda na posição superior.Segure a pata da pata traseira esquerda com pin&ccedil;as e fa&ccedil;a uma incis&atilde;o lateral na pele de 20 a 25 mil&iacute;metros ao redor do tend&atilde;o de Aquiles. Usando tesoura fina, dissecar a f&aacute;scia para expor o complexo do tend&atilde;o de Aquiles e remover o tend&atilde;o plantar. Corte o tend&atilde;o de Aquiles transversalmente, cinco mil&iacute;metros proximal &agrave; sua inser&ccedil;&atilde;o calc&acirc;nea, e remova uma por&ccedil;&atilde;o de cinco mil&iacute;metros de comprimento.Em seguida, utilize fio reabsorvível e continue com pontos para fechar a fáscia e a pele, e coloque o rato sob uma fonte de calor com monitoramento até a recuperação completa. Enquanto os animais receptores estão se recuperando, colete 20 mililitros de sangue total de um coração de rato doador por animal experimental em tubos individuais contendo citrato de sódio tamponado a 3,2%. Para obter o plasma rico em plaquetas, centrifugue o sangue e use uma pipeta de transferência de plástico para colher cuidadosamente a fase superior contendo PRP em um segundo tubo de plástico.Determine o volume de PRP coletado e meça a contagem de plaquetas em um analisador hematológico. Centrifugue novamente o PRP e transfira cuidadosamente o sobrenadante para um novo tubo de plástico. O volume remanescente no tubo de PRP deve ser de aproximadamente 2/3 do volume necessário para atingir 2,5 vezes 10 à sexta plaquetas por microlitro.Em seguida, ressuspenda suavemente o pellet de plaquetas com pipetagem. Meça a contagem de plaquetas deste plasma rico em plaquetas concentrado, adicionando novamente o volume apropriado de plasma pobre em plaquetas autólogo para atingir a concentração desejada, conforme necessário. Ative as plaquetas com 50 microlitros de cloreto de cálcio por mililitro de PRP durante cerca de uma hora à temperatura ambiente.Em seguida, carregue as plaquetas em uma seringa de um mililitro equipada com uma agulha de 21 calibres e injete 50 microlitros das plaquetas diretamente no local da sutura de cada animal. No ponto final experimental apropriado, depile a pata traseira esquerda do animal experimental anestesiado e posicione a rata sob um microscópio estereoscópico conforme acabou de ser demonstrado. Segurando a pata com os dedos, faça uma incisão de 10 milímetros no local cirúrgico para expor o tríceps sural.Para remover o tendão de Aquiles, corte o osso calcâneo transversalmente, de cinco a dez milímetros distal à sua inserção, e dissecar um fragmento do tríceps sural grande o suficiente para caber na mandíbula criogênica. Use pinças para colocar a amostra imediatamente na mandíbula superior da mandíbula criogênica e feche o instrumento. Coloque a mandíbula criogênica verticalmente em uma máquina universal de ensaios e fixe o osso calcâneo entre as garras inferiores.Para calcular a área da seção transversal, posicione câmeras perpendiculares entre si. Adicione nitrogênio líquido em ambas as bacias da mandíbula superior para congelar o músculo até uma rigidez da ordem de magnitude maior que a do tendão, de modo que não se deforme durante o ensaio de tração. Quando a zona de congelamento atingir a borda da braçadeira metálica, ajuste a taxa de deslocamento da máquina a uma velocidade constante de um milímetro por segundo até a ruptura e inicie o ensaio de tração, utilizando um computador para registrar a resistência máxima à tração em newtons.Para levar em consideração as diferenças nas áreas da seção transversal dos tendões em cicatrização, normalize a resistência máxima à tração por unidade de área, representando a tensão mecânica sofrida pelo tecido. Em seguida, quando o tendão romper, congele rapidamente as amostras de tendão rompido em nitrogênio líquido e armazene-as a menos 80 graus Celsius até a extração de RNA e análise por RT-PCR. Neste experimento representativo, uma força maior foi necessária para induzir a ruptura do tendão no grupo injetado com PRP do que no grupo controle tratado com solução salina em todos os pontos temporais analisados, sugerindo um processo de cicatrização mais robusto ou melhores propriedades mecânicas nos animais tratados com PRP.Embora o grupo PRP tenha demonstrado uma maior dispersão intragrupo do que o grupo salino, a área da seção transversal dos tendões foi determinada como sendo maior no grupo injetado com PRP nos dias 15 e 30 após a indução da lesão. Além disso, a coloração de Masson revelou uma maior presença de colágeno fibrilar, um componente essencial na morfologia e resistência do tendão, em animais tratados com PRP nos dias cinco e 15, com intensidade de coloração semelhante observada em ambos os grupos no dia 30 após a injeção. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como induzir lesões padrão em ratos e como coletar amostras do tendão para avaliar o processo de cicatrização após injeção de PRP.

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Este vídeo demonstra uma técnica para injetar plasma rico em plaquetas (PRP) no tendão de Aquiles seccionado de ratos. Um pequeno segmento é excisado do tendão de Aquiles de um rato receptor, o local é suturado e o rato pode se recuperar. Ao mesmo tempo, o sangue total é coletado de um rato doador e centrifugado para obter o PRP, que é então ativado e injetado no local suturado do rato receptor para induzir o reparo do tendão.

Uma injeção de plasma rico em plaquetas no tendão de Aquiles seccionado de um rato

Implante infecção associada é uma complicação clínica significativa. Este estudo descreve uma abordagem utilizando plasma rico em plaquetas (PRP) para evitar as infecções associadas implante, apresenta o protocolo para a preparação de PRP com a concentração de plaquetas constante, e relata as propriedades antimicrobianas recentemente identificados de PRP e protocolos relacionados para examinar tais propriedades...

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Efeitos de alogênico Plasma rico em plaquetas (PRP) sobre o processo de cicatrização dos tendões de Aquiles seccionados de ratos: uma descrição metodológica (Vídeo) | JoVE Journal

Efeitos de alogênico Plasma rico em plaquetas (PRP) sobre o processo de cicatrização dos tendões de Aquiles seccionados de ratos: uma descrição metodológica

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