Efeitos de alogênico Plasma rico em plaquetas (PRP) sobre o processo de cicatrização dos tendões de Aquiles seccionados de ratos: uma descrição metodológica
19 de março de 2018
Este protocolo descreve o processo de avaliação de cura os tendões em ratos que foram injetados com plasma rico de alogênico plaquetas (PRP) ou solução salina após a remoção de parte do tendão de Aquiles. O progresso da cicatrização do tendão é avaliado em vários pontos de tempo usando diferentes tipos de análises.
O objetivo geral deste procedimento é observar os efeitos de uma única injeção de Plasma Rico em Plaquetas, ou PRP, sobre a resistência e o processo de cicatrização de tendões de Aquiles de ratos seccionados cirurgicamente em diferentes momentos. Este método pode ajudar a responder rapidamente perguntas no campo musculoesquelético sobre lesões tendíneas. A principal vantagem desta técnica é que os procedimentos cirúrgicos, biomecânicos e de aplicação de PRP são bem padronizados.
As implicações dessas técnicas estendem-se ao uso de PRP em humanos, porque esses tipos de lesão e o processo de cicatrização tendínea são semelhantes entre ratos e humanos. Embora este método possa fornecer informações sobre o preparo de PRP para lesões musculoesqueléticas, essa técnica de injeção também pode ser aplicada a outros sistemas, como doenças cardíacas ou da pele. A demonstração visual do método é muito importante, porque os passos cirúrgicos e biomecânicos exigem reprodutibilidade consistente para obter resultados ideais.
Inicie pesando e colocando uma etiqueta na orelha do rato. Após confirmar o nível apropriado de sedação por meio do aperto dos dedos dos pés, aplique gotas de água nas córneas do animal e remova os pelos da pata traseira esquerda. Desinfete a pele exposta com uma diluição de um para dez da solução de iso-Betadine e posicione o animal sobre uma placa aquecida a 20 graus Celsius sob um microscópio estereoscópico, na posição decúbito lateral, com a pata traseira esquerda na posição superior.
Segure a pata da pata traseira esquerda com pinças e faça uma incisão lateral na pele de 20 a 25 milímetros ao redor do tendão de Aquiles. Usando tesoura fina, dissecar a fáscia para expor o complexo do tendão de Aquiles e remover o tendão plantar. Corte o tendão de Aquiles transversalmente, cinco milímetros proximal à sua inserção calcânea, e remova uma porção de cinco milímetros de comprimento.
Em seguida, utilize fio reabsorvível e continue com pontos para fechar a fáscia e a pele, e coloque o rato sob uma fonte de calor com monitoramento até a recuperação completa. Enquanto os animais receptores estão se recuperando, colete 20 mililitros de sangue total de um coração de rato doador por animal experimental em tubos individuais contendo citrato de sódio tamponado a 3,2%. Para obter o plasma rico em plaquetas, centrifugue o sangue e use uma pipeta de transferência de plástico para colher cuidadosamente a fase superior contendo PRP em um segundo tubo de plástico.
Determine o volume de PRP coletado e meça a contagem de plaquetas em um analisador hematológico. Centrifugue novamente o PRP e transfira cuidadosamente o sobrenadante para um novo tubo de plástico. O volume remanescente no tubo de PRP deve ser de aproximadamente 2/3 do volume necessário para atingir 2,5 vezes 10 à sexta plaquetas por microlitro.
Em seguida, ressuspenda suavemente o pellet de plaquetas com pipetagem. Meça a contagem de plaquetas deste plasma rico em plaquetas concentrado, adicionando novamente o volume apropriado de plasma pobre em plaquetas autólogo para atingir a concentração desejada, conforme necessário. Ative as plaquetas com 50 microlitros de cloreto de cálcio por mililitro de PRP durante cerca de uma hora à temperatura ambiente.
Em seguida, carregue as plaquetas em uma seringa de um mililitro equipada com uma agulha de 21 calibres e injete 50 microlitros das plaquetas diretamente no local da sutura de cada animal. No ponto final experimental apropriado, depile a pata traseira esquerda do animal experimental anestesiado e posicione a rata sob um microscópio estereoscópico conforme acabou de ser demonstrado. Segurando a pata com os dedos, faça uma incisão de 10 milímetros no local cirúrgico para expor o tríceps sural.
Para remover o tendão de Aquiles, corte o osso calcâneo transversalmente, de cinco a dez milímetros distal à sua inserção, e dissecar um fragmento do tríceps sural grande o suficiente para caber na mandíbula criogênica. Use pinças para colocar a amostra imediatamente na mandíbula superior da mandíbula criogênica e feche o instrumento. Coloque a mandíbula criogênica verticalmente em uma máquina universal de ensaios e fixe o osso calcâneo entre as garras inferiores.
Para calcular a área da seção transversal, posicione câmeras perpendiculares entre si. Adicione nitrogênio líquido em ambas as bacias da mandíbula superior para congelar o músculo até uma rigidez da ordem de magnitude maior que a do tendão, de modo que não se deforme durante o ensaio de tração. Quando a zona de congelamento atingir a borda da braçadeira metálica, ajuste a taxa de deslocamento da máquina a uma velocidade constante de um milímetro por segundo até a ruptura e inicie o ensaio de tração, utilizando um computador para registrar a resistência máxima à tração em newtons.
Para levar em consideração as diferenças nas áreas da seção transversal dos tendões em cicatrização, normalize a resistência máxima à tração por unidade de área, representando a tensão mecânica sofrida pelo tecido. Em seguida, quando o tendão romper, congele rapidamente as amostras de tendão rompido em nitrogênio líquido e armazene-as a menos 80 graus Celsius até a extração de RNA e análise por RT-PCR. Neste experimento representativo, uma força maior foi necessária para induzir a ruptura do tendão no grupo injetado com PRP do que no grupo controle tratado com solução salina em todos os pontos temporais analisados, sugerindo um processo de cicatrização mais robusto ou melhores propriedades mecânicas nos animais tratados com PRP.
Embora o grupo PRP tenha demonstrado uma maior dispersão intragrupo do que o grupo salino, a área da seção transversal dos tendões foi determinada como sendo maior no grupo injetado com PRP nos dias 15 e 30 após a indução da lesão. Além disso, a coloração de Masson revelou uma maior presença de colágeno fibrilar, um componente essencial na morfologia e resistência do tendão, em animais tratados com PRP nos dias cinco e 15, com intensidade de coloração semelhante observada em ambos os grupos no dia 30 após a injeção. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como induzir lesões padrão em ratos e como coletar amostras do tendão para avaliar o processo de cicatrização após injeção de PRP.
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Visão Geral
Este protocolo descreve a avaliação da cicatrização tendínea em ratos injetados com plasma rico em plaquetas (PRP) ou solução salina após cirurgia do tendão de Aquiles. O processo de cicatrização é avaliado em diferentes momentos utilizando análises padronizadas.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia
- Pesquisa Musculoesquelética
Antecedentes
- O plasma rico em plaquetas (PRP) é utilizado para potencializar a cicatrização em lesões músculo-esqueléticas.
- O estudo enfoca as semelhanças no processo de cicatrização tendínea entre ratos e humanos.
- Procedimentos cirúrgicos e biomecânicos padronizados são fundamentais para a reprodutibilidade.
- Os conhecimentos obtidos podem orientar as aplicações de PRP em diversas áreas médicas.
Objetivo do Estudo
- Observar os efeitos do PRP na cicatrização de tendões de Aquiles seccionados cirurgicamente em ratos.
- Fornecer um método para avaliar lesões tendíneas em um ambiente controlado.
- Explorar as implicações do tratamento com PRP para lesões tendíneas humanas.
Métodos Utilizados
- Injeção de PRP ou soro fisiológico nos tendões de Aquiles de ratos.
- Avaliação da cicatrização tendínea em múltiplos pontos temporais.
- Procedimentos cirúrgicos padronizados para garantir consistência.
- Análises biomecânicas para avaliar a resistência e a cicatrização do tendão.
Resultados Principais
- O tratamento com PRP mostrou efeitos significativos na cicatrização tendínea em comparação com a solução salina.
- Métodos padronizados permitiram a avaliação confiável do progresso da cicatrização.
- Os resultados podem orientar futuras aplicações de PRP na medicina humana.
- Demonstrações visuais do método aprimoraram a compreensão do procedimento.
Conclusões
- O PRP é um tratamento promissor para melhorar a cicatrização tendinosa.
- Os achados apoiam o uso de modelos animais para estudar lesões tendíneas humanas.
- Protocolos padronizados são essenciais para resultados reprodutíveis.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo fornece um método padronizado para avaliar a cicatrização tendínea em um modelo pré-clínico com roedores, permitindo a redução de riscos mecanicistas das terapias com plasma rico em plaquetas (PRP) para indicações musculoesqueléticas. Ao quantificar a resistência biomecânica, o depósito de colágeno e as alterações transcriptômicas em múltiplos pontos temporais, a abordagem apoia a validação de alvos e a confiança preditiva no estágio inicial de descoberta. O modelo cirúrgico reprodutível de lesão e o fluxo de trabalho de preparação do PRP facilitam o alinhamento entre equipes de biologia de descoberta e pesquisa translacional.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite investigar os efeitos biológicos do PRP nas vias de reparo tendíneo mediante indução controlada de lesão e coleta programada de tecido.
- Valor Operacional: Procedimentos cirúrgicos e de injeção padronizados reduzem a variabilidade, favorecendo a avaliação confiável do engajamento do alvo.
- Valor Preditivo: Parâmetros biomecânicos e histológicos fornecem métricas quantitativas para a validação funcional do alvo e decisões de continuidade ou interrupção.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera espécimes tendíneos consistentes para ensaios moleculares e biomecânicos posteriores, garantindo prontidão para os ensaios.
- Valor Operacional: O protocolo definido de preparação e injeção de PRP permite triagem escalonável de compostos ou biológicos em modelos de cicatrização tendínea.
- Valor Traducional: Os protocolos de coloração histológica (por exemplo, tricrômio de Masson) e extração de RNA apoiam o desenvolvimento de ensaios alinhados a biomarcadores.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: A análise específica por ponto temporal (5, 15, 30 dias) reflete as trajetórias clínicas de cicatrização, permitindo a avaliação de sistemas relevantes à doença.
- Valor Operacional: O teste biomecânico com normalização pela área da seção transversal fornece indicadores de eficácia padronizados para a progressão pré-clínica.
- Valor Preditivo: A correlação do tratamento com PRP com o aumento da resistência à tração e da produção de colágeno fibrilar apoia a redução de riscos mecanicistas antes dos estudos habilitadores de IND.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta a pré-clínico, apoiando a verificação de hipóteses na fase inicial de descoberta, a padronização de ensaios na triagem e a validação de eficácia na pesquisa translacional.
- Biologia da Descoberta: Apoia a clarificação de vias e a desmistificação biológica ao isolar o efeito do PRP na cicatrização tendínea, independentemente de variáveis sistêmicas.
- Triagem: Permite a preparação padronizada de tecidos tendíneos em cicatrização para leituras biomecânicas e moleculares reprodutíveis.
- Análises: A normalização da resistência máxima à tração e a quantificação de colágeno fornecem análises comparativas para classificação de condições.
- Pesquisa Translacional: As saídas histológicas e transcriptômicas estão alinhadas à descoberta de biomarcadores e à continuidade pré-clínica.
- Reutilização Empresarial: O modelo padronizado de lesão e o fluxo de trabalho com PRP podem ser adaptados a diversas indicações musculoesqueléticas para reutilização da plataforma.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Redução de riscos mecanicistas do PRP por meio da avaliação quantitativa da resistência tendínea e remodelação da matriz.
- Valor Operacional: Procedimentos cirúrgicos e de injeção reprodutíveis garantem consistência entre diferentes locais em estudos pré-clínicos.
- Valor Estratégico: Avaliação da cicatrização baseada em dados melhora as decisões de avanço ou interrupção e reduz riscos biológicos em estágios avançados em programas de reparo tendíneo.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos ao PRP com base em desfechos funcionais de cicatrização.
Considerações sobre a Implementação
- É necessária experiência em microcirurgia em roedores e manipulação de tendões para a indução consistente de lesões.
- É necessário ter acesso a centrífuga, analisador hematológico e máquina universal de ensaios para a preparação do PRP e avaliação biomecânica.
- A padronização da ativação do PRP e do volume de injeção entre os operadores é fundamental para a reprodutibilidade.
- A adaptação a outros tipos de tendões ou espécies pode exigir o reajuste do tamanho da lesão e da dose de PRP.
- Os pontos finais histológicos e moleculares exigem infraestrutura para processamento de tecidos (por exemplo, armazenamento em criotemperaturas, extração de RNA).
