Técnicas de laboratório usadas para manter e diferenciar biótipos de Vibrio cholerae Isolados clínicos e ambientais

O objetivo geral desta técnica é fornecer uma coleção de protocolos que sejam simples de realizar e possam ajudar qualquer investigador a caracterizar um determinado isolado clínico ou ambiental de Vibrio cholerae. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da bacteriologia, como as características genotípicas e fenotípicas específicas de qualquer isolado de Vibrio cholerae, especialmente aquelas de relevância clínica. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite que qualquer investigador use essa coleção de ensaios para caracterizar e distinguir de forma confiável os isolados de Vibrio cholerae clínicos ou ambientais.

Juntos, esses ensaios fornecem uma abordagem sistemática a ser usada como alternativa ou em adição a experimentos dispendiosos e trabalhosos e à caracterização de isolados clínicos e ambientais de Vibrio cholerae. Embora este método possa fornecer informações sobre a caracterização dos biótipos de Vibrio cholerae, ele também pode ser aplicado para caracterizar as capacidades bioquímicas e metabólicas de outras bactérias entéricas. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades com o gerenciamento do tempo, pois os tempos de incubação necessários para garantir os melhores resultados diferem entre os ensaios bioquímicos.

Demonstrações visuais dos protocolos de detecção e esfaqueamento são críticas, pois respingos muitas vezes podem levar à contaminação cruzada e o espaçamento máximo é necessário para evitar a fusão entre as culturas. Comece o protocolo peletizando 1,8 mL de cultura líquida durante a noite por dois minutos por centrifugação a um mínimo de 8.600 xG em um tubo de microcentrífuga estéril de 2 mL. Após centrifugação, remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 900 mcL de caldo fresco de Luria-Bertani ou LB por pipetagem.

Em seguida, adicione 900 mcL de glicerol estéril a 60% volume a volume à cultura e misture por vórtice. Transfira a mistura para um tubo criogênico estéril de 2 mL e armazene a cultura de estoque a 80 graus Celsius. Para usar o caldo, com uma alça de inoculação estéril, remova uma pequena quantidade de caldo congelado e listre as bactérias para obter colônias únicas em placas de ágar LB.

Retorne imediatamente o caldo congelado a 80 graus Celsius após o uso para evitar que as culturas descongelem completamente. Incube as placas com a tampa voltada para baixo por 12-16 horas a 37 graus Celsius. Obtenha o prato previamente preparado.

Inocule 4 mL de caldo LB líquido em um tubo de cultura estéril de 10 mL com uma única colônia, tocando a superfície da colônia única com uma alça esterilizada e transferindo a colônia para o caldo líquido. Em seguida, incube a cultura com aeração em uma incubadora agitadora a 225 rpm por 12-16 horas a 37 graus Celsius. Prepare a cultura durante a noite em caldo LB líquido.

No dia seguinte, faça a cultura e lave as células ressuspendendo o pellet celular em 1,8 mL de solução salina tamponada com fosfato ou PBS. Repita o procedimento de lavagem três vezes. Siga a terceira lavagem com uma ressuspensão final em 1,8 mL de 1x PBS.

Em seguida, use uma ponta de pipeta para detectar 1 mcL de cultura lavada no respectivo meio. Lavar o grânulo celular obtido da cultura durante a noite. Inocular placas de ágar motilidade inserindo uma facada inoculante na cultura líquida lavada e facada verticalmente no meio.

Certifique-se de que a facada inoculante não dobre ao esfaquear o ágar. Entre cada inoculação, esterilize a facada de arame usando um bico de Bunsen. Incube as placas com a tampa voltada para cima por 14-24 horas a 37 graus Celsius.

Após 14 horas, monitore as placas de motilidade de perto para evitar o crescimento excessivo das culturas. Inocular 4 mL de caldo Methyl Red Voges-Proskauer ou MR-VP pipetando 10 mcL de cultura noturna previamente preparada em 4 mL de caldo MR-VP em um tubo de cultura estéril e incube com aeração em uma incubadora agitadora a 225 rpm por 12-16 horas a 37 graus Celsius. Em seguida, adicione 150 mcL de 5% de peso por volume de alfa-naftol e 50 mcL de 40% de peso por volume de hidróxido de potássio a 1 mL de alíquotas da cultura MR-VP durante a noite em tubos de cultura estéreis, respectivamente.

Em seguida, faça um vórtice breve dos tubos. Deixe os tubos repousarem em temperatura ambiente por até quatro horas até que a mudança de cor se desenvolva. Cepas de referência de biótipo e variantes representativas de El Tor foram incluídas em triagens genéticas de base de PCR e ensaios fenotípicos para distinguir entre os fundos de biótipo de isolados clínicos e ambientais de V. Cholerae.

O O395 clássico do tipo selvagem demonstrou sequências clássicas de ctxB e tcpA. Por outro lado, as cepas El Tor do tipo selvagem N16961 e C6706 demonstraram sequências El Tor ctxB e tcpA. MQ1795 e BAA-2163 contêm a subunidade ctxB do biótipo clássico comparável a 0395.

No entanto, ambas as variantes de El Tor continham o tcpA indicativo do fundo do biótipo El Tor. Quando cultivada em placas de ágar LB suplementada com polimixina B, a cepa 0395 do biótipo clássico do tipo selvagem mostrou sensibilidade à polimixina B, enquanto a cepa do biótipo El Tor do tipo selvagem mostrou resistência. As cepas representativas da variante El Tor demonstraram resistência semelhante ao antibiótico.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como distinguir entre os biótipos de Vibrio cholerae usando o sistema de identificação de ensaios múltiplos descrito neste manuscrito. Não se esqueça de que trabalhar com patógenos BSL-2 pode ser extremamente perigoso e o manuseio e descarte adequados de todos os materiais e resíduos devem ser aplicados de acordo com os regulamentos institucionais, locais, estaduais e federais. Além dos protocolos listados neste manuscrito, uma caracterização mais aprofundada dos isolados de Vibrio cholerae pode ser alcançada através da investigação de outras propriedades fenotípicas, como formação de biofilme e autoaglutinação.