Um sistema integrado para acionar remotamente a transdução do sinal intracelular por Photoactivation Upconversion Nanoparticle-mediada da quinase

O objetivo deste experimento é demonstrar a viabilidade de fotoativar a enzima usando irradiação no infravermelho próximo. A proteína quinase A é imobilizada nesta superfície de nanopartículas de conversão ascendente microinjetadas nas células e a resposta induzida pela quinase em células vivas é observada após irradiação no infravermelho próximo. A fotoativação tradicional requer luz UV fototóxica e, inevitavelmente, co-induzirá reação química indesejável e resposta semelhante, no entanto, em nossas opções amigáveis, como a irradiação infravermelha próxima não pode desencadear a reação devido à sua baixa energia.

A nanopartícula de conversão ascendente pode efetivamente converter o fóton infravermelho de baixa energia bio-amigável próximo ao fóton UV em fóton UV de alta energia para desencadear uma reação química perto da superfície da partícula sem irradiação UV direta. A quinase desempenha um papel fundamental na oncogênese, esta técnica pode nos ajudar a examinar mais informações de transdução de sinal com ruído de interferência muito menor da fototoxicidade UV e sua reação colateral. Geralmente, indivíduos novos neste campo encontrarão dificuldades em modificar instrumentos e configuração óptica para aplicação de conversão ascendente.

Para começar, instale uma lente objetiva 4x ao lado do suporte da cubeta do fluoroespectrômetro, para que o laser possa ser focado no meio da cubeta. Coloque um diodo laser ajustável de 980 nanômetros 90 graus contra a lente objetiva. Instale um espelho de refletância completo e a interseção do caminho da luz da lente objetiva e do laser.

Não se esqueça de colocar uma placa de metal anodizado para bloquear a janela de excitação do espectrômetro para proteger as partes internas. Em seguida, coloque uma cubeta de solução de nanopartículas de conversão ascendente revestida de sílica no suporte. Um feixe de conversão ascendente brilhante pode ser visualizado quando o laser é ligado.

Mude a espectroscopia para o modo de luminescência, com a menor tensão PMT durante os alinhamentos. Ajuste o espelho e o laser stages para que o feixe passe pelo meio da cubeta para que o PMT capte o sinal mais forte. Depois de instalar um espelho dicróico e um filtro de excitação, instale um diodo laser de 980 nanômetros no caminho de luz da camada inferior.

Adicione um colimador entre o laser e o espelho para ajudar a difundir e ampliar a área de irradiação NIR no plano focal. Em seguida, use uma solução de nanopartículas de conversão ascendente para visualizar o feixe infravermelho próximo. Ajuste a posição do laser stage para centralizar o feixe de luz infravermelha próxima para finalizar o alinhamento.

Execute a síntese de PKA enjaulada e desmobilize o PKA/UCNP enjaulado, para gerar PKA/UCNP enjaulado, conforme descrito no protocolo de texto. Para medir a atividade de ambas as construções antes da fotólise UV, meça a diminuição dos absorventes de NADH na mistura do ensaio ao longo do tempo após a adição de dois microlitros de solução de PKA à mistura do ensaio. Repita a medição para PKA/UCNP.

Em seguida, realize a fotólise UV a 200 miliwatts por centímetro quadrado de PKA enjaulado e PKA/UCNP enjaulado, em banho de água gelada, para garantir que o PKA possa ser ativado. A atividade da PKA é determinada por um ensaio acoplado à enzima lactato desidrogenase piruvato quinase. Com uma diminuição nos absorventes de NADH, é medido ao longo do tempo após a adição da solução de PKA.

Incubar as células em soro bovino fetal a 10% contendo meio L15 durante o período de microinjeção para controle estável do pH fora da incubadora. Configure o extrator de agulhas para uma ponta em forma de cone com um diâmetro de cerca de 1,5 mícrons para abertura posterior da ponta. Para abrir a ponta, instale a agulha no microinjetor, mova a ponta da agulha em contato com a borda de uma lâmina e siga com um botão suave no microscópio stage.

Essa força de vibração é suficiente para quebrar levemente a ponta e ampliar a abertura. Examine a abertura da agulha para garantir que ela tenha um diâmetro externo de 1,3 a 1,5 mícrons, o que pode ser confirmado por imagens de microscópio usando uma lente objetiva de 40x. Em seguida, ajuste a pressão de injeção de 50 a 75 hectopascais com um intervalo pressurizado de 200 a 300 milissegundos e ajuste a pressão de compensação constante em 15 a 30 hectopascais para evitar o refluxo médio na agulha.

Carregue o complexo PKA/UCNP enjaulado com corante TAMRA na posição posterior da agulha. A agulha carregada é então configurada em um micromanipulador hidráulico de eixo, com um ângulo de 30 graus a 45 graus. Verifique a agulha com o microscópio para garantir que nenhuma bolha seja gerada após o carregamento da amostra.

Depois de imergir a agulha no meio, mude para o modo de fluorescência, para confirmar uma liberação de explosão de corante quando a pressão de injeção é aplicada e uma liberação lenta de corante quando a pressão de compensação é aplicada constantemente. Em seguida, mude para o modo de campo claro de contraste de fase, para iniciar a microinjeção celular. A onda de choque da membrana pode ser observada em injeções bem-sucedidas.

Lave as células duas vezes e verifique se as células injetadas apresentam fluorescência TAMRA co-injetada para localizar as células microinjetadas com sucesso. Célula com admissão UCNP, mas sem um sinal de corante co-injetado, indica que a membrana celular foi rompida durante a injeção e deve ser excluída de experimentos adicionais. Irradie as células com um diodo laser de 980 nanômetros no caminho de luz da camada inferior focalizado por uma lente objetiva de 10x por 15 minutos.

Deixe um intervalo escuro de cinco minutos a cada cinco minutos de irradiação para evitar o aquecimento. Se for necessário um tempo de ativação mais curto, como segundos ou mesmo subsegundos, basta mudar para uma lente objetiva de 40x para maior densidade de fótons de foco. Após a fotólise e a recuperação celular, fixe as células em um mililitro ou 4% de paraformaldeído em PBS por 20 minutos, antes de mais alexa 594 seguir dentro da coloração.

Finalmente, visualize a desintegração da fibra de tensão induzida pelo NIR. Após a irradiação NIR, as células microinjetadas com PKA/UCNP enjauladas, conforme indicado pelas setas brancas, mostram emissão de conversão ascendente. A desintegração da fibra de tensão causada por uma fotoativação bem-sucedida de PKA NIR expõe mais f actina e, consequentemente, resulta em forte coloração verde perto de UCNP.

Um controle negativo onde as células são microinjetadas, mas permanecem no escuro, não mostram desintegração das fibras de estresse. O nível de exposição à f actina após a fotoativação NIR pode ser corado com alexa 594 seguido e quantificado pela imagem J. As curvas de intensidade da coloração de f actina ao longo da seta vermelha foram plotadas, fornecendo informações quantitativas de desintegração da fibra de estresse que podem ser correlacionadas à atividade de PKA induzida por NIR. Uma vez familiarizada com a microinjeção, essa técnica pode ser feita em um dia, incluindo a preparação e o controle de qualidade do caged-PKA/UCNP.

Com nossas instruções para as modificações de nossos instrumentos e os experimentos, a reação desejada pode ser desencadeada por infravermelho próximo, em resolução temporal altamente espacial, como o UV tradicional para métodos de titulação, mas sem a fototoxicidade, não é contagiosa. Depois de assistir a este vídeo, espero que você tenha uma boa compreensão de como entregar o complexo de nanopartículas enzimáticas em uma célula por microinjeção e fotoativar a enzima, usando a luz infravermelha próxima compatível com sino. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia química, que precisam usar a luz para desencadear a reação enzimática desejada em células vivas para resolução espaço-temporal quando a célula não pode tolerar a fototoxicidade UV.

Seguindo este procedimento, outros bio afetores podem ser associados à nanopartícula de conversão ascendente, para responder a questões adicionais que necessitam de fotoativação espaço-temporal. Se o bio afetador funcionar extracelularmente, a microinjeção nem é necessária. A plataforma de fotoativação de infravermelho próximo também pode fornecer mais profundidade de penetração no tecido e, portanto, pode ser aplicada em pequenos animais para desencadear as reações desejadas no momento e no local determinados.