Name: Análise das Interações Proteína-Proteína e Co-localização entre Componentes das Juntas Abertas, Apertadas e Aderentes nas Glândulas Mamárias Murinas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Aprenda a analisar interações proteína-proteína e co-localização entre componentes de juntas celulares em glândulas mamárias murinas usando co-imunoprecipitação e imunofluorescência. Este método permite estudar o desenvolvimento normal e mecanismos do câncer de mama.

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O IP é financiado por uma doação do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (NSERC nº 418233-2012); Um Fundo de Pesquisa do Québec-Saúde (FRQS), um prêmio de carreira da Fundação do Câncer do Quebec e uma doação Leader Founds da Fundação Canadense para Inovação. ED recebeu uma bolsa de estudos da Fondation universitaire Armand-Frappier.

Todos os protocolos de animais utilizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê de Cuidados de Animais da Universidade (INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, Canadá). 1. Identificando Co-localização de Proteína <ol><li> Do tecido para lâminas microscópicas NOTA: Os tecidos e as seções devem ser manuseados em gelo seco. <ol><li> Impeça as glândulas mamárias de um animal (para uma descrição completa deste procedimento, consulte Plante et al. ) 14 . </li><li> Incorporar o tecido excisado no meio de congelação / montagem em gelo seco. Adicione meio suficiente para cobrir a glândula. Quando o meio é solidificado, transfira os tecidos para um congelador a -80 ° C para uso posterior 9 . </li><li> Usando um cryomicrotome ajustado em ≤ -35 ​​° C, corte os tecidos em secções de 7-10 μm de espessura e coloque-os em lâminas de microscópio. NOTA: Quando possível, coloque duas seções em cada slide; A seção esquerda será usada como umControle negativo para verificar a especificidade dos anticorpos e a autofluorescência do tecido, enquanto o lado direito será rotulado com os anticorpos. </li><li> Mantenha as secções a -80 ° C para uso posterior. </li></ol></li><li> Co-IF coloração <ol><li> Recupere as lâminas microscópicas apropriadas do congelador e conserte imediatamente as secções imergindo-as em formaldeído 4% durante 15 minutos à temperatura ambiente (RT). </li><li> Em seguida, mergulhe os slides em solução salina tamponada com fosfato (PBS) à RT. Deixe os slides em PBS na RT até prosseguir para o próximo passo. </li><li> Circule cada seção do slide usando uma barreira hidrofóbica comercialmente disponível ou uma caneta de laboratório repelente de água (veja a Tabela de Materiais ). Tenha cuidado para não tocar o tecido. Adicione imediatamente gotas de PBS ao tecido e coloque o slide em uma câmara de histologia úmida pelo restante do procedimento. NOTA: As secções de tecido devem permanecer hidratadas. AlternativaUse uma caixa com uma tampa e coloque toalhas de papel molhadas na parte inferior. </li><li> Bloqueie cada seção de tecido com 100-200 μL de albumina de soro bovino a 3% (BSA) - solução salina tamponada com Tris (TBS) -0,1% de polissorbato 20 (ver Tabela de Materiais ) durante 30 min à TA. Enquanto as amostras estão bloqueando, prepare as soluções de anticorpos primário e secundário diluindo os anticorpos em TBS-0.1% polissorbato 20. NOTA: A concentração requerida para o anticorpo é fornecida pelo fabricante; Veja a Tabela de Materiais e as Figuras 1 e 2 para exemplos, bem como Dianati et al. 9 . Embora não seja necessário trabalhar no escuro ao usar a maioria dos anticorpos conjugados com fluoróforos, evite expor as soluções de anticorpos ou os tecidos coloridos a luz intensa e brilhante. </li><li> Remova a solução de bloqueio por aspiração e incube as seções em 100-200 μL do anticorpo primário diluído durante 60 min à TA. AlternativelIn, incubar com o anticorpo primário durante a noite a 4 ° C. </li><li> Remova a solução de anticorpo primário por aspiração e lave as secções com 250-500 μL de TBS-0,1% de polissorbato 20 durante 5 min. Remova a solução de lavagem por aspiração e repita a lavagem duas vezes. </li><li> Remova a solução de lavagem por aspiração e incube as secções com 100-200 μL do anticorpo secundário conjugado com fluoróforo apropriado durante 60 min à TA. </li><li> Remova a solução de anticorpo secundário por aspiração e lave as secções com 250-500 μL de TBS-0,1% de polissorbato 20 durante 5 min. Remova a solução de lavagem e repita duas vezes. </li><li> Repita o passo 2.5-2.8 utilizando a combinação apropriada de anticorpos primários e secundários para a (s) proteína (s) subsequente (s) de interesse. </li><li> Remova a solução de lavagem por aspiração e realize a coloração dos núcleos incubando a seção com 100-200 μL de 1 mg / mL de 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) em TBS-0,1% de polissorbato 20 durante 5 min aRT. </li><li> Remova a solução DAPI por aspiração e monte as lâminas usando um meio de montagem solúvel em água e não fluorescente (veja a Tabela de Materiais ) e lamínulas. Prossiga um slide de cada vez. NOTA: Incubar a mancha do núcleo por mais de 5 min não alterará a intensidade da coloração. Alternativamente, remova a solução DAPI em todos os slides e incuba os tecidos em PBS enquanto monta as lâminas. </li><li> Coloque as lâminas plana em uma geladeira de 4 ° C por pelo menos 8 h. Proceda à imagem microscópica de fluorescência (ver Figuras 1 e 2 ). </li></ol></li><li> Imagem microscópica <ol><li> Visualize os anticorpos secundários conjugados com fluoróforos usando um microscópio confocal equipado com os vários lasers necessários para excitar os fluoróforos em seus comprimentos de onda específicos. Nota: Para poder visualizar canais e alvéolos, sugere-se um objetivo 40X com uma abertura numérica de 0,95. Um exemploE da configuração específica é fornecida na Figura 1 . </li><li> Verifique a localização de cada proteína individualmente, digitalizando a imagem um comprimento de onda no momento. Nota: Nesta fase, é importante analisar criticamente a localização das proteínas juncionais. Para poder formar nexos de junção, estas proteínas devem ser localizadas na membrana plasmática. </li><li> Determine a co-localização das proteínas pela fusão das imagens digitalizadas com os lasers nos diferentes comprimentos de onda. Nota: A co-localização das proteínas pode ser visualizada pela mudança de cor resultante da emissão de dois ou mais fluoróforos no mesmo local e pode ser medida usando o software apropriado ( Figuras 1 e 2 , veja também a Referência 9). </li></ol></li></ol> 2. Estudando PPIs NOTA: As glândulas mamárias abdominais devem ser usadas para estudar IPP, pois as glândulas torácicas estão em estreita associação com o peitoralMúsculos. Esqueça as glândulas mamárias (para uma descrição completa deste procedimento, consulte Plante et al .) 14 e mantenha-os a -80 ° C para uso posterior. <ol><li> Preparação de lisado <ol><li> Coloque papel de pesagem e 2 mL de tubos de microcentrífuga em gelo seco para pré-esfriar antes de prosseguir com os próximos passos. </li><li> Pegue o tecido da glândula mamária a partir de -80 ° C e mantenha-os em gelo seco. </li><li> Pesar os tecidos nos papéis de pesagem pré-refrigerados e depois transferir o tecido para tubos de microcentrífuga de 2 mL (pega em gelo seco). Use entre 50 e 100 mg de tecido por amostra. Mantenha o tecido em gelo seco até o passo 2.1.5. </li><li> Prepare a quantidade necessária de tampão de lise detergente triplo suplementado com NaF, NaVO 3 e inibidor de protease / fosfatase, conforme indicado na Tabela de Materiais , utilizando as seguintes fórmulas. Ratos: tampão necessário (μL) = peso do tecido do mouse (mg) x 3; Rato: necessárioTampão (μL) = peso do tecido do rato (mg) x 5. </li><li> Adicione a quantidade necessária de tampão de lise gelada (calculado no passo 2.1.4) ao tubo de 2 mL contendo o tecido. NOTA: Nas etapas 2.1.5-2.1.6, avance com um único tubo por vez. </li><li> Homogeneizar o tecido por 30-40 s usando homogeneização contínua em um moedor de tecido; Sempre mantenha o tubo no gelo. Ajuste o homogeneizador de tecido em velocidade média e mova suavemente o moedor para cima e para baixo dentro do tubo. </li><li> Repita os passos 1.6 e 1.7 com os outros tubos. </li><li> Incubar os lisados ​​no gelo durante 10 a 30 minutos. </li><li> Centrifugue os tubos a 170 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Enquanto isso, identifique 6-10 tubos de microcentrífuga (0.6 mL) para cada amostra e mantenha-os em gelo. </li><li> Assim que a centrifugação for feita, verifique os tubos. Certifique-se de que eles contêm uma camada superior de lisados ​​gordos, límpidos, amarelos a rosa (dependendo do estágio de desenvolvimento) e uma pelota. </li><li> Crie um buraco na camada lipídicaUsando uma ponta de pipeta de 200 μL para acessar a fase líquida. Mude a ponta e cole o lisado sem perturbar o sedimento ou aspirar a camada lipídica. Alíquota o lisado em tubos pré-rotulados em gelo (passo 2.1.11) e guarde-os a -80 ° C. </li><li> Use uma alíquota para quantificar a concentração de proteína usando um kit disponível comercialmente disponível (veja a Tabela de Materiais ). </li></ol></li><li> Imunoprecipitação indireta <ol><li> No gelo, descongelar duas alíquotas do total de lisados ​​de glândula mamária preparados anteriormente. NOTA: Uma alíquota será usada para o IP da proteína alvo, enquanto a outra servirá como controle negativo. </li><li> Coletar 500-1,000 μg do lisado e diluí-lo em PBS para atingir um volume final de 200 μL em cada tubo de 1,5 mL. NOTA: A quantidade de lisado a ser usado depende da abundância da proteína de interesse e da eficiência do anticorpo (veja a Figura 3 para umaN exemplo, bem como a tabela de materiais ). Para otimizar para cada alvo, devem ser utilizadas diferentes quantidades de lisado ( isto é, 500, 750 e 1000 μg) e anticorpo ( isto é, 5, 10 e 20 μg). Prossiga com as seguintes etapas (2.2.3-2.3.7.4). </li><li> Adicione o anticorpo contra o antígeno de interesse para o primeiro tubo de lisado e mantenha-o no gelo. NOTA: A quantidade necessária geralmente é sugerida na folha de instruções fornecida por cada empresa (consulte a Tabela de Materiais ). </li><li> No segundo tubo, prepare um controle negativo adicionando a mesma concentração de controle de isotipo IgG como o anticorpo usado no passo 2.2.3. </li><li> Incubar os tubos durante a noite a 4 ° C em um misturador de rolos de tubo a baixa velocidade. </li><li> No dia seguinte, adicione 50 μL de pérolas magnéticas a novos tubos de 1,5 mL para pré-lavagem. <ol><li> Selecione as pérolas magnéticas Protein A ou Protein G com base na afinidade relativa do anticorpo. </lI&gt; <li> É importante evitar o uso de grânulos agregados; Misture suavemente a suspensão do talão até que seja novamente suspenso antes de adicioná-lo aos tubos. </li></ol></li><li> Coloque os tubos contendo as contas no suporte magnético e permita que as pérolas migrem para o ímã. Remova o buffer de armazenamento das contas usando uma pipeta de 200 μL. </li><li> Lavar as esferas adicionando 500 μL de PBS-0,1% de polissorbato 20 e agitar os tubos vigorosamente durante 10 s. </li><li> Coloque os tubos de volta no suporte magnético e permita que os grânulos migrem para o ímã. </li><li> Remova o excesso de tampão de lavagem por pipetagem com uma pipeta de 200 μL. </li><li> Adicionar o complexo de reação (anticorpo-lisado) do passo 2.2.5 às esferas e incubar durante 90 minutos à TA no misturador de rolos. </li><li> Coloque os tubos no suporte magnético e permita que os grânulos migrem para o ímã. Usando uma pipeta de 200 μL, aspirar e descartar o lisado e colocar os tubos no gelo. </li><li> Lave a contaS adicionando 500 μL de PBS, colocando os tubos no suporte magnético e removendo o líquido usando uma pipeta de 200 μL. Repita este passo de lavagem. Durante as etapas de lavagem, evite o vortex e mantenha as amostras no gelo. </li><li> Lave as contas uma vez com PBS-0.1% de polissorbato 20 sem vortexar e descarte o último tampão de lavagem usando uma ponta de pipeta de 200 μL. </li><li> Para eluir, adicione 20 μL de glicina ácida 0,2 M (pH = 2,5) aos tubos e agite-os durante 7 minutos no misturador de rolos. </li><li> Centrifugar a alta velocidade por alguns segundos (rotação rápida) e coletar o sobrenadante em um tubo gelado fresco. </li><li> Repita as etapas 2.2.14 e 2.2.15 para cada tubo. NOTA: O volume final será de 40 μL. </li><li> Adicione 10 μL de tampão 4x Laemmli à amostra eluída de 40 μL do passo 2.2.16. NOTA: A cor ficará amarela devido ao pH ácido. </li><li> Adicione imediatamente 1 M Tris (pH = 8), uma gota por vez, à amostra eluída do passo 2.2.18 até sua corFica azul. Prossiga para os próximos tubos. </li><li> Ferver as amostras do passo 2.2.18 a 70-90 ° C durante 10 min. Proceda imediatamente à eletroforese em gel. Alternativamente, transfira as amostras para um congelador a -80 ° C até o carregamento. </li></ol></li><li> Aplicação a jusante: eletroforese em gel seguida de Western Blot <ol><li> Prepare a separação e o empilhamento de gel de acrilamida SDS-PAGE (1,5 mm de espessura) seguindo os procedimentos padrão 15 . NOTA: A escolha do gel (8-15% de acrilamida, gradiente: ver a Tabela de Materiais ) deve ser determinada com base no tamanho molecular da proteína a ser precipitada e dos potenciais parceiros de ligação a serem analisados. Essas proteínas devem ser resolvidas umas das outras para permitir a imunodetecção adequada. </li><li> Destilar as amostras ligadas à imunoprecipitação (IP) (passo 2.2.20) no gelo. </li><li> Prepare lisins proteicos das mesmas amostras (usado para o procedimento IP acima). Use 50Μg de lisado total e adicione o tampão de amostra 4X Laemmli. Cozinhe as amostras a 70-90 ° C por 5 min e coloque no gelo até o carregamento. NOTA: Estas amostras serão carregadas ao lado da amostra IP eluída para demonstrar a presença de proteínas precipitadas no lisado total. </li><li> Carregar os lisados ​​preparados a partir do passo 2.3.3 e as amostras precipitadas do passo 2.2.20 lado a lado em um gel de acrilamida e executá-los em tampão de corrida (10x tampão corrente: 30,3 g de Tris, 144,1 g de glicina e 10 G de SDS em 1 L de água destilada) a 100 V por aproximadamente 95 min, ou até a borda das proteínas migratórias chegar ao fundo do gel. </li><li> Transfira os géis para uma membrana de nitrocelulose ou PVDF usando um protocolo padrão 9 , 15 . </li><li> Bloqueie a membrana durante 1 h em um balancim em baixa velocidade em 5% de TTBS com leite seco (Tris 20 mM, NaCl 500 mM e polissorbato a 0,05% 20). </li><li> Identifique se a precipitação foi sucObrigado. <ol><li> Sonda a membrana utilizando o primeiro anticorpo contra a proteína precipitada, diluída em 5% de TTBS de leite seco na concentração recomendada pelo fabricante, durante a noite a 4 ° C em uma plataforma de balanço com agitação lenta. NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter recomendações. </li><li> No dia seguinte, lave a membrana 3 vezes por 5 min cada uma com TTBS em uma plataforma de balanço com alta agitação. </li><li> Incube a membrana no anticorpo secundário apropriado conjugado com peroxidase de rábano (HRP), diluído em TTBS, durante 1 h na RT em uma plataforma de balanço com agitação lenta. NOTA: Alternativamente, um anticorpo secundário conjugado com um fluorochrome pode ser usado se um aparelho apropriado para detectar o sinal estiver disponível. </li><li> Execute 3 a 6 lavagens, cada uma por 5 min, com TTBS em uma plataforma de balanço com alta agitação. Analisar o sinal do anticorpo secundário incubando a membrana com um comercialmenteSolução luminólica disponível (consulte a Tabela de Materiais ) e siga as instruções do fabricante. Detectar o sinal usando um sistema de imagem de quimioluminiscência (ver Tabela de Materiais ). NOTA: Para um protocolo detalhado sobre análise de transferência de Western, consulte a Referência 16. </li></ol></li><li> Para identificar as proteínas que interagem, execute as etapas 2.3.7.1-2.3.7.4 usando os anticorpos apropriados na mesma mancha. NOTA: Se as proteínas estão interagindo, os parceiros de ligação serão co-imunoprecipitados com a proteína alvo e, portanto, serão detectáveis ​​por Western Blot. O passo 2.3.8 pode ser repetido com mais anticorpos para determinar se outras proteínas residem no mesmo complexo de proteínas, desde que os pesos moleculares das proteínas diferem o suficiente para estar bem separados no gel e na membrana. </li><li> Para confirmar que os parceiros de ligação identificados não são artefatos, o IP recíproco deve ser realizado. NOTA: isto é executado repetindoPassos 2.2.1-2.2.20 com o mesmo lisado, mas precipitando um dos parceiros de ligação identificados no passo 3.8. Em seguida, as etapas 3.1-3.8 são repetidas usando o anticorpo primário contra a primeira proteína de interesse. </li></ol></li></ol>

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<li>Malovannaya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streamlined+analysis+schema+for+high-throughput+identification+of+endogenous+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Streamlined analysis schema for high-throughput identification of endogenous protein complexes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (6), 2431-2436 (2010).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a declarar.

As interações célula-célula através das junções são necessárias para o bom funcionamento e desenvolvimento de muitos órgãos, como a glândula mamária. Estudos demonstraram que as proteínas juncionais podem regular a função e a estabilidade uns dos outros e ativar a transdução do sinal ao se amarrar na membrana celular 10 . Os protocolos apresentados no manuscrito atual forneceram achados interessantes sobre expressão, localização e interação diferencial de proteínas juncionais durante o desenvolvi...

O crescimento e desenvolvimento das glândulas mamárias ocorre principalmente após o nascimento. Este órgão se remodela constantemente ao longo da vida reprodutiva de um mamífero 1 . O epitélio da glândula mamária adulta é constituído por uma camada interna de células epiteliais luminal e uma camada externa de células basais, composta principalmente de células mioepiteliais, cercadas por uma membrana basal 2 . Para uma boa revisão sobre a estrutura e desenvolvimento da glândula mamária, o leitor pode se referir ao Sternlicht 1 . As interações célula-célula através das juntas gap (GJ), tight (TJ) e adherens (AJ) são necessárias para o desenvolvimento e função normal da glândula 1 , 3 , 4 , 5 , 6 . Os principais componentes dessas junções na glândula mamária murina são Cx26, Cx30, Cx32 e Cx43 (GJ); Claudin-1, -3, -4 e -7 eZO-1 (TJ); E E-caderina, P-caderina e β-catenina (AJ) 7 , 8 . Os níveis de expressão dessas diferentes proteínas juncionais variam de maneira dependente do estágio durante o desenvolvimento da glândula mamária, sugerindo requisitos diferenciais de interação célula-célula 9 . GJ, TJ e AJ estão ligados estruturalmente e funcionalmente e ligam outras proteínas estruturais ou reguladoras aos locais vizinhos de células adjacentes, criando assim um nexo juncional 10 . A composição do nexo juncional pode impactar a ponte com o citoesqueleto subjacente, bem como a permeabilidade e a estabilidade do nexo e, conseqüentemente, influenciar a função da glândula 8 , 9 , 10 , 11 . Os componentes das junções intercelulares que residem em nexos de junção ou interagem uns com os outros em difOs estádios de desenvolvimento do desenvolvimento da glândula mamária foram recentemente analisados ​​utilizando co-imunofluorescência (co-IF) e co-imunoprecipitação (co-IP) 9 . Enquanto outras técnicas permitem a avaliação da associação funcional entre proteínas, esses métodos não são apresentados neste manuscrito. Como as proteínas apenas atuam sozinhas para funcionar, o estudo das interações proteína-proteína (IPPs), como transduções de sinais e cascatas bioquímicas, é essencial para muitos pesquisadores e pode fornecer informações significativas sobre a função das proteínas. A co-IF e a análise microscópica ajudam a avaliar algumas proteínas que compartilham o mesmo espaço subcelular. No entanto, o número de alvos é limitado pelos anticorpos, que devem ser criados em diferentes animais e pelo acesso a um microscópio confocal equipado com diferentes lasers de comprimento de onda e um detector espectral para multiplexação. O Co-IP confirma ou revela interações físicas de alta afinidade entreEen duas ou mais proteínas que residem dentro de um complexo protéico. Apesar do desenvolvimento de novas técnicas, como a transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) 12 e o ensaio de ligação de proximidade (PLA) 13 , que pode detectar simultaneamente a localização e as interações de proteínas, o co-IP continua sendo uma técnica apropriada e acessível para estudar interações entre Proteínas endógenas. O método passo-a-passo descrito neste manuscrito facilitará o estudo da localização da proteína e PPIs e apontará armadilhas para evitar ao estudar PPIs endógenos nas glândulas mamárias. A metodologia começa com a apresentação dos diferentes procedimentos de preservação dos tecidos necessários para cada técnica. A Parte 1 apresenta como estudar a co-localização de proteínas em três etapas: i) o corte das glândulas mamárias, ii) a rotulagem dupla ou tripla de diferentes proteínas usando a técnica co-IF, e iii) a imagem deLocalização de proteínas. A Parte 2 mostra como precipitar uma proteína endógena e identificar suas proteínas que interagem em três etapas: i) preparação do lisado, ii) imunoprecipitação indireta da proteína e iii) identificação do parceiro de ligação por SDS-PAGE e Western blot. Cada passo deste protocolo é otimizado para os tecidos das glândulas mamárias de roedores e gera resultados de alta qualidade, específicos e reprodutíveis. Este protocolo também pode ser usado como ponto de partida para estudos de PPI em outros tecidos ou linhas celulares.

<table><tbody><tr><td>Linhagem e estágio de camundongos</td><td>St. Constant, Quebec, Canadá</td><td></td><td>C57BL / 6 Femals; dia de gravidez 18 (P18) e dia de lactação 14 (L14), Charles River Canada&nbsp;</td></tr><tr><td>PBS 10x (estoque)</td><td></td><td></td><td>1) Dissolver 80 g de NaCl (F.W.: 58,44), 2 g de KCl (F.W. 74,55), 26,8 g Na2HPO4&#183; 7H2O (F.W. 268,07) e 2,4 g KH2PO4 (F.W.:136,09) em 800 mL de água destilada; 2) Ajustar o PH para 7,4; 3) Adicione água para atingir o volume final de 1 L.</td></tr><tr><td>TBS 10x (estoque)</td><td></td><td></td><td>1) Dissolver 60,5 g de TRIS, 87,6 g de NaCl em 800 mL de água destilada; 2) Ajuste o pH para 7,5; 3) Adicione água até chegar ao volume final de 1 L.</td></tr><tr><td colspan="4">Parte 1: Imunofluorescência</td></tr><tr><td>Meios de congelamento</td><td>VWR International, Ville Mont-Royal, QC, Canadá</td><td>95067-840</td><td>Composto de seções congeladas VMR&nbsp;</td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Mississauga, ON, Canadá</td><td>956640</td><td>Microm HM525, Thermo fisher scientific HM525 NX Cryostat 115 V 60 Hz</td></tr><tr><td>Lâminas</td><td>C.L. Sturkey, Inc. Les Produits&nbsp; Scientifiques&nbsp; ESBE&nbsp; St-Laurent, QC, Canadá</td><td>BLM1001C</td><td>Lâminas revestidas a ouro de alto perfil</td></tr><tr><td>Caneta de Papanicolau</td><td>Cedarlane, Burlington, ON, Canadá</td><td>8899</td><td>Caneta Super PAP, Thermo Fisher</td></tr><tr><td>Scientific Lâminas microscópicas</td><td>Fisher Scientific, Burlington, ON, Canadá</td><td>12-550-15</td><td>Fisherbrand&nbsp; Lâminas de microscópio Superfrost Plus</td></tr><tr><td>Formaldeído</td><td>BioShop Canada Inc, Burlington, ON, Canadá</td><td>FOR201.1</td> Albumina de soro bovino <td>Forlmadehyde</td></tr><tr><td>(BSA)</td> <td>Santa Cruz Biotechnology, Inc, Califórnia, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução</td><td></td><td></td> de bloqueio <td>3% BSA em TBS</td></tr><tr><td></td><td></td><td>Solução de lavagem</td><td>TBS-Tween 20 0,1%</td></tr> <tr><td>Polissorbato 20</td><td>Oakville, ON, Canadá</td><td>P 9416</td><td>Tween 20, Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Mídia de montagem</td><td>Cedarlane, Burlington, ON</td><td>17984-25(EM)</td><td>Fluoromount-G</td></tr><tr><td>Anticorpos primários e secundários</td><td>Sinalização celular, Beverly, MA, EUA</td><td>Veja comentários</td><td>E-Caderina (4A2) Mouse mAb (#14472s) 1/50 (Sinalização celular) com anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 555 (#4409s), Sinalização celular&nbsp;</td></tr><tr><td>Anticorpos primários e secundários&nbsp;</td><td>Tecnologias de vida, Waltham, MA, EUA e Cell Signaling, Beverly, MA, EUA</td><td>Veja os comentários</td><td>Claudin-7 (#34-9100) 1/100 (Life Technologies) com IgG anti-coelho Fab2 Alexa Fluor 488 (#4412s) (Cell Signaling)&nbsp;</td></tr><tr><td>Anticorpos primários e secundários&nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc, Califórnia, EUA; Fischer Scientific, Burlington, ON, Canadá&nbsp;</td><td>Ver comentários</td><td>&beta;-Anticorpo Catenina (C-18): sc-1496 (SANTA CRUZ) com anti-IgG de cabra (H+L) Alexa Fluor 568 (#A11057), Sonda Molecular (Fisher Scientific)</td></tr><tr><td>Anticorpos primários e secundários&nbsp;</td><td>Tecnologias de vida, Waltham, MA, EUA e Cell Signaling, Beverly, MA, EUA</td><td>Ver Comentários</td><td>Connexin26&nbsp; (#33-5800) 1/75 (Life Technologies) com IgG anti-mouse Fab2 Alexa Fluor 647 (#4410s)&nbsp;</td></tr><tr><td>Coloração de núcleos</td><td>Fisher Scientific, Burlington, ON, Canadá</td><td>D1306</td><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dicloridrato) 1/1,000 in PBS</td></tr><tr><td>Microscópio fluorescente</td><td>Nikon Canadá, Mississauga, On, Canadá</td><td></td><td>Laser microscópico confocal Nikon A1R+ equipado com um detector espectral&nbsp;</td></tr><tr><td>Software de análise de imagens IF</td><td>Nikon Canada, Mississauga, On, Canada</td><td></td><td>Software NIS-elements (versão 4)</td></tr><tr><td colspan="4">Parte 2: Imunoprecipitação</td></tr><tr><td>Trim Detergente Tampão de lise (100&nbsp; mL) pH=8,0</td><td></td><td></td><td>1) Misture 50 mM TRIS (F.W.: 121,14), 150&nbsp; mM NaCl (F.W.: 58.44), 0.02% Azida de Sódio, 0.1% SDS, 1% NONIdET P40, 0.5% Desoxicolato de Sódio em 80 mL destilado H2O. 2) Ajuste o pH para 8.0 com HCl 6&nbsp; N (~0,5&nbsp; mL). 3) Ajuste o volume para 100&nbsp; mL. Guarde na geladeira. No dia da extração da proteína, use 1/100 NaVo3, 1/100 inibidor de protease/fosfatase e 1/25 NAF na quantidade calculada de tampão de lise de detergente triplo: Solução de fluoreto de sódio (estoque) 1.25&nbsp; M (F.W.: 41.98), Solução de Ortovanadato de Sódio (estoque) 1&nbsp; M (F.W.: 183.9)</td></tr><tr><td>Inibidor de protease/fosfatase</td><td>Fisher Scientific, Burlington, ON</td><td>78441</td><td>Coquetel Halt Protease e Inibidor de Fosfatase, sem EDTA (100x)</td></tr><tr><td>Dosagem de proteína</td><td>Thermo Scientific, Rockford, Illinois, EUA</td><td>23225</td><td>Kit de ensaio de proteína Pierce BCA&nbsp;</td></tr><tr><td>Triturador de tecidos</td><td>Fisher Scientific, Burlington, ON</td><td>FTH-115</td><td>Power 125, Modelo FTH-115</td></tr><tr><td>Grânulos magnéticos e suporte</td><td>Millipore, Etobicoke, ON, Canadá</td><td></td><td>PureProteome Protein G Magnetic Bead System (LSKMAGG02)</td></tr><tr><td>Solução de lavagem para IP</td><td></td><td></td><td>PBS ou PBS-Tween20 0,1% dependendo da etapa</td></tr><tr><td>Anticorpos primários para imunoprecipitação</td><td>Sinalização celular, Beverly, MA, EUA</td><td>Ver Comentários</td><td>IgG Coelho (coelho (DA1E) mAb IgG Controle de isotipo (#3900s) (Sinalização celular) 0,5 &micro; L/200 e micro; L</td></tr><tr><td>Anticorpos primários para imunoprecipitação</td><td>Sinalização celular, Beverly, MA, EUA</td><td>Ver comentários</td><td>Camundongo IgG camundongo (G3A1) mAb IgG Controle de isotipo (#5415s) (Sinalização celular) 0,5 &micro; L/200 e micro; L</td></tr><tr><td>Anticorpos primários para imunoprecipitação</td><td>Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canadá</td><td>Ver comentários</td><td>Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 4&nbsp; &micro; L/200&nbsp; &micro; L</td></tr><tr><td>Anticorpos primários para imunoprecipitação</td><td>Sinalização celular, Beverly, MA, EUA</td><td>Ver comentários</td><td>E-caderina (4A2) Camundongo mAb (#14472s) (Sinalização celular) 1 &micro; L/200 e micro; L</td></tr><tr><td>Tampão Laemmli&nbsp;</td><td>BIO-RAD, Mississauga, Ontário, Canadá</td><td>1610747</td><td>4x Tampão de Amostra Laemmli (Adicione &beta;-mercaptoetanol seguindo recomendação do fabricante)</td></tr><tr><td>Glicina ácida&nbsp;</td><td>Fisher Scientific, Burlington, ON</td><td>PB381-5</td><td>0,2 M glicina; ajuste o pH = 2,5 com HCl&nbsp;</td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td><td>Fisher Scientific, Burlington, ON</td><td>BP152-1</td><td>1 M (pH=8)&nbsp;</td></tr><tr><td>Géis de acrilamida SDS-PAGE&nbsp;</td><td>BIO-RAD, Mississauga, ON, Canadá</td><td>1610180 -5</td><td>Soluções de Acrilamida FastCast Sem Manchas TGX (7.8%, 10%, 12%)</td></tr><tr><td>Buffer de corrida 10x&nbsp;</td><td>BIO-RAD, Mississauga, ON, Canadá</td><td>1704272</td><td>Tris 30.3&nbsp; g/glicina 144.1&nbsp; g /SDS 10&nbsp; g em 1 L de membranas de água destilada</td></tr><tr><td></td><td>BIO-RAD, Mississauga, ON, Canadá</td><td>1704272</td><td>membranas de PVDF, Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit</td></tr><tr><td>Método</td><td>de transferência BIO-RAD, Mississauga, ON, Canadá</td><td>1704155</td><td>Trans-Blot Turbo Transfer System</td></tr><tr><td>Dry Milk</td><td>Smucker Food of Canada Co, Markham, ON, Canadá</td><td></td><td>Leite em pó desnatado instantâneo sem gordura,</td></tr><tr><td>solução de bloqueio de cravo para borrões</td><td></td><td></td><td>5% leite em pó em TBS-Tween 20 0,1%</td></tr><tr><td>Soluções de lavagem para borrões</td><td></td><td></td><td>TBS-Tween 20 0,1%</td></tr><tr><td>Anticorpos primários e secundários para borrões (10&nbsp; mL)</td> <td>Sigma-Aldrich, Oakville, Ontário e Abcam, Toronto, ON, Canadá</td><td>Ver comentários</td><td>Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 1/2.500 com Veriblot conjugado com HRP para anticorpo secundário IP (ab131366) 1/5.000 (Abcam, Toronto, ON, Canadá)</td></tr><tr><td>Anticorpos primários e secundários para blots (10&nbsp; mL)</td> <td>Sinalização Celular, Beverly, MA, EUA e Abcam, Toronto, ON, Canadá</td><td>Ver comentários</td><td>E-caderina (24E10) coelho mAb 1/1.000 (#3195s) (Sinalização celular) 1/1.000 com Veriblot conjugado com HRP para anticorpo secundário IP (ab131366) 1/5.000 (Abcam, Toronto, ON, Canadá)</td></tr><tr><td>Anticorpos primários e secundários para blots (10&nbsp; mL)</td> <td>Tecnologias de vida, Waltham, MA, EUA e Abcam, Toronto, ON, Canadá</td><td>Ver comentários</td><td>Claudin-7 (#34-9100) (Life technologies) 1/1.000 com Veriblot conjugado com HRP para anticorpo secundário IP (ab131366) 1/5.000 (Abcam, Toronto, ON, Canadá)</td></tr><tr><td>Anticorpos primários e secundários para blots (10&nbsp; mL)</td> <td>Tecnologias de vida, Waltham, MA, EUA e Abcam, Toronto, ON, Canadá</td><td>Ver comentários</td><td>Claudin3 (#34-1700) (Life technologies) 1/1.000 com Veriblot conjugado com HRP para anticorpo secundário IP (ab131366) 1/5.000 (Abcam, Toronto, ON, Canadá)</td></tr><tr><td>Solução de luminol para detecção de sinal em borrões</td><td>BIO-RAD, Mississauga, ON, Canadá</td><td>1705061</td><td>Clarity Western ECL Blotting Substrate</td></tr><tr><td>Imaging blots</td><td>BIO-RAD, Mississauga, ON, Canadá</td><td>1708280</td><td>ChemiDoc MP imaging sistema</td></tr><tr><td>de análise de borrões</td><td>BIO-RAD, Mississauga, ON, Canadá</td><td></td><td>Software ImageLab 5.2&nbsp;</td></tr></tbody></table>

análise das interações proteína-proteína e co-localização entre componentes das juntas abertas, apertadas e aderentes nas glândulas mamárias murinas

Analysis of Protein-protein Interactions and Co-localization Between Components of Gap, Tight, and Adherens Junctions in Murine Mammary Glands

As interações célula-célula desempenham um papel fundamental na preservação da integridade do tecido e da barreira entre os diferentes compartimentos da glândula mamária. Essas interações são fornecidas por proteínas juncionais que formam nexos entre células adjacentes. A mislocalização da proteína juncional e as associações físicas reduzidas com seus parceiros de ligação podem resultar na perda de função e, consequentemente, na disfunção orgânica. Assim, identificar a localização da proteína e as interações proteína-proteína (IPPs) em tecidos normais e relacionados à doença é essencial para encontrar novas evidências e mecanismos que conduzam à progressão de doenças ou alterações no estado de desenvolvimento. Este manuscrito apresenta um método de dois passos para avaliar PPIs nas glândulas mamárias murinas. Na seção de protocolo 1, é descrito um método para realizar co-imunofluorescência (co-IF) utilizando anticorpos criados contra as proteínas de interesse, seguido por anticorpos secundários marcados com fluoroquemas. Embora co-IF tudoOws para a demonstração da proximidade das proteínas, permite estudar suas interações físicas. Portanto, um protocolo detalhado para co-imunoprecipitação (co-IP) é fornecido na seção de protocolo 2. Esse método é usado para determinar as interações físicas entre proteínas, sem confirmar se essas interações são diretas ou indiretas. Nos últimos anos, as técnicas de co-IF e co-IP demonstraram que certos componentes das junções intercelulares co-localizam e interagem juntos, criando nexos juncionais dependentes do estágio que variam durante o desenvolvimento das glândulas mamárias.

Para determinar se os componentes GJ, AJ e TJ podem interagir juntos na glândula mamária, os ensaios co-IF foram realizados pela primeira vez. Cx26, uma proteína GJ e β-Catenin, uma proteína AJ, foram sondados com anticorpos específicos e revelaram-se com anticorpos conjugados com mouse-647 (verde, pseudocolor) e cabra-568 (vermelho), respectivamente ( Figura 1B e C ) . Os dados mostraram que eles co-localizam na membrana celular das células epiteliais n...

As junções intercelulares são requisitos para funções e desenvolvimento específicos do estágio da glândula mamária. Este manuscrito fornece um protocolo detalhado para o estudo das interações proteína-proteína (IPPs) e co-localização usando glândulas mamárias murinas. Estas técnicas permitem a investigação da dinâmica da associação física entre junções intercelulares em diferentes estádios de desenvolvimento.

Análise das Interações Proteína-Proteína e Co-localização entre Componentes das Juntas Abertas, Apertadas e Aderentes nas Glândulas Mamárias Murinas

Cell-cell interactions play a pivotal role in preserving tissue integrity and the barrier between the different compartments of the mammary gland. These ...

O objetivo geral deste método é determinar se duas ou mais proteínas de junções intercelulares co-localizam-se dentro das células e avaliar ainda mais sua interação física por meio de co-imunoprecipitação. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na biologia do campo da glândula mamária, incluindo os papéis desempenhados pelas junções no desenvolvimento normal e em doenças como o câncer de mama. A principal vantagem desta técnica é que ela pode fornecer informações significativas sobre interação proteína-proteína in vivo a um custo relativamente baixo.Para realizar a coloração imunofluorescente dupla, retire os lâminas microscópicas apropriados do congelador. Fixe imediatamente as seções imergindo-as em formaldeído a quatro por cento durante 15 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, imerja as lâminas em solução salina tamponada com fosfato à temperatura ambiente.Deixe as lâminas nesse local até prosseguir para o próximo passo. Contorne cada seção da lâmina utilizando uma barreira hidrofóbica disponível comercialmente ou uma caneta laboratorial repelente à água. Adicione imediatamente gotas de PBS ao tecido e coloque a lâmina em uma câmara de histologia humana

analysis-protein-protein-interactions-co-localization-between

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Este método descreve como dissecar e avaliar o desenvolvimento da glândula mamária e na função de camundongos. Excisadas glândulas mamárias são avaliados quanto ao grau de desenvolvimento usando montar todo, enquanto a ejeção do leite é avaliada através de um ensaio de oxitocina baseado contração mioepiteliais celular.

Avaliação do desenvolvimento da glândula mamária e Função em modelos de ratos

Apresentamos uma abordagem de registro de imagem para reconstrução de volume de histologia tridimensional (3D), o que facilita o estudo das alterações de um órgão ao nível de macroestruturas compostas por células . Usando essa abordagem, estudamos as mudanças 3D entre as glândulas mamárias do tipo selvagem e Igfbp7-nulo.

Reconstrução de 3-Dimensional Volume Histologia e sua Aplicação para o Estudo de Rato glândulas mamárias

Esta apresentação demonstra um método pelo qual a eletroporação de células aderentes e cultivadas é usada para o estudo da comunicação intercelular e juncional, enquanto as células crescem em uma lâmina revestida com óxido de índio-estanho condutor e transparente.

Um ensaio funcional para juncional Exame; Eletroporação de aderentes em células no Índio-Tin Oxide

O protocolo de imunofluorescência indirecta descrito neste artigo permite a detecção e a localização de proteínas na glândula mamaria do rato. Um método completo é dada para preparar amostras da glândula mamaria, a efectuar imuno-histoquímica, para as secções de tecido imagem por microscopia de fluorescência, e para reconstruir imagens.

Imunofluorescência Indireta em cortes congelados de Rato glândula mamária

Desenvolvemos um método para remover, processar, cortar e manchar com sucesso, para avaliação histopatológica, tecido mamário que inicialmente havia sido fixado em slides como montagens inteiras. Este método pode promover a coleta e avaliação de montantes inteiros de glândula mamária em estudos de diretrizes de testes reprodutivos e de desenvolvimento.

Seção de mamíferos mamários completos para identificação de lesões

Aqui, apresentamos um protocolo para a isolação do rato inteiro, intacto, glândulas mamárias para investigar a expressão da matriz extracelular (ECM) e morfologia ductal. Mouse #4 glândulas abdominais foram extraídas dos ratos de 8-10 semanas nulíparas fêmeas, fixados em formalina tamponada neutra, seccionado e manchado usando imuno-histoquímica para proteínas de ECM.

Isolamento de glândulas mamárias de Mouse intacto, todo para a análise da expressão de matriz extracelular e morfologia da glândula

Descrevemos técnicas de indução de diferenciação de duas linhas epiteliais mamárias, HC11 e EpH4. Embora ambos exijam soro fetal, insulina e prolactina para produzir proteínas lácteas, as células EpH4 podem se diferenciar totalmente das mamografias na cultura tridimensional. Esses modelos complementares são úteis para estudos de transdução de sinal de diferenciação e neoplasia.

Diferenciação das células Epiteliais do Peito do Camundongo HC11 e EpH4

A glândula mamária é uma estrutura bicamada, composta por células epiteliais mioepiteleliais externas e internas. Apresentado é um protocolo para preparar organóides utilizando a tripspsinização diferencial. Este método eficiente permite que os pesquisadores manipulem separadamente esses dois tipos de células para explorar questões sobre seus papéis na forma e função da glândula mamária.

Geração de Organóides Mammary mosaicos por Trypsinização Diferencial

Este protocolo descreve uma nova janela de imagem mamária com uma tampa substituível (R.MIW). A microscopia intravital após a implantação do R.MIW permite imagens longitudinais e de vários dias da glândula mamária saudável e doente com resolução celular durante os diferentes estágios de desenvolvimento.

Microscopia intravital longitudinal usando uma janela de imagem mamária com tampa substituível

O presente protocolo descreve uma técnica fácil para a imagem intravital da glândula mamária de camundongos lactantes por microscopia confocal e multifotônica de varredura a laser.

Microscopia Subcelular Intravital da Glândula Mamária

Aprenda a analisar interações proteína-proteína e co-localização entre componentes de juntas celulares em glândulas mamárias murinas usando co-imunoprecipitação e imunofluorescência. Este método permite estudar o desenvolvimento normal e mecanismos do câncer de mama.

Análise das Interações Proteína-Proteína e Co-localização entre Componentes das Juntas Abertas, Apertadas e Aderentes nas Glândulas Mamárias Murinas (Vídeo) | JoVE Journal

Análise das Interações Proteína-Proteína e Co-localização entre Componentes das Juntas Abertas, Apertadas e Aderentes nas Glândulas Mamárias Murinas

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