Análise das Interações Proteína-Proteína e Co-localização entre Componentes das Juntas Abertas, Apertadas e Aderentes nas Glândulas Mamárias Murinas

O objetivo geral deste método é determinar se duas ou mais proteínas de junção intercelular co-localizam dentro das células e avaliar melhor sua interação física por meio de co-imunoprecipitação. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na biologia do campo da glândula mamária, incluindo os papéis desempenhados pelas junções no desenvolvimento normal e doenças como o câncer de mama. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode fornecer informações significativas sobre a interação proteína-proteína in vivo a um custo relativamente baixo.

Para realizar a coloração co-imunofluorescente, retire as lâminas microscópicas apropriadas do freezer. Fixe imediatamente as seções mergulhando-as em formaldeído a quatro por cento por 15 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, mergulhe as lâminas em solução salina tamponada com fosfato à temperatura ambiente.

Deixe os slides lá até prosseguir para a próxima etapa. Circule cada seção da lâmina usando uma barreira hidrofóbica disponível comercialmente ou uma caneta de laboratório repelente de água. Adicione imediatamente gotas de PBS ao tecido e coloque a lâmina em uma câmara de histologia humana pelo restante do procedimento.

Bloqueie cada seção de tecido com 100 a 200 microlitros de solução salina tamponada com albumina de soro bovino a três por cento, 0,1% de polissorbato-20, por 30 minutos em temperatura ambiente. Enquanto as amostras estão bloqueando, prepare as soluções de anticorpos primários e secundários diluindo os anticorpos em TBS 0,1% polissorbato-20. Após remover a solução de bloqueio por aspiração, incubar as seções em 100 a 200 microlitros do anticorpo primário diluído por 60 minutos à temperatura ambiente.

Em seguida, remova a solução primária de anticorpos por aspiração e lave as seções com 250 a 500 microlitros de TBS 0,1% polissorbato-20 por cinco minutos. Remova a solução de lavagem por aspiração antes de repetir a lavagem duas vezes. Aspire a solução de lavagem e incube as seções com 100 a 200 microlitros do anticorpo secundário conjugado com Fluoro-4 apropriado por 60 minutos em temperatura ambiente.

Após remover a solução de anticorpo secundário por aspiração, lave as seções com 250 a 500 microlitros de TBS 0,1% polissorbato-20 por cinco minutos. Remova a solução de lavagem e repita duas vezes. Repita essas etapas usando a combinação apropriada de corpos primários e secundários para quaisquer proteínas subsequentes de interesse.

Após a remoção da lavagem final, realize a coloração dos núcleos incubando a seção com 100 a 200 microlitros de um miligrama por mililitro DAPI e TBS 0,1% polissorbato-20 por cinco minutos em temperatura ambiente. Aspire a solução DAPI e monte as lâminas usando um meio de montagem solúvel em água e sem fluorescência e lamínulas. Coloque as lâminas planas em uma geladeira de quatro graus Celsius por pelo menos oito horas.

Prossiga para a imagem microscópica de fluorescência conforme descrito no protocolo de texto. Colete 500 a 1000 microgramas do lisado e dilua-o em PBS para cada um volume final de 200 microlitros em cada tubo de 1,5 mililitro. Adicione o anticorpo contra o antígeno de interesse ao primeiro tubo de lisado e mantenha-o no gelo.

Incube os tubos durante a noite a quatro graus Celsius em um misturador de rolos tubulares em baixa velocidade. No dia seguinte, adicione 50 microlitros de esferas magnéticas aos novos tubos de 1,5 mililitro para pré-lavagem. Coloque os tubos contendo as contas no suporte magnético e permita que as contas migrem em direção ao ímã.

Remova o tampão de armazenamento dos grânulos usando uma pipeta de 200 microlitros. Lave as esferas adicionando 500 microlitros de PBS 0,1% polissorbato-20 e agite os tubos vigorosamente por 10 segundos. Em seguida, coloque os tubos de volta no suporte magnético e deixe as contas migrarem em direção ao ímã.

Remova o excesso de tampão de lavagem pipetando com uma pipeta de 200 microlitros. Adicione o complexo de reação do anticorpo lisado aos grânulos e incube por 90 minutos em temperatura ambiente no misturador de rolos. Após a incubação, coloque os tubos no suporte magnético e deixe as contas migrarem em direção ao ímã.

Usando uma pipeta de 200 microlitros, aspire e descarte o lisado e coloque os tubos no gelo. Lave as contas duas vezes adicionando 500 microlitros de PBS, colocando os tubos no suporte magnético e removendo o líquido como antes. Durante as etapas de lavagem, evite vórtices e mantenha as amostras no gelo.

Lave as esferas uma vez com PBS 0,1% polissorbato-20 sem vórtice e descarte o último tampão de lavagem usando uma ponta de pipeta de 200 microlitros. Para eluir, adicione 20 microlitros de glicina ácida 0,2 molar aos tubos e agite-os por sete minutos na batedeira. Depois de centrifugar a alta velocidade durante alguns segundos, recolher o sobrenadante num tubo fresco e gelado.

Repita as etapas de lavagem e eluição para cada tubo. Em seguida, adicione 10 microlitros de tampão 4x à amostra eluída de 40 microlitros. Adicione imediatamente um Molar Tris às amostras eluídas, uma gota de cada vez, até que sua cor fique azul e, em seguida, prossiga para os próximos tubos.

Ferva as amostras eluídas a 70 a 90 graus Celsius por 10 minutos. Carregar os lisados preparados e as amostras precipitadas lado a lado num gel de acrilamida SDS-PAGE. Execute o gel em tampão de corrida a 100 volts por aproximadamente 95 minutos ou até que a borda das proteínas migratórias atinja o fundo do gel.

Posteriormente, transfira os géis para uma membrana de nitrocelulose ou PVDF usando um protocolo padrão. Em seguida, bloqueie a membrana por uma hora em um balancim em baixa velocidade em TTBS de leite em pó a cinco por cento. Para identificar se a precipitação foi bem-sucedida, sonde a membrana usando o primeiro anticorpo contra a proteína precipitada.

Dilua-o em TTBS de leite em pó a cinco por cento na concentração recomendada pelo fabricante. Incube a membrana durante a noite a quatro graus Celsius em uma plataforma de balanço com agitação lenta. No dia seguinte, lave a membrana três vezes por cinco minutos cada com TTBS em uma plataforma de balanço com alta agitação.

Em seguida, incubar a membrana no anticorpo secundário adequado conjugado com peroxidase de rábano, diluído em TTBS, durante uma hora à temperatura ambiente numa plataforma de baloiço com agitação lenta. Realize de três a seis lavagens, cada uma por cinco minutos, com TTBS em uma plataforma de balanço com alta agitação. Analise o sinal do anticorpo secundário incubando a membrana com uma solução de luminol disponível comercialmente e siga as instruções do fabricante.

Detecte o sinal usando um sistema de imagem de quimioluminescência. Para identificar proteínas que interagem, repita essas etapas usando os anticorpos apropriados no mesmo borrão. Para determinar se os componentes da junção comunicante, da junção de aderência e da junção apertada podem interagir juntos na glândula mamária, foram realizados ensaios de co-imunofluorescência.

O ensaio de co-imunofluorescência mostra que a beta-catenina, uma proteína integral da junção aderente, e a Conexina 26, uma proteína da junção comunicante, co-localizam-se na membrana celular das glândulas mamárias de camundongos no sétimo dia de lactação, conforme refletido pela cor amarela. Os núcleos celulares são visualizados com coloração azul DAPI. As criossecções das glândulas mamárias no dia 18 da gravidez foram cortadas e coradas por imunofluorescência para Claudin 7, uma proteína de junção apertada mostrada em verde, E-Cadherin, uma proteína de junção aderente mostrada em vermelho, e Conexin 26, uma proteína de junção gap mostrada em azul coral.

Os núcleos foram corados com DAPI azul. A colocalização de E-Caderina e Claudin 7 é exibida como uma cor amarela a laranja clara, enquanto a colocalização de Conexina 26 com E-Caderina e Claudin 7 resultou em coloração pontuada em branco. Para descobrir quais proteínas juncionais se misturam e se ligam fisicamente na membrana celular, a co-imunoprecipitação foi realizada usando tecidos da glândula mamária de camundongos lactantes.

Os resultados mostraram que a Conexina 43, um componente da junção comunicante, interage com a E-Caderina e a Claudina 7, mas não com a Claudina 3. Esses resultados foram confirmados pela imunoprecipitação recíproca. Quando a E-Caderina foi imunoprecipitada, ela interagiu com a Conexina 43 e a Claudina 7.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em dois dias para co-imunofluorescência para quatro a oito lâminas, e as lâminas podem ser visualizadas no dia seguinte se for realizada corretamente. Ao tentar o procedimento de co-imunofluorescência, é importante lembrar de escolher diferentes anticorpos conjugados com Fluoro 4 criados em diferentes espaços com comprimentos de onda não sobrepostos e selecionar os grânulos magnéticos de proteína A ou G adequados compatíveis com os anticorpos usados para co-imunoprecipitação. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia celular explorarem a interação das junções intercelulares nas glândulas mamárias murinas.

Não se esqueça de que o trabalho é extremamente perigoso e devem ser sempre tomadas precauções ao realizar este procedimento.