Name: Protocolos para Montagem Padrão de DNA C-Brick Usando Cpf1 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Aprenda a montagem de DNA usando o padrão C-Brick com a proteína Cpf1 para engenharia genética. Este método permite a construção iterativa de circuitos genéticos complexos em biologia sintética.

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Agradecemos a Shanghai Tolo Biotech por sua assistência técnica durante o desenvolvimento do padrão C-Brick. Este trabalho foi apoiado por bolsas do Programa de Pesquisa Prioritária Estratégica da Academia Chinesa de Ciências (Grant No. XDB19040200).

1. Preparação de crRNA <ol><li> Preparação de modelos CRRNA <ol><li> Re-suspenda os oligonucleótidos individuais ( Tabela 1 ) em água sem RNase até uma concentração de 10 uM. </li><li> Adicionar 22,5 μL de oligonucleótido de cadeia superior (T7-F na Tabela 1 ), 22,5 μL de oligonucleótido de cadeia inferior ( Tabela 1 ) e 5 μL de tampão de recozimento 10x a um tubo de PCR de 0,2 mL. Certifique-se de que o volume total seja de 50 μL. NOTA: Seis diferentes oligonucleótidos de cadeia inferior são mostrados na Tabela 1 , cada um dos quais deve ser emparelhado individualmente com a T7-F de topo. As letras minúsculas na Tabela 1 representam a sequência a transcrever para a sequência guia de crRNA. 10x Taq PCR buffer pode ser usado em vez do 10x annealing buffer. </li><li> Coloque o tubo de PCR em um termociclador. </li><li> Execute o programa de recozimento: desnaturação inicial a 95 ° C para5 min e depois um tempo de enchimento de 95-20 ° C, com uma diminuição de 1 ° C por minuto no termociclador. NOTA: Imediatamente use as amostras para o passo 1.2.1. </li></ol></li><li> Transcrição e purificação de crRNA <ol><li> Adicionar 38 μL de água sem RNase, 8 μL do molde do passo 1.1.4, 20 μL de tampão de transcrição 5x T7, 20 μL de mistura de NTP (10 μM), 4 μL de inibidor de RNase recombinante (RRI) e 10 ΜL de polimerase de ARN T7 para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Certifique-se de que o volume total seja de 100 μL. </li><li> Coloque o tubo de microcentrífuga em banho-maria a 37 ° C durante a noite (por cerca de 16 h). </li><li> Use um kit de limpeza e concentração de ARN para purificar o ARN transcrito; Siga o protocolo do fabricante. </li><li> Quantificar os RNAs com espectrofotômetros UV-Vis e diluir o RNA para uma concentração de 10 μM. Use as amostras imediatamente ou guarde-as a -80 ° C. NOTA: A sequência crRNAS estão listados na Tabela 2 . </li></ol></li></ol> 2. Construção de peças de C-Brick ( ou seja, a inserção de peças biológicas em um vetor padrão de C-Brick) NOTA: Esta etapa tem três sub-etapas. Para partes biológicas curtas ( por exemplo, promotores e terminadores), é melhor usar o método de PCR direta para inserir as partes biológicas em um vetor padrão C-Brick 4 . Toda a sequência do vetor é mostrada nos dados suplementares, e a seqüência de prefixo e sufixo é mostrada na Figura 1 (etapa 2.1, abaixo). Para as partes biológicas que podem ser facilmente obtidas através da PCR ( por exemplo, com modelos de DNA genômico, plasmídeos ou sequências de DNA sintetizadas de novo ), é melhor usar o método de montagem sem costura para inserir as partes biológicas em um vetor padrão C-Brick (Passo 2.2, abaixo). Para as peças obtidas dos padrões BioBrick e BglBrick, a restriçãoA digestão mediada por enzima e a ligação mediada por ligadura de ADN de T4 podem ser utilizadas para inserir as partes biológicas num vector padrão C-Brick (passo 2.3, abaixo). <ol><li> Construção via amplificação direta de PCR <ol><li> Desenhe e ordene oligonucleótidos para amplificação por PCR. NOTA: O extremo 5 &#39;do oligonucleótido contém a sequência da parte do DNA e a extremidade 3&#39; do oligonucleótido contém a sequência do vetor ( isto é, &quot;GGATCCACTAGTCTCTAGCTCG&quot; na extremidade 3 &#39;da cadeia dianteira e &quot;GGATCCTTTCTCCTCTTTCTAG&quot; Na cadeia inversa). Ou nenhum saliência ou uma saliência de ~ 20 pb podem ser concebidos no extremo 5 &#39;do oligonucleótido. Exemplos específicos podem ser encontrados em um estudo anterior 4 . </li><li> Re-suspenda os oligonucleótidos individuais em água ultra pura até uma concentração de 10 μM. </li><li> Configure as reações de PCR no gelo em um tubo de PCR de 0,2 mL: adicione 18 μL de água ultra pura, 25 μL de 2x PCR buffer, 1 μL de dNTPs (10 μM), 2,5 μL de cada um dos iniciadores direto e reverso (10 μM) do passo 2.1.2, 0,5 μL de vetor padrão C-Brick (50 ng) como modelo e 0,5 μL De polimerase de DNA de alta fidelidade. Certifique-se de que o volume total seja de 50 μL. </li><li> Coloque o tubo diretamente em um termociclador e comece o programa termociclador. Use as amostras imediatamente ou congelar e guarde-as a -20 ° C. </li><li> Programa Thermocycler: um ciclo durante 3 min a 98 ° C; Trinta ciclos durante 10 s a 98 ° C, 20 s a 55 ° C e 2 min a 72 ° C; E um ciclo durante 10 min a 72 ° C. Mantenha a amostra a 16 ° C. </li><li> Adicione 9 μL da mistura do passo 2.1.4 a um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. </li><li> Adicione 1 μL de DpnI e incube durante 1 h num banho de água a 37 ° C. NOTA: Se os primers não tiverem seqüências sobrepostas, adicione 0,5 μL de polinucleotídeo quinase T4 (PNK) e 0,5 μL de T4 DNA ligase e incubar emUm banho de água a 22 ° C durante 1 h. Caso contrário, se os iniciadores contiverem uma seqüência de sobreposição de ~ 20 nt, transformar diretamente os produtos tratados com DpnI em células compatíveis com E. coli (DH10B) (etapa 2.4). O produto de PCR linearizado será circularizado pelo sistema de recombinação no hospedeiro. </li><li> Use as amostras imediatamente ou guarde-as a -20 ° C. </li></ol></li><li> Construção através de montagem sem costura <ol><li> Desenhe e ordene oligonucleótidos para amplificação por PCR. NOTA: A extremidade 3 &#39;do oligonucleótido contém a sequência terminal da parte de DNA e a extremidade 5&#39; do oligonucleótido contém o terminal da sequência de vetor padrão linear C-Brick ( ou seja, &quot;CTAGAAAGAGGAGAAAGGATCC&quot; para o 5 &#39; -end da cadeia direta e &quot;CGAGCTAGAGACTAGTGGATCC&quot; para o extremo 5 &#39;da cadeia reversa). Exemplos específicos podem ser encontrados em um estudo anterior 4 . </li><li> Re-suspenda os indivíduosOligonucleótidos ual em água ultra pura para uma concentração de 10 μM. </li><li> Configure as reações de PCR no gelo em um tubo de PCR de 0,2 mL: adicione 18 μL de água ultra pura, 25 μL de tampão de PCR 2x, 1 μL de dNTPs (10 μM), 2,5 μL cada um dos iniciadores direto e reverso (10 μM ) A partir do passo 2.2.2, 0,5 μL de molde (20-500 ng) e 0,5 μL de DNA-polimerase de alta fidelidade. Certifique-se de que o volume total seja de 50 μL. </li><li> Coloque o tubo diretamente no termociclador e execute o programa termociclador. Use as amostras imediatamente ou congelar e guarde-as a -20 ° C. NOTA: Configure o programa do termociclador para: um ciclo durante 3 min a 98 ° C; 30 ciclos por 10 s a 98 ° C, 20 s a 55 ° C (de acordo com a temperatura de recozimento do primário) e 1 min (de acordo com o comprimento das partes biológicas) a 72 ° C; E um ciclo durante 10 min a 72 ° C. Mantenha a amostra a 16 ° C. </li><li> Purificar o produto de PCR usando um sistema de limpeza por PCRKit tem; Siga o protocolo do fabricante. </li><li> Digerir o vetor padrão C-Brick com BamHI: adicionar 34 μL de água ultra pura, 10 μL de plasmídeo (1 μg), 5 μL de tampão 10x e 1 μL de BamHI ao tubo de microcentrífuga. Incubar até 2 h a 37 ° C num banho de água. </li><li> Purifique o produto acima usando um kit de sistema de limpeza de gel; Siga o protocolo do fabricante. </li><li> Adicione 2 μL de vetor linearizado (50 ng) do passo 2.2.7, 5 μL de fragmento (200 ng) do passo 2.2.4, 2 μL de tampão de montagem sem costura de 5x e 1 μL de enzima de montagem sem costura a partir de um kit de montagem sem costura Para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Certifique-se de que o volume total seja de 10 μL. </li><li> Coloque isso em banho-maria a 37 ° C durante 30 min. Use as amostras imediatamente ou congelar e guarde-as a -20 ° C. </li></ol></li><li> Construção por meio de digestão com restrição de medição enzimática e ligadura mediada por DNA ligase de T4. NOTA: Para as peças obtidas dos padrões BioBrick (passo 2.3.4-2.3.7) e BglBrick (passo 2.3.1-2.3.3), a digestão mediada por enzimas de restrição e a ligadura mediada por DNA ligase T4 pode ser usada para inserir a Partes biológicas em um vetor padrão C-Brick. <ol><li> Digerir as partes padrão BglBrick com BamHI e BglII: adicionar 34 μL de água ultra pura, 10 μL de plasmídeo (2 μg), 5 μL de 10x tampão 3, 0,5 μL de BamHI e 0,5 μL de BglII ao tubo de microcentrífuga. Incubar durante 2 h num banho de água a 37 ° C. </li><li> Execute uma eletroforese em gel de agarose a 1% e purifique o fragmento usando um kit de sistema de limpeza de gel. </li><li> Ligar o fragmento e o vetor padrão C-Brick: adicionar 2 μL de vetor linearizado (50 ng) do passo 2.1.12 e 6 μL de fragmento (200 ng) do passo 2.3.3 para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Adicionar 1 μL de 10 x T4 DNA ligase tampão e 1 μL de T4 DNA ligase. Incubar durante 2 h a 22 ° C. Use as amostras imediatamente ou livreE armazená-los a -20 ° C. </li><li> Digite as peças padrão BioBrick com XbaI e SpeI: adicione 34 μL de água ultra pura, 10 μL de plasmídeo (2 μg), 5 μL de tampão 10x, 0,5 μL de XbaI e 0,5 μL de SpeI no tubo de microcentrífuga. Incubar durante 2 h num banho de água a 37 ° C. </li><li> Digerir o vetor padrão C-Brick com XbaI e SpeI: adicionar 34 μL de água ultra pura, 10 μL de plasmídeo (1 μg), 5 μL de tampão 10x, 0,5 μL de XbaI e 0,5 μL de SpeI no tubo de microcentrífuga . Incubar durante 2 h num banho de água a 37 ° C. </li><li> Execute uma eletroforese em gel de agarose a 1% e purifique o fragmento do passo 2.3.4 e o vetor linearizado a partir do passo 2.3.5 com um kit de sistema de limpeza de gel; Seguindo o protocolo do fabricante. </li><li> Ligar o fragmento e o vetor C-Brick: adicionar 2 μL de vetor linearizado (50 ng) do passo 2.3.5 e 6 μL de fragmento (200 ng) do passo 2.3.4 para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. de AnúnciosD 1 μL de 10x T4 ADN ligase tampão e 1 μL de T4 DNA ligase. Incubar durante 2 h a 22 ° C. Use as amostras imediatamente ou congelar e guarde-as a -20 ° C. </li></ol></li><li> Adicione 10 μL dos produtos do passo 2.1.8, 2.2.9, 2.3.3 ou 2.3.7 para a transformação química nas células competentes de E. coli (DH10B). </li><li> Levar vários clones para um tubo Luria-Bertani (LB) líquido de 5 mL e incubar a 37 ° C num agitador (220 rpm) durante a noite. </li><li> Extrair o plasmídeo usando um kit de preparação de plasmídeo; Siga o protocolo do fabricante. </li><li> Identifique os clones corretos pelo seqüenciamento do Sanger 11 . </li></ol> 3. Conjunto C-Brick ( Figura 2 ) <ol><li> Digestão do vetor C-Brick com Cpf1 <ol><li> Adicionar 22,5 μL de água sem RNase, 4 μL de 10x tampão Cpf1, 10 μL do plasmídeo do passo 2.6 (1 μg), 0,5 μL de RRI e 1 &amp;# 181; L de Cpf1 (5 μM) para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. NOTA: Cpf1 pode ser comprado comercialmente ou purificado após o protocolo em um estudo anterior 4 . </li><li> Para inserir um fragmento de ADN estranho nos locais T1 e T2, adicionar 1 μL de crRNA-T2 (10 μM) e incubar em banho-maria a 37 ° C durante 30 min. Um dd 1 μL de crRNA-T1 (10 μM) e Cpf1 (5 μM) por mais 30 min. NOTA: Alternativamente, para inserir um fragmento de DNA estranho nos locais T3 e T4, adicionar 1 μL de crRNA-T3 (10 μM) e incubar em banho-maria a 37 ° C durante 30 min. Adicione 1 μL de crRNA-T4 (10 μM) por mais 30 min. </li><li> Adicione 1 μL de fosfatase alcalina termossensível e incuba o tubo em um banho de água a 37 ° C durante mais 1 h. </li><li> Execute uma eletroforese em gel de agarose e purifique o vetor usando um kit de sistema de limpeza de gel. Use as amostras imediatamente ou congelar e guarde-as a -20 ° C. </li></ol></Li&gt; <li> Digestão do fragmento de DNA com Cpf1 <ol><li> Adicionar 21,5 μL de água sem RNase, 4 μL de 10x tampão Cpf1, 10 μL de plasmídeo a partir do passo 2.6 (2 μg), 0,5 μL de RRI e 2 μL de Cpf1 (5 μM) a um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. </li><li> Para inserir um fragmento de DNA estranho nos locais T1 e T2, adicione 1 μL de crRNA-T1 (10 μM) e 1 μL de crRNA-T3 (10 μM) e incube em banho-maria a 37 ° C durante 2 h. NOTA: Alternativamente, adicione 1 μL de crRNA-T2 (10 μM) e 1 μL de crRNA-T4 (10 μM) e incube em banho-maria a 37 ° C durante 2 h. </li><li> Execute uma eletroforese em gel de agarose e purifique o fragmento usando um kit de sistema de limpeza de gel. Use as amostras imediatamente ou congelar e guarde-as a -20 ° C. </li></ol></li><li> Assembléia de C-Brick e verificação adicional <ol><li> Ligar o fragmento de ADN estranho e o vetor C-Brick: adicionar 2 μL do vetor linearizado (50 ng) do passo 3.1.4 e 6 μL do fragmento de ADN (200 ng) do passo 3.2.3 para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Adicionar 1 μL de 10x T4 ADN ligase tampão e 1 μL de T4 DNA ligase. Incubar durante 2 h a 22 ° C. Use as amostras imediatamente ou congelar e guarde-as a -20 ° C. </li><li> Adicionar 10 μL dos produtos de ligação (passo 3.3.1) para a transformação química em células compatíveis com E. coli (DH10B). </li><li> Adicione vários clones a um tubo LB líquido de 5 mL e incube durante a noite em um agitador a 220 rpm e 37 ° C. </li><li> Extrair o plasmídeo usando um kit de preparação de plasmídeo; Siga o protocolo do fabricante. </li><li> Identificar clones corretos pelo seqüenciamento do Sanger 11 . </li></ol></li><li> Execute uma nova rodada de montagem C-Brick. Os clones corretos do passo 3.3.4 podem ser usados ​​como um novo vetor C-Brick ou parte de DNA para uma montagem iterativa adicional de C-Brick, seguindo o mesmo protocolo das etapas 3.1-3.3. NOTA: T2 &#39;e T3&#39; sSão projetados como o backup de sites T2 e T3 ( Figura 1a ). Para os plasmídeos obtidos a partir do passo 2.3.7, apenas T2 e T3 podem ser utilizados para a montagem padrão do C-Brick. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este protocolo descreve um procedimento para o padrão de montagem de DNA C-Brick. O passo mais importante neste protocolo é a linearização do vetor padrão C-Brick; A clivagem incompleta do vetor pode afetar seriamente a taxa de sucesso. Além disso, embora o Cpf1 cliva principalmente as sequências de DNA alvo no padrão de clivagem &quot;18-23&quot;, também foi detectada uma clivagem incorreta perto das duas bases 4 , o que pode causar um pequeno número de mutações após a montagem do DNA. Portanto,...

A padronização de partes biológicas do DNA é importante para o desenvolvimento da biologia sintética 1 . O desenvolvimento de um procedimento de montagem de DNA pode substituir projetos experimentais ad hoc e remover muitos dos resultados inesperados que ocorrem durante a montagem de componentes genéticos em sistemas maiores. O padrão BioBrick (BBF RFC 10) foi um dos primeiros padrões de montagem de DNA propostos. Ele usa a seqüência de prefixo (contendo sites de corte EcoRI e XbaI) e a seqüência de sufixos (contendo sites de corte SpeI e PstI) 2 , 3 . Como XbaI e SpeI têm extremidades coesivas complementares, as partes de DNA BioBrick que são cortadas com XbaI e SpeI podem ser unidas, gerando um novo BioBrick para uma montagem iterativa adicional. Alguns defeitos foram identificados com o uso do padrão BioBrick 4 . Por exemplo, produz uma cicatriz de 8 pbEntre as partes de DNA, o que não permite a construção de proteínas in-fusion. Além disso, os quatro tipos acima mencionados de sites de restrição de 6 pb devem ser removidos das partes de DNA, o que é muito inconveniente. O padrão BglBrick foi estabelecido para resolver o primeiro problema 5 . Ele cria uma cicatriz &quot;GGATCT&quot; de 6 pb, produzindo Gly-Ser e permitindo a fusão de múltiplas proteínas ou domínios protéicos. IBrick foi desenvolvido para lidar com o segundo problema 6 . Ele usa endonucleases homing (HEs) que reconhecem longas seqüências de DNA. Como os sites de reconhecimento HE raramente existem em seqüências de DNA naturais, o padrão iBrick pode ser usado para a construção direta de peças iBrick sem modificar suas seqüências de DNA. No entanto, o padrão iBrick deixa uma cicatriz de 21 pb entre as partes do DNA, o que pode ser o motivo da sua impopularidade. Nos últimos anos, as repetições palindrômicas curtas regularmente intercaladas agrupadas (CRISPR) foi desenvolvido rapidamente 7 , 8 . Entre as proteínas associadas a CRISPR (Cas), a endonuclease Cas9 de Streptococcus pyogenes é amplamente utilizada. Ele apresenta principalmente interrupções de DNA de cadeia dupla (DSBs) com extremidades sem corte 9 . Em 2015, Zhang e colaboradores caracterizaram o Cpf1 (CRISPR da Prevotella e Francisella 1) pela primeira vez. Ele pertence ao sistema CRISPR-Cas da classe 2 do tipo V e é uma endonuclease 10 CRISRP RNA (crRNA). Ao contrário de Cas9, o Cpf1 apresenta um DSB com uma subida de 5 ou 5 nt 5 &#39;10. Com base nessa característica, Cpf1 foi usado para desenvolver um padrão de montagem de DNA, C-Brick 4 . Em um vetor padrão C-Brick, quatro locais alvo Cpf1 de T1 / T2 prefixados e T3 / T4 sufixos flanqueiam as partes biológicas; Isso é semelhante ao padrão BioBrick. Como a divisão dos sites T2 e T3 pRoduces extremidades adesivas complementares, é possível realizar a montagem iterativa de partes de DNA ao gerar uma cicatriz &quot;GGATCC&quot; entre as partes. Notavelmente, o padrão C-Brick tem duas vantagens principais: reconhecendo longas sequências alvo e deixando cicatrizes curtas. A cicatriz de 6 pb &quot;GGATCC&quot; gerada por C-Brick codifica Gly-Ser, que permite a construção de proteínas de fusão. Além disso, o padrão C-Brick também é parcialmente compatível com os padrões BglBrick e BioBrick.

<table><tbody><tr><td>Oligonucleotídeo comercial</td><td>Sangon Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x Taq PCR Buffer</td><td>Transgen</td><td>#J40928</td><td></td></tr><tr><td>Água destilada ultra pura</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>5x tampão de transcrição de RNA</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0441</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA polimerase</td><td>Thermo Scientific</td><td>#EP0111</td><td></td></tr><tr><td>mistura NTP</td><td>Sangon</td><td>#ND0056</td><td></td></tr><tr><td>RRI (Inibidor de RNase Recombinante)</td><td>Takara</td><td>2313A</td><td></td></tr><tr><td>RNA Clean & Concentrador-5</td><td>Zymo Research</td><td>R1015</td><td></td></tr><tr><td>UV-Vis Espectrômetro</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nano-Drop 2000c</td><td></td></tr><tr><td>2x Phanta Max Buffer</td><td>Vazyme</td><td>PB505</td><td>PCR buffer</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Transgen</td><td>AD101</td><td></td></tr><tr><td>Phanta Max Super-Fidelity DNA Polimerase</td><td>Vazyme</td><td>P505-d1</td><td></td></tr><tr><td>Ezmax para clonagem em uma etapa</td><td>Tolobio</td><td>Kit de montagem sem costura</td> <td>24303-1</td></tr><tr><td>5x Buffer para clonagem em uma etapa Ezmax</td><td>Tolobio</td><td>32006</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>NEB</td><td>#R0136L</td><td></td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>NEB</td><td>#R3136L</td><td></td></tr><tr><td>BglII&nbsp;</td><td>NEB</td><td>#R0144L</td><td></td></tr><tr><td>XbaI</td><td>NEB</td><td>#R0145L</td><td></td></tr><tr><td>SpeI</td><td>NEB</td><td>#R3133L</td><td></td></tr><tr><td>10x Buffer 3</td><td>NEB</td><td>#B7003S</td><td></td></tr><tr><td>10x CutSmart Buffer</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>10x T4 DNA ligase Buffer</td><td>Tolobio</td><td>32002</td><td></td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>Tolobio</td><td>32206</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>Tolobio</td><td>32210</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>NEB</td><td>#R01762</td><td></td></tr><tr><td>SV Sistema de limpeza de gel e PCR</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid Mini Kit I</td><td>Kit de</td><td>preparação de plasmídeo</td>Omega <td>D6943-02</td></tr><tr><td>fosfatase alcalina termossensível&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>#EF0651</td><td>FastAP</td></tr><tr><td>10x Cpf1 buffer</td><td>Tolobio</td><td>32008</td><td></td></tr><tr><td>Cpf1</td><td>Tolobio</td><td>32105</td><td>FnCpf1</td></tr><tr><td>termociclador</td><td>Applied Biosystems</td><td>veriti 96 poços</td><td></td></tr><tr><td>C-Brick vetor padrão</td><td>Tolobio</td><td>98101</td><td></td></tr><tr><td>E. coli [DH10B]</td><td>Invitrogen</td><td>18297010</td><td></td></tr><tr><td>Meio Luria-Bertani (triptona)</td><td>Oxóide</td><td>LP0042</td><td></td></tr><tr><td>Meio Luria-Bertani (extrato de levedura)</td><td>Oxóide</td><td>LP0021</td><td></td></tr><tr><td>Meio Luria-Bertani (NaCl)</td><td>Sangon Biotech</td><td>B126BA0007</td><td></td></tr></tbody></table>

protocolos para montagem padrão de dna c-brick usando cpf1

Protocols for C-Brick DNA Standard Assembly Using Cpf1

A proteína Cpf1 associada ao CRISPR cliva o DNA de cadeia dupla sob a orientação do ARN CRISPR (crRNA), gerando extremidades pegajosas. Por causa desta característica, o Cpf1 tem sido usado para o estabelecimento de um padrão de montagem de DNA chamado C-Brick, que tem a vantagem de longos sites de reconhecimento e cicatrizes curtas. Em um vetor C-Brick padrão, existem quatro sites de reconhecimento Cpf1 - o prefixo (sites T1 e T2) e o sufixo (sites T3 e T4) - partes biológicas de DNA flanqueando. A clivagem dos locais T2 e T3 produz extremidades adesivas complementares, que permitem a montagem de partes de DNA com sites T2 e T3. Enquanto isso, uma pequena cicatriz &quot;GGATCC&quot; é gerada entre partes após a montagem. À medida que o plasmídeo recém-formado contém novamente os quatro locais de clivagem Cpf1, o método permite a montagem iterativa de partes de DNA, que é semelhante à dos padrões BioBrick e BglBrick. Um procedimento descrevendo o uso do padrão C-Brick para montar peças de DNAÉ descrito aqui. O padrão C-Brick pode ser amplamente utilizado por cientistas, estudantes de graduação e graduação e até amadores.

<html> Este protocolo demonstrou a montagem de três cassetes de cromoproteína (cjBlue (BBa_K592011), eforRed (BBa_K592012) e amilGFP (BBa_K592010)). Primeiro, as sequências de codificação dos três genes e terminadores acima mencionados foram clonados individualmente em um vetor padrão C-Brick. Pequenas partes de DNA, promotor e terminador, foram introduzidas no vetor C-Brick através de amplificação por PCR usando primers contendo as partes de DNA curtas no terminal 5 &#39;. Seguiu-se o mé...

A proteína Cpf1 associada ao CRISPR pode ser guiada por um ARN CRISPR especialmente concebido (crRAR) para escindir o DNA de cadeia dupla nos locais desejados, gerando extremidades pegajosas. Com base nessa característica, foi estabelecido um padrão de montagem de DNA (C-Brick), e um protocolo que detalha seu uso é descrito aqui.

Protocolos para Montagem Padrão de DNA C-Brick Usando Cpf1

CRISPR-associated protein Cpf1 cleaves double-stranded DNA under the guidance of CRISPR RNA (crRNA), generating sticky ends. Because of this ...

Os vídeos a seguir detalham um procedimento para usar o padrão C-Brick para montar peças de DNA usando a proteína associada a CRISPR, Cpf1. Este método pode promover o desenvolvimento da montagem de DNA no campo da biologia sintética. Por exemplo, facilitando a construção de circuitos genéticos complicados.A principal vantagem deste método é que ele é independente da sequência e permite a montagem iterativa de construções de DNA. Tivemos a ideia para este método pela primeira vez quando notamos que o Cpf1 era guiado por um único siRNA e DNA catalítico sendo empilhados. Portanto, gerando DKNs.Demonstrando o procedimento estará Shi-Yuan Li, um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Para reparar os modelos de crRNA, ressuspenda os oligonucleotídeos individuais em água livre de RNase até uma concentração de 10 micromolares. Para um tubo de PCR de 0,2 mililitro, adicione oligonucleotídeo de fita superior, oligonucleotídeo de fita inferior e tampão de recozimento 10x, conforme detalhado no documento anexo.Certifique-se de que o volume total seja de 50 microlitros. Esta tabela mostra seis oligonucleotídeos de fita inferior diferentes, cada um dos quais deve ser emparelhado individ

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A síntese de plasmídeos personalizados é trabalhosa e demorada. Este protocolo descreve o uso da clonagem de montagem Gibson para reduzir o trabalho e a duração do procedimento de clonagem de DNA personalizado. O protocolo descrito também produz construções de proteínas marcadas confiáveis para a expressão de mamíferos a um custo semelhante à clonagem tradicional de DNA de cortar e colar.

Geração de plasmídeo vectores que expressam proteínas marcadas-bandeira nos termos do regulamento de Alongamento Human Fator-1α Promotor Usando Assembleia Gibson

Aqui, apresentamos a montagem de quimera por recuperação de plasmídeo e inserção de site de enzima de restrição (CAPRRESI), um protocolo baseado na inserção de sites de enzimas de restrição em seqüências de DNA sinônimo e recuperação de plasmídeo funcional. Este protocolo é um método rápido e de baixo custo para a fusão de genes que codificam proteínas.

CAPRRESI: montagem de quimera por recuperação de plasmídeos e restrição de inserção do site enzimático

A identificação das interações físicas entre genes e dos elementos reguladores é um desafio, mas tem sido facilitada pelos métodos de captura de conformação de cromossomo. Esta modificação no protocolo de 4C-seq atenua o viés PCR, minimizando a amplificação excessiva de modelos PCR e maximiza o mappability de leituras, incorporando um passo de digerir adição da enzima de restrição.

Identificação do elevado-throughput de sequências de genes regulatórios utilizando a próxima geração sequenciamento de conformação Circular cromossoma capturar (4C-seq)

Descrevemos o protocolo detalhado para projeto, simulação, molhado-laboratório experimentos e análise para um rack de acordeão de DNA reconfigurável de malhas de 6 por 6.

Design e síntese de um Rack de acordeão de DNA reconfigurável

Aqui, apresentamos a sequência montagem gRNA clonagem (STAgR), um método facilmente multiplexar gRNA vetores para CRISPR/Cas9 aproxima-se. STAgR faz a multiplexação de gRNA simples, eficiente e personalizável.

Um protocolo personalizáveis para String Assembly gRNA clonagem (STAgR)

Este artigo apresenta um protocolo detalhado para ligadura de T4 e purificação de página desnaturação de pequenas moléculas de DNA circulares, recozimento e análise de página nativa de telhas circulares, montagem e imagens de AFM de nanoestruturas de DNA 1D e 2D, bem como agarose gel eletroforese e centrifugação purificação de nanoestruturas de DNA finitas.

Motivos de DNA estável, 1D e 2D nanoestruturas construídas a partir de moléculas de DNA Circular pequeno

Aqui, apresentamos uma adaptação da técnica de captura da conformação cromossômica (3C) em detalhes com ênfase no envolvimento e aprendizagem da graduação.

Obtendo um A com os 3Cs: Captura de Conformação Cromossômica para Graduandos

Este artigo apresenta um protocolo passo a passo demonstrando como a Clonagem Modular (MoClo) pode ser adaptada para a clonagem de operons policistrônicos.

Montagem modular padronizada de operons policistrônicos com clonagem modular (MoClo) usando o kit de ferramentas In-Cloning

Descrevemos um protocolo para um método de clonagem de alto rendimento, a clonagem de vaivém baseada em CRISPR (clonagem CRISPRshuttle), que permite a transferência de fragmentos de DNA de interesse entre vetores sem a necessidade de amplificação por PCR dos fragmentos de DNA.

Clonagem de ônibus espacial baseada em CRISPR: um método de clonagem de alto rendimento

Aprenda a montagem de DNA usando o padrão C-Brick com a proteína Cpf1 para engenharia genética. Este método permite a construção iterativa de circuitos genéticos complexos em biologia sintética.

Protocolos para Montagem Padrão de DNA C-Brick Usando Cpf1

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