Protocolos para Montagem Padrão de DNA C-Brick Usando Cpf1

Os vídeos a seguir detalham um procedimento para usar o padrão C-Brick para montar peças de DNA usando a proteína associada a CRISPR, Cpf1. Este método pode promover o desenvolvimento da montagem de DNA no campo da biologia sintética. Por exemplo, facilitando a construção de circuitos genéticos complicados.

A principal vantagem deste método é que ele é independente da sequência e permite a montagem iterativa de construções de DNA. Tivemos a ideia para este método pela primeira vez quando notamos que o Cpf1 era guiado por um único siRNA e DNA catalítico sendo empilhados. Portanto, gerando DKNs.

Demonstrando o procedimento estará Shi-Yuan Li, um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Para reparar os modelos de crRNA, ressuspenda os oligonucleotídeos individuais em água livre de RNase até uma concentração de 10 micromolares. Para um tubo de PCR de 0,2 mililitro, adicione oligonucleotídeo de fita superior, oligonucleotídeo de fita inferior e tampão de recozimento 10x, conforme detalhado no documento anexo.

Certifique-se de que o volume total seja de 50 microlitros. Esta tabela mostra seis oligonucleotídeos de fita inferior diferentes, cada um dos quais deve ser emparelhado individualmente com a fita superior, T7-F. As letras minúsculas representam a sequência a ser transcrita na sequência guia do crRNA.

Coloque o tubo de PCR em um termociclador. Execute o programa de recozimento com uma desnitração inicial a 95 graus Celsius por cinco minutos e, em seguida, um resfriamento de 95 a 20 graus Celsius com uma diminuição de um grau Celsius por minuto. Após o recozimento, execute imediatamente a transcrição combinando o produto recozido com água livre de RNase, tampão de transcrição T-7, mistura NTP, inibidor de RNase recombinante e T-7 RNase polimerase em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.

Incube a reação em banho-maria a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, use um kit de limpeza e concentração de RNA para purificar o RNA transcrito. Use um espectrofotômetro UV-Vis para quantificar o RNA.

Em seguida, dilua o RNA até uma concentração de 10 micromolares. Se as amostras não forem usadas imediatamente, armazene-as a 80 graus Celsius. A construção de peças de tijolo C pode ser realizada por vários métodos.

Nesta seção do vídeo, três de cromoproteínas, cjBlue, eforRed e amilGFP serão montados usando o método de montagem sem costura. Comece projetando e solicitando os oligonucleotídeos para amplificação por PCR dos de cromoproteínas. Quando os oligonucleotídeos chegarem, ressuspenda-os em água ultrapura até uma concentração de 10 micromolares.

Em seguida, para configurar as reações de PCR, coloque tubos de PCR de 0,2 mililitro no gelo. Adicione água ultrapura, dois tampão XPCR, DNTPs, primers diretos e reversos, modelo de cromoproteína e DNA polimerase de alta fidelidade. Coloque os tubos diretamente no termociclador e execute o programa.

Use as amostras imediatamente ou congele-as e armazene-as a 20 graus Celsius. Após a amplificação, purifique os produtos de PCR usando um kit. Em seguida, para digerir o vetor padrão C-Brick com BamH1, adicione água ultrapura, plasmídeo, tampão 10x e BamH1 ao tubo.

Incube por até duas horas a 37 graus Celsius em banho-maria. Purifique o vetor linearizado usando um kit de limpeza de gel. Após a limpeza, combine o vetor linearizado, o produto de PCR, o tampão de montagem sem costura 5x e a enzima de montagem sem costura de um kit de montagem sem costura em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.

Certifique-se de que o volume total seja de 10 microlitros. Coloque-o em banho-maria a 37 graus Celsius por 30 minutos. Após a incubação, use as amostras imediatamente ou congele-as no gelo e armazene-as a 20 graus Celsius.

A 90 microlitros de e coli DH10B, adicione 10 microlitros da construção. Realize uma transformação química. Em seguida, espalhe as células transformadas em uma placa LB e incube a 37 graus Celsius.

No dia seguinte, selecione vários clones para cultivar em tubos LB líquidos de cinco mililitros e incube-os a 37 graus Celsius em um shaker a 220 rpm durante a noite. Extrair o plasmídeo utilizando um kit de preparação de plasmídeos. Em seguida, identifique os clones corretos pelo sequenciamento de Sanger.

Saiba que a construção de caminhos C-Brick também pode ser realizada pela aplicação de PCI reativa, ou por restrição na digestão imediata do meio T4 DNA ligase para ligação. Em seguida, para digerir o vetor C-Brick com Cpf1, combine água livre de RNase, tampão 10x Cpf1, o plasmídeo, inibidor de RNase recombinante e Cpf1 em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Para inserir um fragmento de DNA estranho nos sítios T1 e T2, adicione um microlitro de crRNA T2 e incube o tubo em banho-maria a 37 graus Celsius por 30 minutos.

Em seguida, mantendo o tubo em banho-maria, adicione um microlitro de crRNA T1, um microlitro de Cpf1 e incube por mais 30 minutos. O crRNA T2 é adicionado primeiro, porque os dois locais de reconhecimento estão mais próximos no DNA do vetor. A ligação de Cpf1 no sítio T1 pode influenciar o acamamento do sítio T2.

Além disso, se o site T2 estivesse substituindo o site T2, o site T2 seria interrompido se o crRNA T1 fosse adicionado primeiro. Adicione um microlitro de fosfatase alcalina termossensível e incube o tubo em banho-maria a 37 graus Celsius por mais uma hora. Realize a eletroforese em gel de agarose e purifique o vetor usando um kit de sistema de limpeza em gel.

Use as amostras imediatamente ou congele-as e armazene-as a 20 graus Celsius. Para digerir o fragmento de DNA de interesse com Cpf1, combine água livre de RNase, tampão 10x Cpf1, plasmídeo, inibidor de RNase recombinante e Cpf1 em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Para inserir um fragmento de DNA estranho nos sítios T1 e T2, adicione um microlitro de crRNA T1 e um microlitro de crRNA T3 ao tubo e incube-o em banho-maria a 37 graus Celsius por duas horas.

Após a incubação, realize a eletroforese em gel de agarose e purifique o fragmento usando um kit de limpeza em gel. Use as amostras imediatamente ou congele-as e armazene-as a 20 graus Celsius. Em seguida, para ligar o fragmento de DNA estranho no vetor C-Brick, combine o vetor linearizado e o fragmento de DNA em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.

Adicione 10x tampão T4 DNA Ligase e T4 DNA Ligase. Em seguida, incube por duas horas a 22 graus Celsius. Use as amostras imediatamente ou congele-as e armazene-as a 20 graus Celsius.

Adicione 10 microlitros dos produtos de ligação às células competentes para e coli DH10B e execute uma transformação química. Em seguida, espalhe a e coli transformada em placas LB e incube-as a 37 graus Celsius. No dia seguinte, adicione vários clones a tubos LB líquidos de 5 mililitros e incube-os durante a noite em um shaker a 220 rpm e 37 graus Celsius.

Extrair o plasmídeo utilizando um kit de preparação de plasmídeos. Em seguida, identifique os clones corretos pelo sequenciamento de Sanger. Execute uma nova rodada de montagem do C-Brick.

Usando a amostra, os chamados clones de crack podem ser usados como um novo vetor C-Brick ou peça de DNA para posterior montagem iterativa do C-Brick. Três de cromoproteínas, cjBlue, eforRed e amilGFP, foram montados conforme descrito neste vídeo. Três cromoproteínas foram expressas em e coli cultivadas em uma placa.

Bactérias de controle negativo, sem cromoproteínas, são mostradas na quarta placa. Posteriormente, dois de expressão de cores foram montados com o padrão C-Brick para criar mais cores. Três cromoproteínas e três cromoproteínas duplas montadas foram expressas em e coli cultivadas em meio LB líquido.

De um a seis, os construtos expressos são eforRed, um, amilGFP, dois, cjBlue, três, amilGFP mais eforRed, quatro, eforRed mais cjBlue, cinco, e amilGFP mais cjBlue, seis. As bactérias coloridas em uma única placa, ou em um único tubo de microcentrífuga, foram cultivadas a partir de um clone verificado de sequência única. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em uma semana, se for executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que todos os materiais devem ser livres de RNase, para preparação de siRNA e depuração de Cpf1. Eu ainda recomendo, essa tática ajudou como uma forma de pesquisadores no campo da biologia sintética construírem uma vitrine genética das vias metabólicas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento de como montar um caminho de DNA usando o padrão C-Brick.