Name: Análise de Microglia e Macropagos derivados de Monócitos do Sistema Nervoso Central por Citometria de Fluxo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Aprenda a analisar subpopulações de macrófagos do sistema nervoso central em camundongos adultos por citometria de fluxo. Este método permite identificar marcadores específicos de microglia e macrófagos derivados de monócitos.

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Este trabalho foi apoiado por bolsas da Agence Nationale pour la Recherche (ANR-12-MALZ-0003-02-P2X7RAD), Association France Alzheimer e Bpifrance. O nosso laboratório também é apoiado pela Inserm, CNRS, Université Pierre et Marie-Curie e o programa &quot;Investissements d&#39;avenir&quot; ANR-10-IAIHU-06 (IHU-A-ICM). Gostaríamos de agradecer a assistência das instalações centrais da cultura CELIS.

Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso Animal no Instituto ICM e pelo Comitê de Ética Francesa Darwin, e estão cobertos pelo protocolo 01407.02. 1. Preparação <ol><li> Prepare o cocktail de digestão em um tubo de 1,5 mL, combinando o seguinte para cada mouse: 1 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS); 123 μL de enzima de digestão (ver tabela de materiais) a 13 wunsch / mL (solução de reserva), concentração final 1,6 wunsch / mL; E 5 μL de DNase I (ver tabela de materiais) a 100 mg / mL (solução de reserva), concentração final 0,5 mg / mL. </li></ol> 2. Perfusão e dissecação <ol><li> Eutanizar os ratos com uma dose letal de pentobarbital (100 μL a 400 mg / mL). </li><li> Coloque o animal na posição supina e molhe o corpo com 70% de etanol. </li><li> Corte a pele ventral com tesoura fina logo abaixo do processo xifóide para expor a cavitação torácicaY. </li><li> Faça uma incisão no diafragma e corte os aspectos laterais da caixa torácica com tesoura fina numa direção caudal a rostral para expor o coração (e evitar o corte de outros órgãos). Identifique o ventrículo esquerdo (LV) eo átrio direito (RA). </li><li> Insira um cateter de borboleta com uma agulha de 25 G dentro do LV. Faça uma incisão na RA com tesoura fina e no início do fluxo sanguíneo, comece a perfusão a uma taxa de fluxo de 10 mL / min através do LV com 20 mL de PBS para remover células e sangue dos vasos; A perfusão bem sucedida é notada pelo branqueamento dos pulmões e pelo fígado à medida que o sangue é deslocado. </li><li> Decapite o animal com uma tesoura média. Dissecar a coluna vertebral com tesoura fina e separá-la do corpo excitando a musculatura da parede abdominal no lado ventral da coluna vertebral e cortando a coluna vertebral na base da cauda. </li><li> Insira uma seringa de 10 mL contendo PBS e uma ponta de pipeta montada de 200 μL no lado lombar deNa coluna vertebral e liberar a medula espinhal no lado cervical. NOTA: A ponta de pipeta de 200 μL é cortada com tesoura em sua extremidade mais larga (aproximadamente 1 cm) e firmemente inserida em uma seringa de 10 mL previamente preenchida com PBS. </li><li> Remova a pele acima do crânio e use fórceps para expor o cérebro. Insira uma lâmina de tesoura na base do crânio e corte o crânio seguindo a sutura sagital. Insira pinças pequenas no corte e levante suavemente o crânio. Dissecte o cérebro da cabeça do mouse e remova o bulbo olfatório e o cerebelo. </li><li> Recolher o cérebro ea medula espinhal em um tubo de 1,5 mL contendo 1.128 mL de PBS com cocktail de digestão (do passo 1.1). </li></ol> 3. Dissociação celular <ol><li> Corte finamente o cérebro e a medula espinhal no tubo de 1,5 mL (passo 2.9) em 1-2 mm 3 com pequenas tesouras ( Figura 1 ). </li><li> Incubar o tubo de 1,5 mL contendo os tecidos triturados durante 30 min em uma incubaA 37 ° C com 5% de CO 2 . NOTA: Prepare o gradiente de densidade nesta etapa. </li><li> Adicione 20 μL de EDTA 0,5 M (solução de reserva), concentração final de 10 mM, no tubo de 1,5 mL para parar a reação enzimática. </li><li> Gentilmente faça uma suspensão de células por pipetagem para cima e para baixo com uma pipeta de 5 mL. </li><li> Passe a suspensão celular através de uma malha de nylon (tamanho de poro de 70 μm) em um tubo de 50 mL usando o êmbolo de uma seringa de 10 mL. </li><li> Lavar a malha de nylon com 20 mL de soro bovino fetal a 5% (FBS) -PBS. </li><li> Centrífuga por 7 min (300 xg) à temperatura ambiente (18 ° C). Descarte o sobrenadante por aspiração e avance para o próximo passo. Seja extremamente cuidadoso ao remover o sobrenadante; Não perturbe o sedimento, que pode ser facilmente aspirado pela pipeta de aspiração. </li></ol> 4. Gradiente de densidade <ol><li> Prepare uma solução-mãe do meio de gradiente de densidade adicionando a quantidade apropriada de PBS 10x ao meio de gradiente de densidade. NOTA: Adicione uma peça de 10X PBS a meio de gradiente de densidade de nove partes. </li><li> Diluir o meio de gradiente de densidade de estoque com 1x PBS para as diferentes porcentagens como descrito na Tabela 1 . </li><li> Ressuspender a pastilha (do passo 3.7) com 4 mL de meio de gradiente de densidade a 30% e transferir para um tubo de 15 mL. </li><li> Coloque uma pipeta Pasteur na parte inferior do tubo de 15 mL e aplique lentamente 4 mL de meio gradiente de densidade a 37%. </li><li> Adicione 4 mL de meio de gradiente de densidade a 70%, como descrito acima. </li><li> Centrifugue o gradiente por 40 min (800 xg) à temperatura ambiente (18 ° C). Certifique-se de que a centrífuga pára com um freio mínimo ou nenhum, de modo que a interfase não seja perturbada. NOTA: O tubo aparecerá estratificado. As células em camadas na interface de gradiente de densidade de 70% a 37% são as células imunes mononucleadas (subpopulações de microglia e macrófagos); Os níveis superiores são detritos celulares e mielina, respectivamente ( Figura 2 ). </li><lI&gt; Usando uma pipeta de transferência, remova suavemente a camada de mielina. </li><li> Coletar 3-4 mL da interfase de gradiente de densidade de 70-37% contendo as células das subpopulações de macrófagos em um tubo limpo de 15 mL. </li><li> Lave as células 3x com PBS, volume total de 15 mL. Certifique-se de que o meio de gradiente de densidade que contém as células é diluído pelo menos três vezes com PBS e centrifugação por 7 minutos (500 xg, 4 ° C) com o freio &quot;ligado&quot;. </li><li> Ressuspender o sedimento celular com 1 mL de PBS para rotulagem celular ou para outros ensaios funcionais. </li></ol> 5. Etiquetado de células para a citometria de fluxo <ol><li> Transfira as células (passo 4.10) para um tubo de citometria de fluxo. </li><li> Adicione 1 μL de reagente de mancha de células mortas fixável a cada amostra celular obtida no passo 4.10. Incube durante 30 min no gelo, protegido da luz. </li><li> Lavar as células uma vez com 2 mL de PBS e centrifugar por 5 min (300 xg, 4 ° C). </li><li> Remova o sobrenadante e ressuspenda o sedimento celular com400 μL de PBS 1% de BSA, 0,1% de azida. </li><li> Adicione 1 μg de anticorpos CD16 / CD32 a 100 μL das células para bloquear os receptores Fc. Incube 10-15 minutos no gelo, protegido da luz. </li><li> Prepare a mistura de anticorpo primário em PBS 1% de BSA, 0,1% de azida ou PBS 1% de BSA, 0,1% de azida, 0,25% de saponina, para permeabilização celular para coloração intracelular. </li><li> Adicione 100 μL de mistura de anticorpos primários (2x) e incube durante 30 min em gelo, protegido da luz. NOTA: Todos os anticorpos devem ser titulados antes de realizar a experiência para garantir ótimos resultados. </li><li> Lavar as células com 2 mL de PBS e centrifugar por 5 minutos (300 xg, 4 ° C). Repita este passo três vezes. </li><li> Adicionar 100 μL de um anticorpo secundário se os anticorpos primários não estiverem diretamente conjugados com um fluoróforo e incubar durante 30 minutos em gelo, protegido da luz. </li><li> Lavar as células com 2 mL de PBS e centrifugar durante 5 min a 300 xg a 4 ° C). Repita este passo três vezes. </li><li> Conserte oCélulas com 100 μL de PFA a 1% durante 15 min a temperatura ambiente, protegidas da luz. NOTA: Atenção: o PFA é tóxico. Use em uma chaminé e use equipamento de proteção pessoal. </li><li> Lavar as células com 2 mL de PBS e centrifugar durante 5 min a 300 xg a 4 ° C. Repita este passo três vezes. </li><li> Ressuspender o sedimento celular com 200 μL de PBS e proceder à aquisição e análise de citometria de fluxo. Siga a estratégia de bloqueio na Figura 3 . </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar

Demonstrou-se que a microglia eo MDM têm diferentes funções e fenótipos no SNC e, portanto, a identificação e análise dessas subpopulações de macrófagos são essenciais para melhor compreender as doenças neurológicas 9 , 18 , 25 . A análise de citometria de fluxo usando dois marcadores (CD11b e CD45) permite a distinção entre cada subpopulação ( Figura 3C ). Esta estratégia foi anteriormente validad...

A microglia são os macrófagos residuais do tecido parenquimatoso do sistema nervoso central (SNC). Eles desempenham dois principais papéis funcionais: defesa imune e manutenção da homeostase do SNC. Em contraste com o MDM, que são renovados continuamente a partir das células estaminais hematopoiéticas na medula óssea, as células microgliais se diferenciam das células progenitoras hematopoiéticas primitivas originadas no saco vitelino (YS) que colonizaram o cérebro durante o desenvolvimento embrionário 1 , 2 , 3 . Em roedores, o fator de transcrição Myb desempenha um papel crucial no desenvolvimento de todos os monócitos e macrófagos derivados da medula óssea, mas para a microglia derivada de YS, esse fator é dispensável e a diferenciação continua dependente do fator de transcrição PU.1 4 . No SNC saudável, a microglia é uma célula dinâmica que provoca constantemente o seu ambiente, a scaLevantamento e levantamento de patógenos invasores ou danos nos tecidos 5 . A detecção de tais sinais inicia um caminho para resolver a lesão. A microglia passa rapidamente de uma morfologia ramificada a uma amebaide, que é seguida de fagocitose e liberação de vários mediadores, como citoquinas pró ou anti-inflamatórias. Assim, dependendo do seu microambiente, a microglia ativada pode adquirir um espectro de estados de iniciação distintos 6 . A microglia afeta profundamente o desenvolvimento e a progressão de muitos distúrbios neurológicos. Nos modelos de roedores da doença de Alzheimer (AD) 7 , esclerose lateral amiotrófica (ALS) 8 , esclerose múltipla (MS) 9 ou doença de Parkinson (PD) 10 , a microglia mostra um duplo papel, induzindo neurotoxicidade prejudicial ou agindo De forma neuroprotetiva, dependente deN a doença específica, o estágio da doença e se a doença foi influenciada pelo compartimento imune sistêmico 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . A maioria das lesões do SNC observadas nas doenças citadas acima contém uma população heterogênea de células mieloides, incluindo não apenas microglia parenquimatosa, mas também macrófagos perivasculares e meníngeos, bem como MDM infiltrante do SNC. Estes tipos de células podem contribuir diferencialmente para os mecanismos fisiopatológicos relacionados à lesão e reparação 7 , 12 , 13 , 14 , 15 . O desafio atual para os investigadores que estão estudando esses modelos de doenças é estabelecer se os monócitos periféricos e os macrófagos se infiltram no SNC e, em caso afirmativo, distriamChateie a microglia residente dessas células. Na verdade, as células microgliais são muito plásticas; Quando são ativados, os marcadores de re-expressões de microglia geralmente são expressos por monócitos e macrófagos periféricos. A questão, portanto, se baseia na identificação de marcadores que podem distinguir a microglia residente dos monócitos e macrófagos infiltrantes. A discriminação dessas populações em fatias cerebrais por aplicações imuno-histológicas é limitada devido à falta de anticorpos específicos. No entanto, a análise de citometria de fluxo é uma técnica eficiente para avaliar a expressão de vários marcadores e para distinguir as populações celulares (por exemplo, linfócitos, macrófagos / MDM CD11b + CD45 alto e microglia CD11b + CD45 med ), bem como subpopulações celulares 16 , 17 , 18 . Este protocolo descreve os procedimentos para isolar oCélulas mononucleares do SNC de ratinho em modelos de doenças neurológicas usando uma dissociação de tecido enzimático otimizado e uma centrifugação com gradiente de densidade; Bem como, um método para diferenciar as populações de microglia e MDM no SNC usando citometria de fluxo. Outra abordagem é eliminar a mielina e purificar as células usando esferas magnéticas conjugadas com anticorpos específicos 19 , 20 , 21 . A remoção de mielina usando esferas magnéticas anti-mielina é mais dispendiosa e afeta a viabilidade e o rendimento de células isoladas 22 . Este passo e a seguinte separação imunomagnética da microglia, limitam estudos adicionais de populações específicas de células imunes 21 , 22 . Esses procedimentos fornecem uma maneira fácil de estudar as subpopulações dos macrófagos no desenvolvimento da doença ePara determinar os efeitos de medicamentos ou modificações de genes em fenótipos de macrófagos e estados de ativação.

<table><tbody><tr><td>Camundongos de 5 meses</td><td>Janvier</td><td>C57BL/6J</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TL Grau de Pesquisa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5401020001</td><td>Enzima de digestão</td></tr><tr><td>Desoxirribonuclease I do pâncreas bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0891-01</td><td>Gradiente de densidade médio</td></tr><tr><td>Tamanho do filtro celular 70 &micro; m Nylon</td><td>Corning</td><td>731751</td><td></td></tr><tr><td>Venofix 25 G</td><td>BRAUN</td><td>4056370</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de pistão 10 mL</td><td>Terumo</td><td>SS+10ES1</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pasteur 230 mm</td><td>Dustcher</td><td>20420</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030 123.328</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de 15 mL</td><td>TPP</td><td>91015</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de 50 mL</td><td>TPP</td><td>91050</td><td></td></tr><tr><td>5 mL de tubo inferior redondo de poliestireno</td><td>BD Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (1x) sem Ca2+/Mg2+</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (10x) sem Ca2+/Mg2+</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14200-067</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4884</td><td></td></tr><tr><td>Solução de albumina de soro bovino 30%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A7284</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído 32% Solução</td><td>Microscopia eletrônica Sciences</td><td>15714-S</td><td>Cuidado - Saponina tóxica</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Azida de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>PerCPCy5.5 Rato anti-rato CD11b (clone M1 / 70)</td> <td>eBioscience</td><td>45-0112</td><td></td></tr><tr><td>Rato IgG2b K Controle de isotipo PerCP-Cyanine5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-4031</td><td></td></tr><tr><td>BV421 Rato anti-rato CD45 (clone 30-F11)</td> <td>BD Biosciences</td><td>563890</td><td></td></tr><tr><td>BV421 Rato IgG2b, &kappa; Controle de isotipo RUO</td><td>BD Biosciences</td><td>562603</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-mouse TMEM119 (clone28 - 3)</td><td>Abcam</td><td>ab209064</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 Burro anti-coelho IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A31573</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD16/CD32 Purificado</td><td>eBioscience</td><td>14-0161</td><td>Mouse Fc Block</td></tr><tr><td>Kits de coloração de células mortas fixáveis</td><td>Invitrogen</td><td>L34969</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo conjugado com APC CCR2 de camundongo</td><td>R& D</td><td>FAB5538A</td><td></td></tr><tr><td>Rat IgG2B APC-conjugado Controle de Isotipo</td><td>R & D</td><td>IC013A</td><td></td></tr><tr><td>Camundongo CX3CR1 Anticorpo conjugado com PE</td><td>R & D</td><td>FAB5825P</td><td></td></tr><tr><td>IgG de cabra anticorpo conjugado com PE</td><td>R& D</td><td>IC108P</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td></td></tr><tr><td>Analisador de células</td><td>BD Biosciences</td><td>BD FACSVERSE</td><td></td></tr><tr><td>Software de análise de dados</td><td>FlowJo LLC</td><td>FlowJo</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura fina</td><td>FST</td><td>14090-11</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps de padrão padrão</td><td>FST</td><td>11000-13</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura Mayo</td><td>FST</td><td>14010-15</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Fórceps</td><td>F.S.T</td><td>11251-20</td><td></td></tr></tbody></table>

análise de microglia e macropagos derivados de monócitos do sistema nervoso central por citometria de fluxo

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Numerosos estudos demonstraram o papel das células imunes, em particular dos macrófagos, nas patologias do sistema nervoso central (SNC). Existem duas populações principais de macrófagos no SNC: (i) a microglia, que são os macrófagos residentes do SNC e são derivadas de progenitores do saco vitelino durante a embriogênese, e (ii) os macrófagos derivados de monócitos (MDM), que podem infiltrar-se O SNC durante a doença e são derivados de progenitores da medula óssea. Os papéis de cada subpopulação de macrófagos diferem dependendo da patologia em estudo. Além disso, não há consenso sobre os marcadores histológicos ou os critérios distintivos utilizados para essas subpopulações de macrófagos. No entanto, a análise dos perfis de expressão dos marcadores CD11b e CD45 por citometria de fluxo nos permite distinguir a microglia (CD11b + CD45 med ) do MDM (CD11b + CD45 alta ). Neste protocolo, mostramos que a centrifugação com gradiente de densidadeE a análise de citometria de fluxo pode ser usada para caracterizar essas subpopulações de macrófagos do SNC e para estudar vários marcadores de interesse expressados ​​por essas células como publicamos recentemente. Assim, esta técnica pode aprofundar a nossa compreensão do papel dos macrófagos em modelos de ratos de doenças neurológicas e também pode ser usada para avaliar os efeitos de drogas nessas células.

Após a centrifugação em gradiente de densidade e coloração de anticorpos, as células foram adquiridas em um citómetro de fluxo e analisadas utilizando uma estratégia de bloqueio morfológico como se segue. Um primeiro portão foi definido no quadro de pontos Forward-Scattered-Area (FSC-A) versus Forward-Scattered-Height (FSC-H) para discriminar células individuais de dupletos ( Figura 3A ). As células únicas foram então fechadas em FSC-A versus</e...

Este protocolo fornece uma análise das subpopulações de macrófagos no sistema nervoso central do mouse adulto por citometria de fluxo e é útil para o estudo de marcadores múltiplos expressos por essas células.

Análise de Microglia e Macropagos derivados de Monócitos do Sistema Nervoso Central por Citometria de Fluxo

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

O objetivo geral deste experimento é avaliar os diversos marcadores expressos por subpopulações de macrófagos dentro do sistema nervoso central ou SNC. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de neuroimunologia, como a identificação de macrófagos duperry enquanto tentamos entender o funcionamento do SNC em estados de tontura, e quais são os fenótipos dos macrófagos no SNC. As principais vantagens desta técnica são o isolamento de um grande número de subpopulações de macrófagos altamente purificadas, bem como a contificação dos marcadores celulares de subpopulações de macrófagos.Inicie utilizando uma tesoura fina para cortar a pele ventral logo abaixo do processo xifoide para expor a cavidade torácica. Faça uma incisão no diafragma e corte as partes laterais da caixa torácica em direção caudal para rostral para expor o coração. Após identificar o ventrículo esquerdo e o átrio direito, insira um cateter tipo borboleta com agulha de 25 gauge no ventrículo esquerdo.Faça uma incisão no átrio direito e comece a perfundir 20 mililitros de PBS através do cateter a uma taxa de dez mililitros por minuto assim que o sangue começar a fluir. Uma perfusão bem-sucedida será indicada pelo embranquecimento dos pulmões e do fígado à medida que o sangue for deslocado. Em seguida, use tesoura fina para dissecar a coluna vertebral.Ressecar a musculatura da parede abdominal no lado ventral da coluna vertebral e cortar a coluna vertebral na base da cauda para remover a coluna à medida que é colhida. Insira uma seringa de dez mililitros de PBS equipada com uma ponteira de pipeta modificada de 200 microlitros no lado lombar da coluna vertebral. Em seguida, lave a medula espinhal pelo lado cervical.Remova a pele acima do crânio e insira uma ponta da tesoura na base do crânio. Corte o crânio seguindo a sutura sagital. Em seguida, insira uma pinça pequena no corte e remova suavemente a parte superior do crânio.Disseque o cérebro da cabeça do camundongo e remova o bulbo olfatório e o cerebelo. Em seguida, coloque o cérebro e a medula espinhal em um tubo de um vírgula cinco mililitro contendo um vírgula um dois oito mililitro de coquetel de digestão. Para dissociar as células, use tesoura pequena para cortar finamente o cérebro e a medula espinhal em pedaços de um a dois milímetros cúbicos e coloque os fragmentos a 37 graus Celsius e cinco por cento de dióxido de carbono durante 30 minutos.No final da incubação, interrompa a digestão com 20 microlitros de EDTA 0,5 molar, seguido por trituração suave com uma pipeta de cinco mililitros. Filtre a suspensão celular resultante através de um filtro de malha de 70 microns em um tubo cônico de 50 mililitros, utilizando o êmbolo de uma seringa de dez mililitros para macerar suavemente quaisquer tecidos remanescentes de cérebro ou medula espinhal. Enxágue o filtro com 20 mililitros de PBS contendo 5% de FBS.E colete as células filtradas por centrifugação. Em seguida, aspire cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet. Para a separação das células por gradiente de densidade, suspendemos o pellet com quatro mililitros de meio de gradiente de densidade a 30 por cento e transferimos as células para um tubo cônico de 15 mililitros.Sobreponha suavemente quatro mililitros de meio de gradiente de densidade a 37 por cento, seguidos por quatro mililitros de meio de gradiente de densidade a 70 por cento sob o meio de gradiente de densidade a 37 por cento. Transfira o tubo para uma centrífuga de bancada para separar as células. As células microgliais e os macrófagos estarão na interface das camadas de gradiente de densidade a 70 e 37 por cento.O tubo parecerá estratificado. Após remover cuidadosamente a camada superior de mielina, transfira três a quatro mililitros da camada de interfase de macrófagos e micróglia para um novo tubo de 15 mililitros. Em seguida, lave as células imunes com três centrifugações em 15 mililitros de PBS, re-suspendendo o pellet em um mililitro de PBS após a lavagem final.Para avaliar a expressão de marcadores de subpopulações de macrófagos, transfira as células para um tubo de análise de citometria de fluxo de cinco mililitros, seguido pela adição de um microlitro de reagente fixável para coloração de células mortas. Após 30 minutos no gelo, protegidos da luz, lave as amostras em dois mililitros de PBS e re-suspenda o pellet em 400 microlitros de tampão fax por tubo de análise experimental. Divida as células no número apropriado de tubos de análise de citometria de fluxo de cinco mililitros.Em seguida, bloqueie a ligação não específica aos receptores FC com um micrograma de coquetel de anticorpos bloqueadores CD16 CD32 por 100 microlitros de células, incubando por 10 a 15 minutos no gelo, protegido da luz. A seguir, marque as células com 100 microlitros dos anticorpos primários apropriados, incubando por 30 minutos no gelo, protegido da luz. Ao final da incubação, lave as células quatro vezes com dois mililitros de PBS.Em seguida, adicione 100 microlitros dos anticorpos secundários apropriados durante 30 minutos no gelo, protegidos da luz, seguido por quatro lavagens em PBS conforme acabou de ser demonstrado. Após a última lavagem, re-suspenda suavemente os pellets em 100 microlitros de paraformaldeído a um por cento durante 15 minutos à temperatura ambiente, protegidos da luz. Em seguida, lave as células quatro vezes em PBS.Re-suspenda os pellets finais em 200 microlitros de PBS fresco e analise as células por citometria de fluxo. A microglia derivada do cérebro e da medula espinhal e os macrófagos derivados de monócitos são identificados com base na expressão de CD11b e CD45. A expressão de CX3CR1 e Tmem119 pelas células microgliais CD11b positivas e CD45 médio permite distinguir ainda mais esta população celular dos macrófagos derivados de monócitos CD11c positivos e CD45 alto, que não expressam nenhum desses marcadores, mas expressam CCR2.Após a separação por gradiente de densidade, de 85 a 95 por cento das células ainda estão viáveis. Na ausência de isolamento por gradiente de densidade, as subpopulações de macrófagos não são identificáveis em um gráfico de dispersão bi-ângulo dianteiro, devido à presença de células não-macrófagas e detritos de mielina. Como o epítopo reconhecido pelo anticorpo anti-Tmem119 é intracelular, é necessária a permeabilização para a marcação desse importante marcador de células microgliais.Observe que a permeabilização induz a retração celular, fazendo com que as subpopulações de macrófagos pareçam menores na análise de dispersão frente versus dispersão lateral. Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em cinco horas, se realizada corretamente. Enquanto eu realizava este procedimento, é importante lembrar de montar o gradiente de densidade com muita cautela.Após este procedimento, outros métodos, como a rt-PCR quantitativa, podem ser realizados para responder perguntas adicionais sobre vias de sinalização de subpopulações de macrófagos. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores da área de neurociência explorarem a ativação de subpopulações de macrófagos em modelos de camundongos de doenças neurológicas. Após assistir a este vídeo, você deverá realizar testes ou seguir esta tradição analisando subpopulações de macrófagos por citometria de fluxo.Não se esqueça de que trabalhar com paraformaldeído pode ser extremamente perigoso, e que precauções, como o uso de capela, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Microglia residem macrófagos que fornecem a primeira linha de defesa e vigilância imune do sistema nervoso central. MicroRNAs são moléculas reguladoras, que desempenham um papel importante em muitos processos fisiológicos, incluindo a activação e diferenciação dos macrófagos. Neste artigo, descrevemos o método para a medição de microRNAs em microglia.

Detecção de MicroRNAs em Microglia por PCR em tempo real no SNC normal e durante Neuroinflammation

Este vídeo demonstra a citometria de fluxo para medir a captação microglial de biopartículas fluorescentes após a entrega intravítrea em um olho de camundongo. A citometria de fluxo detecta células vivas que expressam CD11b e distingue células da microglia fagocítica exibindo fluorescência verde de outras células mieloides, incluindo monócitos que expressam Ly6C e neutrófilos que expressam Ly6G.

Medindo a captação microglial de partículas fluorescentes entregues por via intravítrea usando citometria de fluxo

fagocitose microglial é crítica para a manutenção da homeostase do tecido e da função fagocítica inadequada tem sido implicada na patologia. No entanto, a avaliação da função microglia in vivo é tecnicamente desafiador. Nós desenvolvemos uma técnica simples, mas robusta para monitorar com precisão e quantificar o potencial fagocítica da microglia em um ambiente fisiológico.

Avaliando Retinal microglia fagocítica Função<em&gt; In Vivo</em&gt; Usando um ensaio baseado em citometria de fluxo

Análise quantitativa do conteúdo da célula dentro do nervo ciático murino é difícil devido à escassez do tecido. Este protocolo descreve um método para a digestão do tecido e preparação que fornece células suficientes para análise de citometria de fluxo de populações de células imunes dos nervos de ratos individuais.

Análise de células do sistema imunológico em único nervos ciático e gânglio da raiz Dorsal de um único rato usando citometria de fluxo

Um protocolo para a isolação de micróglia primária do cérebro murino é apresentado. Esta técnica ajuda a promover o entendimento atual de condições neurológicas. Centrifugação de gradiente de densidade e separação magnética são combinados para produzir rendimento suficiente de uma amostra altamente puro. Além disso, descrevem as etapas para a caracterização da micróglia.

Caracterização e isolamento de Mouse Microglia primária por centrifugação gradiente de densidade

Este protocolo fornece um método para digerir olhos inteiros em uma única suspensão celular com o propósito de análise citométrica de fluxo de vários parâmetros, a fim de identificar populações fagocíticas mononucleares específicas, incluindo monócitos, microglia, macrófagos e células dendríticas.

Digestão de olhos inteiros de rato para análise citométrica de fluxo multi-parameter de fagocitos mononucleares

Aqui apresentamos dois protocolos para quantificar o engolfamento microglial de sinapses positivas para vGLUT1 e sinaptossomos brutos marcados com pHRodo Red usando citometria de fluxo.

Quantificação do engolfamento microglial de material sináptico usando citometria de fluxo

Identificar micróglia (MG) e macrófagos infiltrantes periféricos (Mø) na medula espinhal lesada é difícil. Neste protocolo, a citometria de fluxo (FCM) foi usada para identificar MG semelhante a M1, MG semelhante a M2, Mø semelhante a M1 e Mø semelhante a M2, respectivamente. Essa tecnologia também pode ser aplicada a outras doenças do sistema nervoso central para entender o papel da MG e da Mø.

Identificação de micróglia e macrófagos infiltrantes periféricos na medula espinhal lesada usando citometria de fluxo

Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar a função das células imunes após AVC isquêmico usando análise de citometria de fluxo em um modelo de mini-AVC. Este método permite o exame detalhado das interações neuroimunes e pode ser adaptado para estudar outras doenças neurodegenerativas, aprimorando nossa compreensão das respostas imunes na patologia do AVC.

Isolamento e Avaliação por Citometria de Fluxo de Interações Neuroimunes em Modelo Murino Mini-AVC

Este protocolo combina citometria de fluxo e sequenciamento de RNA de célula única para isolar e caracterizar os estados das células microgliais no cerebelo de cérebros de camundongos pós-natais precoces. Ele usa dissociação enzimática, centrifugação de Percoll e imunocoloração para revelar a heterogeneidade da microglia e melhorar a compreensão de seus papéis no desenvolvimento e doença cerebelar.

Citometria de fluxo e análise de célula única para caracterizar a ativação da micróglia no desenvolvimento cerebral de camundongos pós-natais precoces

Aprenda a analisar subpopulações de macrófagos do sistema nervoso central em camundongos adultos por citometria de fluxo. Este método permite identificar marcadores específicos de microglia e macrófagos derivados de monócitos.

Análise de Microglia e Macropagos derivados de Monócitos do Sistema Nervoso Central por Citometria de Fluxo

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