Name: Isolamento de células de gânglio retiniano murino primário (RGCs) por citometria de fluxo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Aprenda a isolar células de gânglio retiniano murinas primárias por citometria de fluxo. Este método padronizado permite obter populações enriquecidas de RGCs para pesquisas em neurociência e doenças degenerativas da retina.

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Os autores agradecem ao Sr. Tim Higgins, Ilustrador Sénior do Departamento de Microbiologia, Imunologia e Bioquímica, para assistência técnica em vídeo; Dr. Matthew W. Wilson para discussões e os membros dos laboratórios Jablonski e Morales-Tirado por seus comentários úteis. Este trabalho foi apoiado pelo Alcon Research Institute Young Investigator Award (VMM-T), a Fundação de Pesquisa da Universidade do Tennessee (VMM-T), o National Eye Institute EY021200 (MMJ), o Gerwin Fellowship (VMM-T); A Gerwin Pre-doctoral Fellowship (ZKG), o Departamento de Defesa Army Medical Research and Materiel Command (VMM-T), e a concessão irrestrita da pesquisa para prevenir a cegueira.

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

FACS é a técnica de escolha para purificar populações celulares. Outros métodos de isolamento incluem imunopanning, esferas magnéticas e depleção de fixação do complemento. A vantagem do FACS sobre essas outras metodologias baseia-se na identificação simultânea de marcadores de superfície celular com diferentes graus de intensidade. A intensidade fluorescente da molécula é proporcional à quantidade de expressão da proteína. Até agora, o isolamento de RGCs baseava-se unicamente na positividade Thy1 (CD90) e na negativida...

Os RGCs são neurônios terminalmente diferenciados e, portanto, células primárias são necessárias para a experimentação. O desenvolvimento de um protocolo para isolamento e enriquecimento de células de gânglios retinianos murinos primários (RGCs) é fundamental para revelar os mecanismos de saúde e degeneração de RGC in vitro . Isto é especialmente importante para estudos que buscam gerar terapias potenciais para promover a função RGC e para minimizar sua morte. A degeneração de RGCs está associada a doenças degenerativas da retina, como glaucoma, retinopatia diabética e envelhecimento normal. Embora os mecanismos celulares específicos subjacentes à perda de RGC não estejam claros, uma série de fatores de risco foram identificados. A falta de oxigenação na cabeça do nervo óptico 1 , 2 , 3 causa a morte RGC 4 e atua como o distúrbio da homeostase entre a ativação de excitatório e iReceptores nibitórios dentro de RGCs individuais 5 , 6 . Uma série de desafios impede o progresso no sentido do uso dessas células para estudos aprofundados. Primeiro, o número de RGCs presentes em uma retina murina é pequeno. Os RGCs representam menos de 1% das células da retina 7 , 8 , 9 . Em segundo lugar, a maioria dos marcadores específicos de RGC são proteínas intracelulares 10 , 11 , 12 . A seleção com base nesses marcadores deixa as células não viáveis, o que impede análises funcionais a jusante. Finalmente, os protocolos atualmente disponíveis são longos e falta padronização 13 , 14 . Os protocolos de isolamento RGC precoce basearam-se em métodos de imunoparingologia. Barres et al. 15 Adaptou o immunop clássicoE acrescentou um segundo passo, que excluiu os monócitos e as células endoteliais da maior parte das células da retina antes da seleção positiva com base na imunopositividade ao antígeno anti-timócito (também conhecido como Thy1), um marcador de superfície celular. Anos mais tarde, Hong et al. Técnicas combinadas de isolamento de grânulos magnéticos com estratégias de triagem celular para isolar RGC com maior pureza 16 . O uso de pérolas magnéticas ainda é usado em muitas aplicações científicas. Juntos, os grânulos magnéticos e os protocolos de citometria de fluxo melhoraram a pureza das células isoladas. No entanto, estes sistemas de purificação ainda não foram padronizados para o isolamento de RGC murinos a partir de retina dissociada. A citometria de fluxo é um poderoso método analítico que mede as características ópticas e fluorescentes das suspensões celulares. As células são analisadas quantitativa e qualitativamente com um alto nível de sensibilidade, fornecendo uma análise multidimensional da população celularAtion. A discriminação celular baseia-se em duas propriedades físicas principais: tamanho da célula ou área de superfície e granularidade ou complexidade interna 17 . Uma análise multidimensional pode ser realizada combinando anticorpos marcados com fluorocromos que possuem comprimentos de onda de excitação semelhantes e diferentes emissões. A citometria de fluxo é rápida, reproduzível e sensível. Os laseras Multitpe permitem análises multidimensionais ainda maiores de células individuais por citometria de fluxo. Assim, é uma metodologia atraente para o estudo de espécimes citológicos. A classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) usa as diferenças fenotípicas multidimensionais identificadas pela citometria de fluxo para classificar células individuais em subpopulações distintas. Na última década, múltiplas proteínas superficiais e intracelulares foram identificadas como biomarcadores potenciais para a seleção de células, incluindo neurônios. Estudos iniciais que procuraram isolar RGCs de ratos usaram Thy1 como um ganglion celL marcador. Infelizmente, Thy1, também conhecido como CD90, tem múltiplas isoformas em outras espécies de roedores 18 , 19 , 20 e é expresso por vários tipos de células da retina 19 , 20 , tornando-se um marcador não específico para RGCs. Outro marcador de superfície, CD48, é encontrado em populações monocíticas na retina, incluindo macrófagos e microglia. Usando estes dois marcadores de superfície, uma assinatura RGC modificada - células Thy1 + e CD48 neg - foi desenvolvida 15 , 16 , 21 , 22 . Infelizmente, esses dois critérios de seleção não são suficientes para selecionar uma população RGC altamente enriquecida. Para resolver esta necessidade não atendida, foi desenvolvido um protocolo de citometria de fluxo 23 com base em critérios de seleção positiva e negativa de várias camadas usiNg conhecidos marcadores de superfície celular para enriquecer e purificar RGCs murinos primários.

<table><tbody><tr><td>Anti-rato CD15 PE</td><td>BioLegend</td><td>125606</td><td>Clone MC-480</td></tr><tr><td>Anti-rato CD48 PE-Cy7</td><td>BioLegend</td><td>103424</td><td>Clone HM48-1</td></tr><tr><td>Anti-rato CD57</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6680-100TST</td><td>Clone VC1.1</td></tr><tr><td>Anti-rato CD90.2 AF700</td><td>BioLegend</td><td>105320</td><td>Clone 30-H12</td></tr><tr><td>Violeta Brilhante 421 Cabra Anti-rato IgG</td><td>BioLegend</td><td>405317</td><td>Clone Poly4053</td></tr><tr><td>Anti-mouse Purificado CD16/32</td><td>BioLegend</td><td>101302</td><td>bloco FcgRII/III, Clone 93</td></tr><tr><td>Zombie Aqua&nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>423102</td><td>Discriminação de células vivas/ células mortas</td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Kit de contas de compensação total de anticorpos AbC</td> de origem americana <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10497</td><td>Multi-espécies Ig</td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21103049</td><td>Adicione soro ao meio antes da cultura.</td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010049</td><td>Microscópio de Dissecção de Solução Salina</td></tr><tr><td></td> Microscópio <td>Estéreo</td><td>Modelo Olympus SZ-PT</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Sorvall</td><td>Thermo Scientific</td><td>ST 16R</td><td>Toda a centrifugação realizada&nbsp; na</td></tr><tr><td>Placa Base RT &ndash; Panela de Dissecção</td><td>Fisher Scientific</td><td>SB15233FIM</td><td>Uma placa de cera também pode ser usada</td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>Aesculap</td><td>5002-7</td><td>4 &frac12; polegadas</td></tr><tr><td>Iris Scissors, Straight</td><td>Aesculap</td><td>1360</td><td>5 &frac12; polegadas</td></tr><tr><td>Falcon 15 mL tubos cônicos</td><td>Fisher Scientific</td><td>352097</td><td>Tubos</td></tr><tr><td>de polipropileno Falcon 50 mL tubos cônicos Fisher</td><td>Scientific</td><td>352098</td><td>Tubos de polipropileno</td></tr><tr><td>BD FACS Tubos</td><td>Fisher Scientific</td><td>352003</td><td>Tubos de polipropileno</td></tr><tr><td>pratos de 40 mm</td><td>MidSci</td><td>TP93040</td><td>Cultura de tecidos tratada</td></tr><tr><td>70 &mu; filtro de nylon m</td><td>MidSci</td><td>70ICS</td><td>estéril</td></tr><tr><td>40 &mu; m filtro de nylon</td><td>MidSci</td><td>40ICS</td><td>estéril</td></tr><tr><td>&nbsp; Seringa BD 10 mL Seringa</td><td>Descartável 301604</td><td>Fisher Scientific sem agulha</td><td></td></tr><tr><td>Pilões</td><td>MidSci</td><td>PEST</td><td>estéril</td></tr><tr><td>Frascos Wheaton</td><td>Fisher Scientific</td><td>986734</td><td>Sem Forro</td></tr><tr><td>Agulha BD 30 G</td><td>Fisher Scientific</td><td>305128</td><td>Câmara</td></tr><tr><td>de Contagem de Vidro Hausser Scientific Bright-Line</td> de 1 polegada <td>Fisher Scientific</td><td>0267151B</td><td>Hemocitômetro</td></tr><tr><td>Gibco Trypan blue 0.4% Solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td>Viability Dye</td></tr><tr><td>Eppendorf tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-402-25</td><td>1.5mL</td></tr><tr><td>EVOS Floid Cell Imaging</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>447113</td><td>Fluorescence Imaging com um objetivo de 20X</td></tr><tr><td>100% Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-452</td><td>Usado para fazer 70% de etanol</td></tr><tr><td>Pipeta Pipet-Lite LTS L-1000XLS+</td><td>Pipeta</td><td>Rainin 17014282</td><td>LTS</td></tr><tr><td>Pipeta Pipet-Lite LTS L-200XLS+</td><td>Pipeta Rainin</td><td>17014391</td><td>LTS</td></tr><tr><td>Pipeta Pipet-Lite LTS L-20XLS+</td><td>Rainin</td><td>17014392</td><td>LTS</td>Pipeta</tr><tr><td>Rack LTS 1000 mL &ndash; GPS-L1000S</td><td>Rainin</td><td>17005088</td><td>Blue Rack Pontas Estéreis</td></tr><tr><td>Rack LTS 250 mL - GPS-L250S</td><td>Rainin</td><td>17005092</td><td>Green Rack Pontas Estéreis</td></tr><tr><td>Rack LTS 20 mL - GPS-L10S</td><td>Rainin</td><td>17005090</td><td>Pontas Estéreis de Rack Vermelho</td></tr><tr><td>FACSAria II Classificador de Células</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td>Pedido personalizado</td></tr><tr><td>LSR II Citômetro</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td>Pedido personalizado</td></tr><tr><td>Abca8a</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00462440_m1</td><td>M&uuml; ller cells</td></tr><tr><td>Aldh1al</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00657317_m1</td><td>M&uuml; células ller</td></tr><tr><td>Aqp4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00802131_m1</td><td>Astrócitos</td></tr><tr><td>Calb2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00801461_m1</td><td>Amacrine, Horizontal</td></tr><tr><td>Cd68</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm03047340_m1</td><td>Retinal Pigment Epithelial Cells</td></tr><tr><td>Gad2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00484623_m1</td><td>Amacrine</td></tr><tr><td>Hprt</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm01545399_m1</td><td>House keeping gene</td></tr><tr><td>Lhx1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm01297482_m1</td><td>Horizontal</td></tr><tr><td>Lim2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00624623_m1</td><td>Horizontal</td></tr><tr><td>Nrl</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00476550_m1</td><td>Fotorreceptores</td></tr><tr><td>Ntrk1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm01219406_m1</td><td>Horizontal</td></tr><tr><td>Pcp4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00500973_m1</td><td>Bipolar, Amacrine</td></tr><tr><td>Pou4f1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm02343791_m1</td><td>Células</td></tr> <tr>Ganglionares da Retina<td>Prdx6</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00725435_s1</td><td>Astrócitos</td></tr><tr><td>Prkca</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00440858_m1</td><td>Bipolar</td></tr><tr><td>Prox1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00435969_m1</td><td>Horizontal</td></tr><tr><td>Pvalb</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00443100_m1</td><td>Amacrine</td></tr><tr><td>Rbpms</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm02343791_m1</td><td>Células Ganglionares da Retina</td></tr><tr><td>Rom1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00436364_g1</td><td>Fotorreceptores</td></tr><tr><td>Rpe65</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00504133_m1</td><td>Células epiteliais do pigmento da retina</td></tr><tr><td>Slc1a3</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00600697_m1</td><td>Astrócitos</td></tr><tr><td>Slc6a9</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00433662_m1</td><td>Amacrine</td></tr><tr><td>Sncg</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00488345_m1</td><td>Retinal Ganglion</td></tr><tr><td>Tubb3</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00727586_s1</td><td>Retinal Ganglion</td></tr><tr><td>Vim</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm01333430_m1</td><td>M&uuml; ller cells</td></tr><tr><td>Taqman Universal Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4440047</td><td>qPCR Reagent</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>Isolamento</td></tr><tr><td>de RNA SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11754250</td><td>cDNA synthesis</td></tr><tr><td>Taqman PreAmp Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4391128</td><td>Etapa de pré-amplificação</td></tr><tr><td>BD Cytofix/ Cytoperm</td><td>BD Biosciences</td><td>554714</td><td>Fixação/ Tampão de Permeabilização</td></tr><tr><td>BD Perm/ Wash</td><td>BD Biosciences</td><td>Solução de</td><td>Permeabilização</td>554723</tr><tr><td>RBPMS</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-86815</td><td>anticorpo intracelular</td></tr><tr><td>SNCG</td><td>Gene Tex</td><td>GTX110483</td><td>anticorpo intracelular</td></tr><tr><td>BRN3A</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>anticorpo intracelular</td> <td>SC-8429</td></tr><tr><td>TUJ1</td><td>BioLegend</td><td>801202</td><td>anticorpo intracelular</td></tr></tbody></table>

isolamento de células de gânglio retiniano murino primário (rgcs) por citometria de fluxo

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

As doenças neurodegenerativas muitas vezes têm um impacto devastador sobre os afetados. A perda de células ganglionares retinianas (RGC) está implicada em uma série de doenças, incluindo retinopatia diabética e glaucoma, além do envelhecimento normal. Apesar da sua importância, os RGCs têm sido extremamente difíceis de estudar até agora devido em parte ao fato de que eles compreendem apenas uma pequena porcentagem da grande variedade de células na retina. Além disso, os métodos de isolamento atuais usam marcadores intracelulares para identificar RGCs, que produzem células não viáveis. Essas técnicas também envolvem longos protocolos de isolamento, portanto, há uma falta de métodos práticos, padronizados e confiáveis ​​para obter e isolar RGCs. Este trabalho descreve um método eficiente, abrangente e confiável para isolar RGC primários de retinae de camundongos usando um protocolo baseado em critérios de seleção positivos e negativos. Os métodos apresentados permitem o estudo futuro de RGCs, com o objetivo de melhor compreender o maiorDeclínio na acuidade visual que resulta da perda de RGCs funcionais em doenças neurodegenerativas.

<html> O estudo aprofundado de RGCs é impedido por muitos fatores, incluindo sua baixa freqüência e a falta de uma metodologia robusta e padronizada para seu isolamento. A Figura 1 mostra a metodologia utilizada para isolamento de retina. As variações no procedimento de enucleação existem com base no tipo de análise, como se a enucleação faz parte da experimentação in vivo 27 . A enucleação neste protocolo é realizada em ratin...

Milhões de pessoas sofrem de doenças degenerativas da retina que resultam em cegueira irreversível. Um elemento comum de muitas dessas doenças é a perda de células ganglionares da retina (RGCs). Este protocolo detalhado descreve o isolamento de RGC murinos primários por seleção positiva e negativa com citometria de fluxo.

Isolamento de células de gânglio retiniano murino primário (RGCs) por citometria de fluxo

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar uma população enriquecida e homogênea de células ganglionares retinianas primárias de camundongos. Este método pode auxiliar na elucidação de questões no campo das células ganglionares retinianas sobre os mecanismos subjacentes à diminuição da acuidade visual em populações idosas e em populações com doenças degenerativas da retina. A principal vantagem desta técnica é que ela oferece um protocolo rápido, visível, reprodutível e padronizado para o isolamento de células ganglionares retinianas primárias de camundongos enriquecidas.Tivemos pela primeira vez a ideia para este método quando Sumana Chintalapudi, que na época era estudante de pós-graduação no meu laboratório e primeira autora deste estudo, apresentou em nosso clube de revista um artigo de 2013 de Krishna Murtheadol, cujo estudo demonstrou claramente que a linhagem celular RGC cinco, originalmente criada como uma linhagem imortalizada de células ganglionares da retina de rato, não era mais de origem ratina, nem possuía o fenótipo de RGC. Tornou-se evidente para nós que esse problema deixava uma grande lacuna nos recursos disponíveis para a comunidade de pesquisa em visão, incluindo o nosso próprio laboratório. Sumana e eu entramos em contato com o Dr. Morales-Tirado e, juntos, os três desenvolvemos um novo método para isolar RGCs vivas e altamente enriquecidas.Em geral, indivíduos novos neste método terão dificuldades porque os objetivos desse método são isolar uma população celular viva e altamente enriquecida que possa ser cultivada como células primárias ou imortalizada como uma linhagem celular. Por isso, é necessário ter muito cuidado para não danificar as células que se deseja isolar. Além disso, os parâmetros do método de separação celular devem ser ajustados conforme as células específicas que se está tentando isolar.Os dois métodos exigem conjuntos de habilidades específicas. As demonstrações dos procedimentos serão realizadas pelo Dr. Xiang Di Wang, pesquisador associado do laboratório da Dra. Jablonski, e por Mr. Zach Goldsmith, doutorando do meu laboratório. Para enuclear o olho, primeiro insira a pinça sob o globo ocular.Segure o nervo óptico e puxe para cima. O globo será enucleado com o nervo óptico intacto. Coloque o olho em um frasco com PBS sobre gelo e enucleie o outro olho.Após coletar todos os olhos, coloque um olho em uma placa de Petri com PBS fresco sob um microscópio de dissecação e use uma pinça para segurar cuidadosamente o globo na base do nervo óptico. Usando uma agulha fina de 30 graus, perfure a córnea para permitir a drenagem do humor aquoso, facilitando o manuseio do olho com a pinça. Segurando a córnea com a pinça, use uma tesoura para fazer uma pequena incisão no tecido da córnea e utilize a pinça para remover suavemente a córnea e a esclera.Quando o globo estiver descascado pela metade, use a pinça para enrolar a retina e a lente. Coloque a retina em um pequeno recipiente de Petri de 40 milímetros contendo PBS e 1% FPS em uma cabine de segurança biológica e lave a retina três vezes em PBS fresco mais soro bovino fetal (FBS) para cada lavagem. Quando todos os olhos tiverem sido lavados, coloque até 12 retinas sobre um filtro de náilon estéril de 70 micrômetros umedecido com PBS e FBS e macere suavemente as retinas com a extremidade traseira do êmbolo de uma seringa de 10 mililitros, usando um movimento circular.Quando todas as células tiverem sido dissociadas, coloque o filtro sobre um tubo de coleta de polipropileno e use uma pipeta P1000 para filtrar as células através do filtro para dentro do tubo de coleta. Lave o filtro com PBS e FBS, reunindo a lavagem no tubo de coleta. Adicione PBS com FBS em quantidade suficiente para ajustar o volume final a um mililitro de solução por retina e recolha as células por centrifugação.Em seguida, re-suspenda o pellet em PBS com FBS na proporção de um mililitro de meio por cinco retina, caso a imunomarcação deva ser realizada imediatamente. Alternativamente, incube as células re-suspensas em meio para células neurais durante a noite a quatro graus Celsius na posição horizontal. Para imunomarcar as células retinianas, centrifugue a suspensão de células retinianas e re-suspenda o pellet em 50 microlitros de PBS fresco com FBS em um tubo de ensaio.Reserve cinco vezes 10 elevado à sexta células para o controle negativo não marcado. Em seguida, bloqueie qualquer ligação inespecífica aos receptores Fc em cada tubo com um microlitro de anticorpo anti-CD16/32 de camundongo por uma vez 10 elevado à sexta células, durante 10 minutos à temperatura ambiente. Ao final da incubação de bloqueio, adicione o coquetel de anticorpos de interesse às células com pipetagem suave, para uma incubação de 30 minutos no gelo, protegida da luz.Em seguida, lave as células duas vezes em um volume final de um litro de PBS e FBS. Incube as células com um anticorpo secundário apropriado por mais 30 minutos no gelo, protegidas da luz, seguido de duas lavagens em PBS com FBS, conforme acabou de ser demonstrado. Re-suspenda os pellets em PBS e FBS fresco para contagem de células.Para ajustar a compensação, adicione três gotas de microesferas de poliestireno a um tubo fax estéril por florafor e um micrograma do respectivo florafor a cada tubo. Incube as microesferas por 15 minutos à temperatura ambiente, protegidas da luz. Em seguida, lave as microesferas com três mililitros de PBS e FBS e remova cuidadosamente o sobrenadante.Resuspenda os pellets de microesferas em 250 microlitros de PBS e soro bovino fetal e carregue o tubo de amostra não marcado no citômetro de fluxo. No software do citômetro de fluxo, selecione o experimento, configure a compensação e crie os controles de compensação. Adicione os controles específicos para flora da lista exibida e clique em OK. Verifique a luz dispersa para frente e a luz dispersa lateralmente e delimite a população inicial.Em seguida, instale o tubo controle negativo no citômetro e clique em carregar. Verifique se a população de interesse ou P1 está exibida e selecione a população. Clique com o botão direito no quadrante P1 e selecione calcular compensação.Em seguida, clique em gravar dados. Quando a gravação for concluída, clique em descarregar para remover o tubo e carregue o próximo tubo controle para ajustar os controles de compensação. Quando todas as amostras controle tiverem sido gravadas, crie um gráfico de dispersão para frente versus dispersão lateral para o primeiro tubo experimental e delimite a população P1.Em seguida, abra um gráfico pseudocolorido de altura de dispersão lateral versus largura de dispersão lateral e selecione as células singulares. Usando as células singulares, crie um gráfico de altura de dispersão frontal versus largura de dispersão frontal e selecione para excluir os dupletos. Em seguida, gere um gráfico pseudocolorido de CD48 versus CD90.2 e selecione as células positivas para CD90.2 e negativas para CD48 para eliminar os monócitos, seguido por um gráfico de CD57 versus CD15 para eliminar quaisquer contaminantes de células amacrinas.Agora defina as populações a serem coletadas para a amostra na planilha de configuração da triagem e separe as células. Ao final da triagem, utilize uma alíquota de 2,5 vezes 10 à quarta células para confirmar a pureza da população celular isolada. Após a trituração das retinas no filtro celular, podem ser visualizadas múltiplas células da retina interna, mesmo que as células ganglionares da retina tenham perdido sua morfologia característica, devido à axotomia durante o procedimento de isolamento celular.O fenótipo clássico de corante um positivo e CD48 negativo na superfície não é suficiente para identificar e isolar as células ganglionares da retina murina, já que essas células expressam genes associados a amácrinas, células de Müller, bipolares, fotorreceptoras horizontais e epiteliais pigmentares da retina. As células classificadas também expressam marcadores intracelulares associados às células ganglionares da retina, como sinucleína gama, BRN3A, TUJ1 e RBPMS, sendo a localização intracelular dos marcadores confirmada adicionalmente por citometria de fluxo com imagem. Algumas das células classificadas começam até mesmo a exibir morfologia de células ganglionares da retina após cultura celular in vitro.Além disso, a análise por PCR quantitativa da população celular altamente enriquecida revela um aumento de várias vezes nos genes que codificam marcadores intracelulares específicos de células ganglionares da retina. Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em menos de seis horas, se realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de manter a suspensão celular estéril, bloquear os receptores FC na suspensão celular, evitar a ligação inespecífica dos anticorpos e discutir com o operador do citômetro os detalhes ou a estratégia de separação celular.Após este procedimento, outros métodos como a PCR quantitativa podem ser realizados para responder perguntas adicionais sobre o perfil de expressão gênica. Não se esqueça de que o manuseio de equipamentos especializados, como um classificador de células, exige um operador altamente especializado. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área da visão compreenderem os mecanismos de sobrevivência e morte nas células ganglionares da retina, contribuindo para o desenvolvimento de terapias inovadoras para a preservação da visão.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar uma população homogênea enriquecida de células ganglionares retinianas primárias de camundongo.

isolation-primary-murine-retinal-ganglion-cells-rgcs-flow

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Este artigo fornece uma descrição de como dissecar e registro da preparação isolada da retina em mouse. Em particular, descrevemos como luz para gravar as respostas de uma população fluorescente etiquetado células ganglionares e, posteriormente, identificar e analisar a sua morfologia.

Uma preparação isolada da retina para gravar Resposta Luz geneticamente identificadas células ganglionares da retina

Este vídeo demonstra o procedimento para isolar células ganglionares primárias da retina (RGCs) murinas usando citometria de fluxo. Este método permite o estudo futuro dos RGCs, com o objetivo de entender melhor o grande declínio na acuidade visual que resulta da perda de RGCs funcionais em doenças neurodegenerativas.

Isolando células ganglionares da retina murina usando classificação de células ativadas por fluorescência

Source: &lt;a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove.com/v/55229/ single-cell-rna-seq-of-defined-subsets-of-retinal-ganglion-cells'&gt;Laboissonniere, et. al. RNA-seq de célula única de subconjuntos definidos de células ganglionares da retina. J. Vis. exp. (2017). Este vídeo demonstra uma técnica de rastreamento fluorescente para identificar subtipos de células ganglionares da retina (RGC) em uma retina de camundongo transgênico. O processo envolve proteger a retina isolada em uma...

Identificação de subtipos de células ganglionares da retina de camundongos por meio de rastreamento fluorescente

fagocitose microglial é crítica para a manutenção da homeostase do tecido e da função fagocítica inadequada tem sido implicada na patologia. No entanto, a avaliação da função microglia in vivo é tecnicamente desafiador. Nós desenvolvemos uma técnica simples, mas robusta para monitorar com precisão e quantificar o potencial fagocítica da microglia em um ambiente fisiológico.

Avaliando Retinal microglia fagocítica Função<em&gt; In Vivo</em&gt; Usando um ensaio baseado em citometria de fluxo

Aqui, apresentamos uma abordagem combinatória para classificar tipos de células neuronais antes do isolamento e para a caracterização subsequente de transcriptomas de célula única. Este protocolo otimiza a preparação de amostras para o bem sucedido RNA Sequencing (RNA-Seq) e descreve uma metodologia projetada especificamente para a compreensão melhorada da diversidade celular.

Single-cell RNA-Seq de subgrupos definidos de células de gânglio retiniano

Este protocolo apresenta duas técnicas para isolar os compartimentos subcelulares de fotorreceptores de haste murina para análise de proteínas. O primeiro método utiliza papel filtro de retina viva e celulose para separar segmentos externos da haste, enquanto o segundo emprega retina liofilizada e fita adesiva para descascar camadas internas e externas do segmento.

Dois métodos de descascamento para o isolamento de compartimentos celulares fotorreceptor na retina do rato para análise de proteínas

Este protocolo descreve um método para o isolamento de células endoteliais da retina pós-natais murinas otimizado para o rendimento, pureza e viabilidade celular. Essas células são adequadas para abordagens de sequenciamento de próxima geração.

Isolamento de células endoteliais da retina murinas para sequenciamento de próxima geração

Este manuscrito descreve um protocolo detalhado para isolar células gliais de Müller da retina de olhos de camundongos. O protocolo começa com a enucleação e dissecção dos olhos de camundongos, seguida de isolamento, semeadura e cultura de células de Müller.

Isolamento de células primárias de Müller glial da retina de camundongo

O epitélio pigmentar da retina (EPR) atua como uma barreira crucial entre a coróide e a retina, promovendo a saúde e a função dos tipos de células da retina, como os fotorreceptores. Aqui, descrevemos um protocolo simples e eficaz para isolar e cultivar EPR murino adulto.

Um método simplificado para isolamento e cultura de células epiteliais pigmentares da retina de camundongos adultos

Este protocolo descreve o procedimento para isolar a retina de camundongo de montagem inteira e realizar imunocoloração para marcar todas as células ganglionares da retina (RGCs). O processo é seguido por imagens e contagem automática de RGCs usando software baseado em IA, fornecendo um método simples, rápido e preciso para quantificar RGCs em toda a retina do camundongo.

Imunocoloração de montagem total e contagem automática de células ganglionares da retina de camundongos

Este artigo apresenta um protocolo detalhado para isolar células primárias de Müller retinianas de ratos Sprague-Dawley (SD) neonatais. O procedimento inclui enucleação dos globos oculares, dissecção do tecido retiniano, extração e identificação de células e considerações importantes para a cultura de células subsequente.

Isolamento e cultura de células Müller primárias da retina de ratos Sprague-Dawley (SD)

Aprenda a isolar células de gânglio retiniano murinas primárias por citometria de fluxo. Este método padronizado permite obter populações enriquecidas de RGCs para pesquisas em neurociência e doenças degenerativas da retina.

Isolamento de células de gânglio retiniano murino primário (RGCs) por citometria de fluxo

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