Isolamento de células de gânglio retiniano murino primário (RGCs) por citometria de fluxo

O objetivo geral deste procedimento é isolar uma população homogênea enriquecida de células ganglionares murinas primárias da retina. Este método pode ajudar a responder a perguntas no campo das células ganglionares da retina sobre os mecanismos subjacentes ao declínio da acuidade visual em populações de idade e em populações de doenças degenerativas da retina. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode oferecer um protocolo rápido, visível, reprodutível e padronizado para o isolamento de células ganglionares retinianas murinas primárias enriquecidas.

Tivemos a ideia para esse método pela primeira vez quando Sumana Chintalapudi, que era então uma estudante de pós-graduação em meu laboratório e primeira autora deste estudo, apresentou em nosso clube de leitura um artigo de 2013 de Krishna Murtheadol, e seu estudo demonstrou claramente que a linha celular RGC cinco, que foi originalmente gerada como uma linha celular ganglionar retiniana de rato imortalizada, não era mais de origem de rato, nem possuía o fenótipo RGC. Tornou-se evidente para nós que esse problema deixava uma grande lacuna nos recursos disponíveis para a comunidade de pesquisa em visão, incluindo nosso próprio laboratório. Sumana e eu entramos em contato com o Dr. Morales-Tirado e juntos nós três desenvolvemos um novo método para isolar RGCs vivos e altamente enriquecidos.

Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque os objetivos deste método são isolar uma população de células vivas e altamente enriquecidas que podem ser cultivadas como células primárias ou imortalizadas como uma linhagem celular. Por causa disso, deve-se ter muito cuidado para não danificar as células que se está tentando isolar. Além disso, os parâmetros do método de classificação de células devem ser adaptados para as células específicas que se está tentando isolar.

Ambos os métodos requerem conjuntos de habilidades especiais. Demonstrando os procedimentos estarão o Dr. Xiang Di Wang, um pesquisador associado do laboratório do Dr. Jablonski, e o Sr. Zach Goldsmith, candidato a PhD do meu laboratório. Para enuclear o olho, primeiro insira uma pinça sob o globo ocular.

Segure o nervo óptico e puxe para cima. O globo ocular será enucleado com o nervo óptico intacto. Coloque o olho em um frasco de PBS no gelo e enuclee o outro olho.

Quando todos os olhos tiverem sido coletados, coloque um olho em uma placa de Petri de PBS fresco sob um microscópio de dissecação e use uma pinça para segurar cuidadosamente o globo na base do nervo óptico. Usando uma agulha afiada de calibre 30, perfure a córnea para permitir que o humor aquoso escorra, tornando mais fácil segurar o olho com a pinça. Segurando a córnea com a pinça, use uma tesoura para fazer uma pequena incisão no tecido da córnea e use a pinça para descascar suavemente a córnea e a esclera.

Quando o globo estiver descascado até a metade, use a pinça para estender a retina e o cristalino. Coloque a retina em uma pequena placa de Petri de 40 milímetros contendo PBS e 1% FPS em um gabinete de biossegurança e lave a retina três vezes em PBS fresco mais FBS para cada lavagem. Quando todos os olhos tiverem sido lavados, coloque até 12 retinas em um filtro de náilon estéril de 70 mícrons umedecido com PBS e FBS e macere suavemente as retinas com a extremidade traseira de um êmbolo de seringa de 10 mililitros, usando um movimento circular.

Quando todas as células estiverem dissociadas, coloque o filtro sobre um tubo de coleta de polipropileno e use uma pipeta P1000 para filtrar as células através do filtro para o tubo de coleta. Enxágue o filtro com PBS e FBS, acumulando a lavagem no tubo de coleta. Adicione PBS e FBS suficientes para aumentar o volume final de até um mililitro de solução por retina e coletar as células por centrifugação.

Em seguida, ressuspenda o pellet em PBS mais FBS a um mililitro de meio por cinco concentrações de retina, se a imunomarcação for realizada imediatamente. Alternativamente, incube as células ressuspensas em meio de células neurais durante a noite a quatro graus Celsius na posição horizontal. Para imunomarcar as células da retina, centrifugue a suspensão de células da retina e ressuspenda o pellet em 50 microlitros de PBS fresco mais FBS em um tubo de fax.

Separe cinco vezes 10 elevado à sexta célula para o controle negativo não marcado. Em seguida, bloqueie qualquer ligação não específica do receptor FC em cada tubo com um microlitro de anticorpo anti-camundongo CD 16 32 por um vezes 10 elevado às sextas células, por 10 minutos em temperatura ambiente. No final da incubação de bloqueio, adicione o coquetel de anticorpos de interesse às células com pipetagem suave por uma incubação de 30 minutos em gelo protegido da luz.

Em seguida, lave as células duas vezes em um volume final de PBS e FBS. Rotule as células com um anticorpo secundário apropriado por mais 30 minutos em gelo protegido da luz, seguido de duas lavagens em PBS mais FBS, conforme demonstrado. Ressuspenda os pellets em PBS e FBS frescos para contar as células.

Para ajustar a compensação, adicionar três gotas de microesferas de poliestireno num tubo de fax estéril por florfor e um micrograma da respectiva florafor a cada tubo. Incube as microesferas por 15 minutos em temperatura ambiente protegidas da luz. Em seguida, lave as microesferas em três mililitros de PBS e FBS e remova cuidadosamente o sobrenadante.

Ressuspenda os grânulos de microesferas em 250 microlitros de PBS e FBS e carregue o tubo de amostra não rotulado no citômetro de fluxo. No software do citômetro de fluxo, selecione experimento, configuração de compensação e crie controles de compensação. Adicione o florapara controles específicos da lista exibida e clique em OK. Verifique a luz dispersa para frente e para o lado e bloqueie a população inicial.

Em seguida, instale o tubo de controle negativo no citômetro e clique em carregar. Verifique se a população de interesse ou P1 é exibida e selecione a população. Clique com o botão direito do mouse na porta P1 e selecione calcular compensação.

Em seguida, clique em registrar dados. Quando a gravação terminar, clique em descarregar para remover o tubo e carregue o próximo tubo de controle para ajustar os controles de compensação. Quando todas as amostras de controle tiverem sido registradas, crie um gráfico de dispersão direta versus lateral para o primeiro tubo experimental e bloqueie a população P1.

Em seguida, abra um gráfico de pseudo cores de altura de dispersão lateral versus largura de dispersão lateral e gate as células individuais. Usando as células únicas, crie um gráfico de altura de dispersão direta versus largura de dispersão direta e gate para excluir os dublets. Em seguida, gere um gráfico de pseudocores CD48 versus CD90.2 e bloqueie as células CD90.2 CD48 negativas positivas para eliminar os monócitos, seguido por um gráfico de pseudocores CD57 versus CD15 para eliminar quaisquer contaminantes de células amácrinas.

Agora defina as populações a serem coletadas para a amostra na planilha de layout de classificação e classifique as células. No final da classificação, use uma alíquota de 2,5 vezes 10 elevado à quarta célula para confirmar a pureza da população de células isoladas. Depois de engrenar as retinas no filtro de células, várias células retinianas internas podem ser visualizadas, mesmo que as células ganglionares da retina tenham perdido sua morfologia característica, devido à axotomia durante o procedimento de isolamento celular.

O fenótipo de superfície CD48 negativo positivo para um corante clássico não é suficiente para identificar e isolar as células ganglionares murinas da retina, pois essas células expressam genes associados a células amácrinas, muller, bipolares, fotorreceptoras horizontais e epiteliais pigmentares da retina. As células classificadas também expressam marcadores intracelulares associados às células ganglionares da retina, como sinucleína gama, BRN3A, TUJ1 e RBPMS, com a localização intracelular dos marcadores confirmada por citometria de fluxo de imagem. Algumas das células classificadas até começam a exibir morfologia de células ganglionares da retina após a cultura de células in vitro.

Além disso, a análise quantitativa de PCR da população de células classificadas altamente enriquecida revela um aumento de muitas vezes nos genes que codificam marcadores intracelulares específicos do gânglio da retina. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em menos de seis horas se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter sua suspensão celular estéril, bloquear os receptores FC da suspensão celular, evitar a ligação não específica dos anticorpos e discutir os detalhes ou estratégia de classificação de células com o operador do classificador de células.

Após este procedimento, outros métodos como QPCR podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre o perfil de expressão gênica. Não se esqueça de que trabalhar com equipamentos especializados, como um classificador de células, requer um operador altamente especializado. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da visão ajudarem a entender os mecanismos de sobrevivência e morte nas células ganglionares da retina, para o desenvolvimento de novas terapias para a preservação da visão.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar uma população homogênea enriquecida de células ganglionares murinas primárias da retina.