Quantificando a densidade de ramificação em glândulas mamárias de ratos montadas inteiras usando o método de análise Sholl

O objetivo geral deste método assistido por computador é quantificar de forma objetiva a densidade de ramificação e o decréscimo da ramificação da glândula mamária, dois indicadores importantes do desenvolvimento em roedores, aplicando uma análise de Sholl modificada a imagens de preparações inteiras de glândulas mamárias. Este método pode ajudar a responder perguntas na área da biologia da glândula mamária, como, por exemplo, de que forma exposições a substâncias químicas podem alterar o desenvolvimento da glândula mamária. A principal vantagem desta técnica é que utiliza um software de código aberto para quantificar de maneira objetiva características fundamentais do desenvolvimento da glândula mamária.

Para este procedimento, tenha imagens de preparações inteiras mostrando o epitélio glandular em uma ampliação fixa. Para começar, abra uma imagem no ImageJ. Em seguida, selecione a ferramenta de laço.

Contorne o epitélio glandular e limpe a área ao redor. Em seguida, contorne o linfonodo e remova esta parte da imagem com o comando de recortar. Se o fundo da imagem for preto, ele deverá ser convertido para branco.

Clique em Editar, depois em Opções e, em seguida, em Cores. Na caixa de diálogo, selecione branco no menu suspenso das opções de plano de fundo. Embora o plano de fundo possa permanecer preto, ele será tratado como branco durante o processamento da imagem.

Agora, separe os canais de cor em três imagens em escala de cinza de oito bits. Em seguida, selecione o canal com o melhor contraste, que normalmente é o canal azul. Agora, subtraia o fundo do canal de cor selecionado.

Em seguida, prossiga com a escolha dos parâmetros desejados e a visualização das alterações. Marque a opção de fundo claro e visualize na caixa de diálogo, então ajuste o número de pixels até obter o contraste desejado. Se for necessário contraste adicional, utilize a opção Máscara de Nitidez.

Verifique a visualização na caixa de diálogo e ajuste o raio em pixels e o peso da máscara até obter o contraste desejado. Após aplicar o filtro de realce de nitidez, remova a borda criada pelo filtro. Clique no botão com a seta dupla vermelha na barra de ferramentas e selecione Ferramentas de Desenho.

Em seguida, escolha a ferramenta Borracha. Ajuste o seu diâmetro clicando com o botão direito do mouse no ícone da ferramenta de borracha e, em seguida, mantenha pressionado o botão esquerdo do mouse para apagar a borda. Apenas um nível de Desfazer é permitido durante a utilização da borracha, portanto, tenha cuidado.

Após aplicar um dos filtros, remova o ruído restante manualmente. Consulte uma cópia da imagem original e remova o ruído identificado clicando primeiro no botão com a seta dupla vermelha na barra de ferramentas e selecionando as ferramentas de desenho. Em seguida, escolha a ferramenta de borracha.

Ajuste o diâmetro clicando com o botão direito do mouse no botão da ferramenta de borracha. Em seguida, mantenha pressionado o botão esquerdo do mouse para apagar o ruído. Apenas um nível de desfazer é permitido durante a eliminação, portanto, tenha cuidado.

Em seguida, ajuste o limiar da imagem. Mova as barras para ajustar os valores mínimos e máximos do limiar a fim de melhorar a imagem da glândula. Depois, clique em Aplicar.

Remova o ruído adicional automaticamente usando um dos dois métodos. A primeira opção é usar o comando de remoção de manchas. A segunda opção é usar o comando de remoção de valores discrepantes.

Esse processo substitui um pixel pela mediana de seus arredores imediatos apenas se o pixel se desviar da mediana por um valor acima de um limiar definido pelo usuário. Agora, usando a imagem original para comparação, reconstrua as porções do epitélio glandular que foram removidas por limiarização e remoção de ruído. Ao reconstruir a imagem, certifique-se de fazê-lo com cuidado e de forma mínima para manter a integridade da imagem.

Selecione a ferramenta de lata de spray nas ferramentas de desenho. Clique com o botão direito do mouse no ícone da ferramenta de lata de spray para ajustar o tamanho da ferramenta, depois preencha cuidadosamente as seções ausentes da glândula usando o botão esquerdo do mouse. Em seguida, crie uma imagem esqueletizada da glândula para a análise de Sholl.

Primeiro, coloque a imagem em um formato binário. Em seguida, esqueleteze a imagem. Esse processo remove repetidamente pixels das bordas da imagem binária até que ela seja reduzida a uma forma com largura de um único pixel.

Agora, dilate a imagem uma vez para fechar as lacunas criadas pelo limiar e pela esqueletização. Em seguida, salve a imagem como um novo arquivo utilizando o comando salvar como. Por fim, verifique a precisão da imagem esquelética em relação à original sobrepondo as duas imagens.

Na caixa de diálogo adicionar imagem, selecione a imagem do esqueleto e defina sua opacidade em 30%. Em seguida, salve a sobreposição como uma nova imagem para referência futura. Para começar, abra uma imagem do esqueleto e converta a imagem em um formato binário. Agora, defina a escala da imagem.

Insira o número de pixels por milímetro, depois defina tanto a distância conhecida quanto a proporção de aspecto do pixel como um, em seguida insira milímetros para a unidade de comprimento e altere a opção global para aplicar a escala a todas as imagens. Em seguida, determine o raio final para a análise de Sholl utilizando a ferramenta de desenho de linha. Desenhe uma linha desde o início do ducto primário até o ponto mais distal do epitélio glandular.

Em seguida, pressione a tecla M e a distância da linha será informada. Agora, insira as configurações para a análise de Sholl. Primeiro, selecione as opções na seção definição das camadas, defina o raio inicial como 0,00 milímetros e o tamanho do passo do raio como 0,1 milímetros.

Defina o número de amostras como um. O comprimento da linha recém-desenhada é inserido automaticamente no campo de raio final. Para as opções de múltiplas amostras por raio, escolha média para a integração.

Para os descritores e opções de ajuste curvo, defina o limite do raio envolvente como um. Escolha inferir a partir do raio inicial para o número de ramificações primárias e selecione as opções de grau de ajuste linear e melhor ajuste. Em seguida, em perfis sem normalização, selecione o mais informativo.

Agora, na seção de métodos Sholl, escolha área para o perfil normalizado. Por fim, na seção de saída, selecione criar máscara de interseções para gerar um mapa de calor das interseções. Agora, abra uma janela de visualização da imagem com os anéis e confirme a área de análise.

Se tudo parecer correto, clique em OK para executar a análise. Executar a análise criará uma janela linear de perfil de Sholl, uma janela de perfil de Sholl em escala semi-log, uma janela de resultados de Sholl, que contém todos os valores de saída de Sholl, e uma janela de nomes de arquivos de perfis de Sholl, que fornece o número de interseções em cada raio conforme determinado pelo polinômio. Para medir a MEA, trabalhe com a imagem esquelética da glândula no ImageJ.

Abra a ferramenta de polígono e desenhe um polígono ao redor do perímetro da glândula. Use cliques do mouse para adicionar segmentos de linha. Quando toda a área epitelial tiver sido contornada, clique duas vezes para fechar o polígono.

Em seguida, pressione a tecla M para abrir uma janela de resultados. O valor na coluna de área corresponde à MEA. Se o epitélio glandular se estender além do linfonodo, subtraia a área do linfonodo da MEA ao calcular a densidade de ramificação.

A área do linfonodo pode ser medida da mesma maneira que a AME. Utilizando os métodos descritos, dois grupos de ratos com idade correspondente foram analisados. Os animais do grupo B foram tratados com uma substância química conhecida por causar desenvolvimento precoce da glândula mamária.

O gráfico do número de interseções dos ramos ao longo do raio a partir da glândula ilustra a variação nos resultados. Os resultados da análise de Sholl revelaram uma diferença clara no número médio de interseções entre os grupos. No entanto, os dados de interseção devem ser normalizados pela área da glândula mamária para se tirarem conclusões.

A análise de Sholl e as medições da área epitelial da glândula mamária fornecem dois parâmetros fisiológicos úteis para realizar análises comparativas. É evidente que o tamanho das glândulas foi muito maior no grupo tratado. A análise de Sholl retorna o valor de Sum N, que é utilizado para calcular a densidade de ramificação e o valor de k.

No grupo de tratamento, a maior densidade média de ramificação e o menor valor médio de k, que reflete uma taxa mais baixa de decaimento da ramificação, indicam que os animais tratados tinham glândulas mais bem desenvolvidas do que os animais não tratados. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que a remoção de ruídos é a etapa mais crucial. Remover em excesso ou insuficientemente pode comprometer a integridade da glândula e distorcer os resultados.

Ao utilizar este método, é importante começar com um montículo mamário intacto. Uma imagem esqueletizada precisa não pode ser obtida se houver imperfeições, como rasgos ou dobras. Criar uma imagem esqueletizada precisa exige paciência e prática.

Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em 15 a 20 minutos por glândula analisada, se for feita corretamente.