Automated protocolos para cristalização Macromolecular no laboratório de Biologia Molecular MRC

O objetivo geral deste procedimento é produzir cristais de alta qualidade a partir das condições iniciais de triagem de cristalização. Os cristais podem ser usados para estudar as estruturas de proteínas, DNA, RNA e seus complexos. Algo sobre estruturas macromoleculares tornou-se cada vez mais desafiador.

E fornecer uma ampla variedade de condições iniciais aumenta o rendimento de cristais úteis, reduzindo a necessidade de otimização de amostras e cristais. Os dois sistemas totalmente automatizados, o LMB, facilitam a preparação de até 1.920 experimentos de difusão de vapor em gotículas de nanolitros. Para resumir, presume-se que os usuários já estejam familiarizados com as funções básicas e a manutenção do dispensador de nanolitros, da impressora a jato de tinta e do selador de placas adesivas.

Antes de executar o procedimento, certifique-se de que os robôs do sistema estejam inicializados e que seu software de controle esteja aberto. Ligue o chiller do transportador de resfriamento do tubo, cerca de 30 minutos antes do início do programa principal. Coloque uma placa de teste no suporte SBS motorizado do selador de placas.

Execute o selador de placas e verifique se o filme está aplicado corretamente. Repita este teste mais duas vezes para verificar se o selador de placas está pronto. Em seguida, adicione 20 litros de água deionizada ao recipiente principal do manipulador de líquidos.

Desconecte as inserções de acoplamento do recipiente menor de solução de enxágue de etanol a 20% e conecte as inserções ao recipiente principal. Digite o nome de tela apropriado na tela sensível ao toque da impressora jato de tinta. Em seguida, abra e feche a porta do carrossel para acionar a rotação do carrossel.

Abra a porta quando a primeira pilha se apresentar. Carregue totalmente a primeira pilha com 22 placas de cristalização, cada uma com a coluna uma voltada para fora. Carregue totalmente as próximas duas pilhas da mesma maneira.

Coloque os seis pratos restantes nas posições mais altas da quarta pilha e feche a porta do carrossel. Verifique se o visor do chiller indica 14 graus Celsius. Inverta suave e repetidamente os kits de triagem selecionados por um minuto.

Em seguida, abra o painel frontal do manipulador de líquidos. Abra os tubos e coloque-os no transportador de resfriamento no layout padrão de 96 poços. Ao colocar cada tubo no suporte, coloque sua tampa na bandeja no mesmo layout de 96 poços.

Ao usar o Sistema 1, os cabos de etiqueta são colocados na bandeja no layout de 96 poços para permitir a verificação cruzada de que os tubos estão dispostos corretamente. Verifique as posições dos tubos e, em seguida, certifique-se de que todos os tubos estejam nivelados e assentados no suporte. Em seguida, feche o painel frontal.

Na janela Inicialização do software manipulador de líquidos, selecione Executar manutenção e abra o programa Flushing. Execute o programa para liberar o etanol a 20% do sistema e lavar a parte externa das pontas de distribuição de líquido. Quando a liberação estiver concluída, clique em Cancelar para retornar à inicialização.

Selecione Executar um processo existente e clique em Iniciar sua seleção. Abra o programa de distribuição do Kit MRC. Preencha 18" para Instâncias na tela Configuração e execute o programa, Monitore o sistema à medida que as quatro primeiras placas são rotuladas, preenchidas e seladas.

Não deixe o sistema sem vigilância até que a preparação das quatro primeiras placas esteja concluída. Depois que todas as 72 placas forem preparadas e colocadas de volta no carrossel, troque as inserções de acoplamento do recipiente de água deionizada para o recipiente de 20% de etanol. Execute o programa de liberação de inicialização usando o mesmo processo de antes.

Desligue o chiller e descarte os tubos vazios do kit de peneiramento. Remova cuidadosamente as 72 placas preparadas do carrossel. Descarte pratos cheios incorretamente ou mal selados.

Armazene as placas prontas para uso a 10 graus Celsius. Primeiro, certifique-se de que os robôs do sistema estejam ligados, o dispensador de nanolitros seja inicializado com seu software aberto e o gerenciador de métodos do manipulador de líquidos esteja aberto. Ligue o suporte de resfriamento do microtubo cerca de 15 minutos antes do início do programa principal.

Coloque uma placa de teste no suporte SBS motorizado do selador de placas. Execute o selador de placas e verifique se a placa está devidamente vedada. Teste o selador de placas três vezes.

Em seguida, execute o dispensador de nanolitros para definir 100 gotículas de nanolitro de solução de teste em uma placa de teste. Aqui é mostrada uma micrografia de luz de uma gotícula de 100 nanolitros, produzida pelo dispensador de nanolitros, com a solução de teste feita com corante vermelho. Feche o software dispensador de nanolitros e remova o bloco do suporte de tiras do deck.

Em seguida, coloque em um suporte de placa personalizado, uma placa de cristalização pré-preenchida de 96 poços com a maior quantidade relativa de reagentes voláteis em suas condições. Remova o filme adesivo da placa. Abra o painel frontal do manipulador de líquidos e coloque a placa não lacrada no convés na parte traseira do primeiro suporte deslizante.

Cubra a placa com uma tampa de alumínio SBS. Coloque a tampa em direção ao canto esquerdo traseiro do suporte aplicando uma leve pressão no canto oposto da tampa. Ao usar o Sistema 2, os kits de triagem com quantidades significativas de reagentes voláteis devem ser processados primeiro.

Isso evita a formação de condensação nos cabos SBS, o que pode afetar o manuseio automatizado dos cabos ou a vedação da placa. Sele, carregue nos suportes deslizantes e cubra as 19 placas restantes da mesma maneira, trabalhando das condições mais voláteis para as menos voláteis. Quando o transportador de resfriamento do microtubo estiver a 4 graus Celsius, conforme indicado por uma luz verde, remova sua tampa.

Corte a tampa de um microtubo contendo pelo menos 440 microlitros de uma amostra de proteína. Certifique-se de que a amostra não tenha espuma acima do menisco, pois isso interferirá no sistema de detecção de líquidos. Coloque o tubo na posição 1 do suporte de resfriamento do microtubo.

Coloque uma placa PCR no convés do manipulador de líquidos na frente do transportador do adaptador móvel da placa. Em seguida, feche o painel frontal. Na interface de gerenciamento de métodos do manipulador de líquidos, selecione Placas de configuração.

Monitore a inicialização de ambos os sistemas e preencha os parâmetros de execução, incluindo o tipo de placa e o número de gotas para cada condição, o tamanho da gota, a posição da primeira chapa a ser processada e o número de chapas. Clique em Não quando perguntado se você gostaria de ajuda para carregar o deck. Depois de verificar se não há racks de gorjetas vazios, clique em OK. Depois de verificar se há dicas suficientes para a execução, clique em OK. Quando necessário, atualize o sistema de gerenciamento de gorjetas e clique em OK. Certifique-se de que a plataforma do dispensador de nanolitros esteja livre do bloco porta-tiras e que o transportador esteja na parte de trás das pilhas de pontas de 50 microlitros, esteja livre das tampas SBS de alumínio.

Verifique novamente se todos os outros componentes necessários estão prontos e inicie o processo. Monitore o sistema enquanto o dispensador de nanolitros fixa as gotas na primeira placa e o selador de placas subsequentemente sela a placa. Não deixe o sistema sem vigilância até que a preparação da primeira placa esteja concluída.

Uma vez que todas as 20 placas tenham sido preparadas com gotículas de cristalização e retornem automaticamente aos suportes deslizantes, abra o painel frontal e remova as placas com cuidado. Verifique se as placas estão corretamente vedadas antes de armazená-las para cristalização. Limpe as tampas SBS com a solução de etanol a 20% antes de empilhá-las no lado esquerdo do manipulador de líquidos para armazenamento.

Descarte a placa PCR e o microtubo. Desligue o transportador de resfriamento do microtubo e limpe a condensação. Deixe uma toalha de papel em cima da superfície mais fria para absorver mais condensação.

Em seguida, recoloque a tampa do suporte e feche o painel frontal. OmpF e MreB foram inicialmente selecionados usando esses protocolos totalmente automatizados. Cristais OmpF de qualidade suficiente para difração de raios-X foram encontrados no poço A4 da placa LMB 7.

Cristais de qualidade de difração de MreB foram encontrados no poço D12 da placa LMB 20. Armazenar placas de pré-combustível a 10 graus Celsius é um compromisso para evitar o congelamento e armazenamento a 4 graus, o que pode causar deterioração das condições de cristalização e problemas relacionados à condensação. Quando armazenadas dessa maneira, as placas podem ser usadas dentro de quatro a cinco meses.

Entre 4 e 8.000 placas LMB são produzidas anualmente com o Sistema 1 e posteriormente são usadas para triagem inicial. Os protocolos devem ser otimizados de forma diferente quando o volume de negócios esperado for muito menor. Todo o nosso conjunto de placas de pré-combustível é normalmente usado como uma grande tela inicial para uma nova amostra.

No entanto, menos placas podem ser selecionadas para requisitos de amostra muito específicos. Após a preparação das gotículas, as placas são armazenadas em prateleiras de baixa vibração com a temperatura rigidamente controlada em 4 ou 18 graus Celsius. Os experimentos são avaliados com microscópios de fonte de luz scroll.

Depois de investigar cuidadosamente a natureza dos cristais, características e semelhanças entre as condições podem ser analisadas com ferramentas baseadas na web, como os bancos de dados LMB ou C6 Screen. A otimização subsequente das condições de cristalização ainda pode ser necessária. Protocolos automatizados adicionais, com os métodos de 4 cantos e triagem aditiva são descritos em nosso manuscrito.