Name: Automated protocolos para cristalização Macromolecular no laboratório de Biologia Molecular MRC (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Aprenda a preparar cristais de alta qualidade para estudos estruturais de macromoléculas usando sistemas automatizados de difusão de vapor. Este método permite até 1.920 experimentos com gotículas nanolíticas.

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A facilidade de cristalização de MRC-LMB é gentilmente apoiado pelo Conselho de pesquisa médica (UK). Agradecemos a membros do LMB para seu apoio: Olga Perisic (PNAC), Tony Warne, Fusinita Van den Ent e Pat Edwards (estudos estruturais), Steve Scotcher e os outros membros da oficina mecânica, Neil Grant e Jo Westmoreland (ajudas visuais), Paul Hart e Tom Pratt (TI). Também gostaríamos de agradecer a Steve Elliot (Tecan, UK), Mitchell Stuart e Heather Ringrose (Hamilton robótica, UK), Paul Thaw, Robert Lewis e Joby Jenkins (TTP Labtech, UK), Paul Reardon (Swissci AG, Suíça), George Stephens e Donald Ogg (Alphabiotech, UK), Neil Williams (Markem Imaje, UK) e Graham Harris (The Cleveland Agency) para ajuda técnica.

1. os dois sistemas (triagem inicial) totalmente automatizados
<ol><li>
Sistema 1: preparação de 72 placas de 96 poços cristalização repleta de kits (placas LMB) de rastreio
	<ol>
<li>Antes de realizar o procedimento, certifique-se de que os robôs do sistema são inicializados e seu software de controle é aberto. Ligue o refrigerador do porta-tubo de refrigeração em cerca de 30 minutos antes do programa principal será iniciado.</li>
		<li>Coloque uma placa de teste sobre a transportadora SBS motorizada do aferidor de placa. Execute o aferidor de placa e verifique que a película é aplicada corretamente. Repita este teste mais duas vezes para verificar se o aferidor de prato está pronto.</li>
		<li>Em seguida, adicione 20 L de água deionizada para o recipiente principal do manipulador de líquido. As inserções de acoplamento do recipiente pequeno (etanol 20% de solução de lavagem) e ligue as inserções para o recipiente principal.</li>
		<li>Digite o nome de tela apropriada (tabela 1) no ecrã táctil de impressora a jato de tinta. Em seguida, abra e feche a porta do carrossel para acionar a rotação de carrossel. Quando a primeira pilha apresenta-se, abra a porta.</li>
		<li>Carregar totalmente a primeira pilha com 22 placas de cristalização, cada um com voltado para a coluna 1 para fora. Carrega totalmente as próximas duas pilhas da mesma forma.</li>
		<li>Carrega as restantes 6 placas nos mais altos cargos da quarta pilha. Em seguida, feche a porta do carrossel.</li>
		<li>Verifique se que o display do refrigerador indica 14 ° C. Suavemente e repetidamente inverta os kits de triagem selecionado por 1 minuto. Em seguida, abra o painel frontal do manipulador de líquido.</li>
		<li>Abra os tubos e coloque-os em refrigeração transportadora de acordo com o layout padrão de 96 poços (A1, A2, etc.). Após a colocação de cada tubo no portador, coloque a tampa em uma bandeja no mesmo layout de 96 poços.</li>
		<li>Verificar o tubo posições e garantir que todos os tubos são de nível e se estabeleceram no portador. Em seguida, feche o painel frontal.</li>
		<li>Na janela do software líquido manipulador 'Inicialização', selecione 'Executar manutenção' e abrir o programa de lavagem. Execute o programa para liberar o etanol 20% do sistema e para lavar as paredes laterais das dicas de fornecimento de líquido.</li>
		<li>Quando a descarga estiver concluída, clique em 'Cancelar' para voltar à 'Inicialização'. Selecione 'Executar um processo existente' e clique em 'Iniciar sua seleção'. Abra o programa 'MRC kit distribuição'. Preencha '18' 'Instâncias' na configuração de tela e executar o programa.</li>
		<li>Monitore o sistema como as quatro primeiras placas são rotuladas, preenchidas e seladas.</li>
		<li>Uma vez que todas as 72 placas foram preparadas e colocado de volta no carrossel, mudar as inserções de acoplamento do recipiente principal para o recipiente pequeno. Execute o programa 'Arranque flush' (consulte a etapa 1.1.10).</li>
		<li>Desligar o refrigerador e descartar a esvaziar os tubos kit de triagem. Remova cuidadosamente as 72 placas preparadas no carrossel. Descarte de placas preenchido incorretamente ou mal vedada. Armazenar as placas de ready-to-use a 10 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sistema 2: criação de uma única amostra em 20 placas de LMB de gotículas de cristalização (proteína de nL 100 + 100 condição nL)
	<ol>
<li>Em primeiro lugar, garantir que robôs do sistema estão em, o dispensador de nanolitros é inicializado com seu software aberto, e gerente do método do manipulador líquido está aberto. Ligue a transportadora microtubo e refrigeração cerca de 15 minutos antes do programa principal será iniciado.</li>
		<li>Coloque uma placa de teste sobre a transportadora SBS motorizada do aferidor de placa. Executar o aferidor da placa e verificar que a placa está devidamente selada. Teste o aferidor de placa três vezes.</li>
		<li>Em seguida, execute o dispensador de nanolitros para definir 100-nL gotas da solução de teste em uma placa de teste. Verificar sob um microscópio que as gotas estão definidas corretamente. Feche o software do dispensador de nanolitros e remover o bloco tira-titular do baralho.</li>
		<li>Em seguida, insira no porta-placa personalizados (ver Resultados de representante: cristalização dispositivos desenvolvidos para o LMB) a placa LMB com a maior quantidade relativa dos reagentes voláteis em suas condições (tabela 1). Remova a película adesiva da placa.</li>
		<li>Abrir o painel frontal do manipulador de líquido e coloque a placa sem lacre no deck, na parte de trás o primeiro transportador de deslizamento (portadores de deslizamento pode ser puxada para a facilidade de acesso).</li>
		<li>Cubra o prato com uma tampa de alumínio SBS. Resolver a tampa em direção ao canto esquerdo traseiro da transportadora, aplicando uma pressão suave ao canto oposto da tampa.</li>
		<li>Unseal, carregar para as deslizamento das transportadoras e cobrir as restantes 19 placas da mesma forma, trabalhando a partir mais para condições menos voláteis. Uma vez que a transportadora microtubo de refrigeração a 4 ° C, conforme indicado pela luz verde, remova sua capa.</li>
		<li>Corte a tampa de um microtubo contendo (pelo menos) 440 µ l da amostra de proteína (tabela 2). Certifique-se de que a amostra tem sem espuma acima do menisco, como isso irá interferir com o sistema de detecção de líquido. Coloca o tubo na posição 1 da transportadora microtubo e refrigeração.</li>
		<li>Coloque um prato PCR no convés manipulador de líquido na frente da transportadora adaptador placa-movendo-se. Em seguida, feche o painel frontal.</li>
		<li>Depois de carregar o convés, certifique-se que o baralho de dispensador de nanolitros é claro do bloco tira-titular e que as transportadoras na parte de trás das pilhas de ponta de 50 µ l são claras das tampas de alumínio SBS.</li>
		<li>Na interface de 'Método de gestão' líquido manipulador, selecione 'Setup placas'. Monitorar a inicialização de ambos os sistemas e preencher os parâmetros de execução. Siga as diretrizes de interface de gerenciamento método (prompts, figuras e um sistema de gestão de ponta ajudar com preparação).</li>
		<li>Verifique que todas as componentes estão prontos e em seguida, iniciar o processo.</li>
		<li>Monitore o sistema como o dispensador de nanolitros define as gotas na primeira placa e o aferidor de placa posteriormente selos da placa.</li>
		<li>Uma vez que todas as 20 placas foram preparadas com gotículas de cristalização e retornadas automaticamente para os portadores de deslizamento, abrir o painel frontal e remova cuidadosamente as placas. Verifica que as placas são seladas corretamente antes de guardá-los por cristalização.</li>
		<li>Limpe as tampas SBS com uma solução de etanol a 20% antes de empilhá-los no lado esquerdo do manipulador de líquido para o armazenamento. Descarte a placa PCR e o microtubo.</li>
		<li>Desligue a transportadora microtubo e refrigeração e enxugar a condensação. Deixe uma toalha de papel sobre a superfície do refrigerador de absorver ainda mais condensação. Em seguida, recoloque a tampa do porta-aviões e feche o painel frontal.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. otimização das condições
<ol><li>
Manipulador de líquidos baseados em seringa: produzindo dois gradientes lineares das concentrações em reservatórios de uma placa de cristalização (o método 4-canto).
	<ol>
<li>Em primeiro lugar, garantir que o manipulador de líquido é na e inicializado com seu software aberto.</li>
		<li>Na 'Gradiente' tab: Abra o programa necessário, selecione o tipo de placa de cristalização e o volume final dos reservatórios (tabela 3). A configuração avançada para 'máximo tiro vol' deve ser diminuída de 6.000 para 3.000 quando usando soluções contendo [isopropanol] > 10% v/v e [MPD] > 20% v / v.
</li>
		<li>Prepare as seringas. Colocar um pistão em cada seringa (extremidades pontiagudas para baixo) e parte de trás das seringas nas ranhuras designadas por baixo da cabeça do robô. Uma seringa gire no sentido horário para travar na posição (o programa irá iniciar somente com todas as seringas necessárias anexadas corretamente).</li>
		<li>Prepare os bebedouros. Retire a armação de aço inoxidável e inserir os bebedouros. As 4 posições da esquerda correspondem aos 4 cantos A, B, C, D. interruptor para 'SET UP' guia que exibe os volumes das soluções necessárias em cada seringa (na tabela 3, 0.5 volume morto mL foi adicionado aos volumes exibidos). Despeje as soluções de canto em suas respectivas calhas e coloque o quadro de volta no chão (o quadro mantém em posição com 2 pequenos ímãs, localizados na parte dianteira da plataforma). Uma maneira alternativa para prosseguir com este passo é para as soluções despeje os bebedouros quando eles já são colocados no convés.
</li>
		<li>Coloque a placa de cristalização ao transportador motorizado de SBS.</li>
		<li>Clique em 'Aspirar' e esperar que esta etapa seja concluída (quando pistões pararam a caminho).</li>
		<li>Alterne para a guia 'RUN' e execute o programa.</li>
		<li>Após a conclusão do programa, volte para o guia SET UP e clique em 'Remover': o sistema limpa as seringas de soluções de sobras e então levanta os pistões todo o caminho. 'PURGE' pode ser solicitado em vez de 'Remover'; isso vai deixar os pistões na posição inferior, pronta para aspirar mais soluções com as mesmas seringas.
</li>
		<li>Retire as seringas rodando-as no sentido anti-horário.</li>
		<li>Descarte de seringas e depressões na caixa apropriada (ou lave-as com água desionizada e, em seguida, a solução de etanol 20% v/v para reutilização).</li>
		<li>A placa do selo e coloque-a sobre o misturador de microplacas para 3 min a 1.000 rpm, ou 10 min quando estão sendo misturadas soluções altamente viscosas. A placa está pronta para criação de gotículas de cristalização sobre o dispensador de nanolitros.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Aditivo de triagem protocolo 1 (criação de gotículas de cristalização em uma placa de 96 poços cristalização pré-preenchido com tela aditiva)
	<ol>
<li>Primeiro, prepare a condição com concentrações iniciais de reagentes aumentados 10% (min. vol. 15 mL ao transferir a condição de um contêiner na tela aditivo com o manipulador de líquido).</li>
		<li>Certifique-se de que o manipulador de líquido está pronto para operar. Abra o programa 'Tela de adicionar aos aditivos' por um prato único (Insira o volume em reservatórios: 'µ l 72'). Solicita, figuras e um sistema de ponta-gestão (dicas de 12 x 1.000 µ l necessários) ajuda em certificar-se de que o robô está pronto para operar de acordo com as seleções.
</li>
		<li>Recuperar a tela aditiva de-20 ° C a temperatura da incubadora e remover imediatamente seu selo de alumínio (uso o suporte da placa) e, em seguida, coloque a placa no convés do manipulador de líquido. o programa funciona de acordo com um layout de retrato (a placa é colocada com o A1-canto localizado no canto esquerdo da frente da transportadora). Também também coloca o recipiente com a condição. Execute o programa.</li>
		<li>Uma vez que os reservatórios da placa tem sido preenchidos, coloque-a sobre o agitador microplacas e executar o programa. Lave o recipiente de condição com etanol água e 20% desionisada para reutilização.</li>
		<li>
Configurar as gotas sobre o dispensador de nanolitros. Primeiro, remover o lacre da placa de cristalização (uso o suporte da placa). Então, lugar a placa e a proteína de 8 poços tira na primeira posição do bloco tira-titular. Na guia 'Configuração' sobre o software de controle exibe as posições reais de cada componente no convés. Cada um carregar bem da tira com amostra de proteína de acordo com o tamanho da gota exigido (tabela 4). Executar o programa para preparar gotículas.
</li>
		<li>Após a conclusão do programa, retirar a placa do baralho e selá-lo imediatamente (use o aferidor de placa, adesivo de 3 polegadas de largo). Descarte a tira na caixa apropriada.</li>
		<li>Avaliar o tamanho, forma e centralização de gotas sob o microscópio antes do armazenamento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Aditivo de triagem protocolo 2 (criação de gotículas de cristalização em uma placa de 96 poços cristalização com uma tela de aditiva de re-utilizável)
	<ol>
<li>Primeiro, prepare a tela aditiva: deixar a placa de cultura de células congeladas de 96 poços correspondente para descongelar à temperatura ambiente por 40 min. Em seguida, centrifugar a tela aditiva a 1.000 x g por 2 min.</li>
		<li>Prepare a condição (min. vol. 15 mL ao transferir a condição de um contêiner na tela aditivo com o manipulador de líquido).</li>
		<li>Encha os reservatórios de uma placa de 96 poços de cristalização com a condição. No manipulador de líquido, proceda da mesma forma que o protocolo 1, etapa 2.2.2, mas digitar '80 µ l' para o volume nos reservatórios.</li>
		<li>Configure as gotas sobre o dispensador de nanolitros com 3 componentes no convés (a placa contendo a aditiva tela, juntamente com a placa de cristalização e a tira de 8 poços proteína na primeira posição do bloco tira-titular, tabela 4).</li>
		<li>Selar a placa de cultura de células que contém a tela com uma folha de alumínio e colocá-lo de volta na incubadora de-20 ° C.</li>
		<li>Avaliar o tamanho, forma e centralização de gotas sob o microscópio antes do armazenamento.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Pelo presente afirmamos que um conflito de interesse comercial desde LifeArc comercializa os seguintes produtos: placas de 96 - e 48-poço MRC, o selo de gota suspensão MRC, os MORPHEUS, Pi, ANGSTROM e LMB telas de cristalização.

1 - preparação e uso de telas iniciais armazenados em placas
Kits de triagem deve ser misturado antes de ser dispensado em placas porque separação de precipitação ou fase luminosa ocorre em alguns tubos durante o armazenamento. Quando uma tela é composta de dois kits (2 x 48 tubos), o primeiro tubo do segundo kit é colocado no local E1 da transportadora refrigeração. Quando uma tela é composta de 4 kits (4 x 24 tubos), o primeiro tubo do segundo kit é colocado no local C1, o primeiro tubo do terceiro kit é colocado em local E1 e o primeiro tubo do kit quarto é colocado em local G1. Ao introduzir os tubos em seu portador de resfriamento, as tampas são colocadas em uma bandeja, seguindo o layout padrão paisagem de 96 poços. Desde que bem números são indicados em cima as tampas pelos fabricantes, isto permite verificar se todos os tubos foram colocados na ordem certa. Isso também ajuda a substituir as tampas corretas nos tubos quando um número reduzido de chapas de enchimento.
Nós armazenamos as placas previamente enchidas entre 10 ° C, um compromisso para evitar o congelamento e armazenamento a 4 ° C que pode causar a deterioração das condições e problemas com selagem. As placas são armazenadas por até diversos meses com normalmente sem condensação perceptível na face interna do selo. Isto é menos verdadeiro para placas LMB05, LMB06, LMB09 e LMB10 como estes contêm condições com relativamente altas concentrações de reagentes voláteis (tabela 1). Pequena quantidade de condensação no interior do selo reduz a eficiência de vedação e pode causar contaminação cruzada entre poços durante a retirada do selo as placas. Para ajudar a impedir a condensação durante o resfriamento inicial, as placas podem ser transferidas primeiro no carrossel em um piquenique isolado mais fresco que é armazenado em um quarto frio de 4 ° C durante a noite. O resfriamento muito lento minimiza o desenvolvimento de gradientes de temperatura dentro dos poços selados e, consequentemente, reduz a condensação total15. Além disso, uma vez que as placas são armazenadas na incubadora de 10 ° C, uma in-house personalizada tampa poliestireno SBS é colocada na placa no topo de cada pilha (não mostrado).
Todo o conjunto de nossos pratos previamente enchidos pode ser usado como uma grande tela inicial contra uma amostra de novela, solúvel em água, proteína. Alternativamente, placas menos podem ser selecionadas para atender às necessidades específicas. Por exemplo, LMB15 e LMB19 são telas formuladas especificamente para a proteína de membrana amostras26,27, ou LMB20 é uma tela formulada com átomos pesados para facilitar a supressão experimentais de difração dados28 (ver também : <a href="https://www.youtube.com/watch?v=Gpb4SypWnQY&t=11s">Formulação das telas de cristalização de proteínas do MORPHEUS</a>).
2. criação de gotículas de cristalização
Quando se utiliza o sistema 2 kits com quantidades significativas de reagentes voláteis de triagem deve ser processada primeiro. Isso evita a condensação, formando-se na borracha das tampas SBS, que podem afetar sua manipulação de tampa e vedação da placa. Uma tampa SBS tem um pouco de folga quando no topo de uma placa, que é por isso que eles precisam ser alinhados inicialmente (Veja o protocolo, passo 1.2.6). Os volumes de proteína morto nos poços da placa da PCR são relativamente generoso (0,8 µ l, ver legenda de tabela 2). Note-se que igualmente generosos volumes mortos são empregadas quando usando o dispensador de nanolitros individualmente com proteína em tiras de 8 poços (tabela 4). Volumes menores mortos podem funcionar, no entanto algumas amostras aderem às pontas, calibração de um robô pode tornar-se um pouco imprecisa, o quarto pode ser mais quente que o habitual, etc. Tudo levar a perdas de amostra abrangidas pelos volumes mortos generosos para consolidar a abordagem.
Desenvolvimentos recentes mais habilitado a miniaturização dos experimentos e, portanto, o volume de amostra necessário para condições de cristalização de triagem pode ser significativamente reduzido através da integração da correspondente tecnologia29,30 . No entanto, alguns aspectos da miniaturização ainda mais precisam de cuidadosa consideração, tais como a evaporação de gotículas31 e a manipulação de microcristais32.
Finalmente, centrifugação da placa (2.000 rpm, 1min) poderia ser integrada como um passo final rotineiro ao configurar gotículas de cristalização (no esféricos superior-poços). Um tamanho e a forma de gotículas resultantes de centrifugação mais consistente podem reduzir problemas de reprodutibilidade33,34. Certamente, centradas gotas facilitará a posterior avaliação de experimentos utilizando um microscópio, como a necessária distância focal será semelhante uma placa inteira.
3. vantagens do método 4-canto
A vantagem mais significativa do método 4-canto é sua simplicidade, o que minimiza os erros e facilita simples protocolos automatizados. Por exemplo, as soluções de 4 canto serão sempre colocadas no convés de um manipulador líquido seguindo o mesmo layout. Também, todos os programas são baseados em proporções fixas entre as soluções (Figura 3). Preparação manual das soluções de 4 canto é preferível à manipulação automatizada de soluções em concentrações elevadas, que podem ser altamente viscosas. Aspiração/distribuição relativamente rápido e preciso, é possível na maioria dos tipos de manipuladores de líquidos com requisitos mínimos para a otimização das classes líquidas. Todavia, algumas soluções de canto ainda podem ser muito viscosas para um robô operando com um sistema de líquido para operar eficientemente. É por isso que optamos por um manipulador líquido, operando com deslocamento positivo (Figura 3B).
Além dos 2 gradientes lineares das concentrações, um terceiro componente (ou seja, um conjunto de amortecedores/aditivos) pode ser testado em uma concentração constante de forma conveniente. Por isso, um volume relativamente grande de um conjunto de soluções de canto em uma concentração maior devidamente, excluindo o componente a ser variada, é preparado primeiro. Em seguida, Soluções conservadas em estoque, incluindo este componente é adicionado para ajustar as concentrações finais. Por exemplo, 50 mL de um conjunto de 4 soluções de canto são preparados em altas concentrações de 10% do que inicialmente. Este conjunto de núcleo é então dividido em 5 subconjuntos menores de 4. Finalmente, 10% em volume de soluções tampão-pH diferente é adicionado a cada subconjunto.
4. formatos e tipos de telas de aditivos
As telas são normalmente armazenadas a-20 º C (Figura 4), desde que eles não são usados regularmente e contêm compostos voláteis/instável. O uso de uma tela de aditivo congelada armazenado em um bloco de poço profundo (1 mL em poços) deve ser planejado mais cedo porque vai demorar 12-24 horas para todas as soluções de aditivas descongelar completamente em temperatura ambiente. Também, uma infinidade de usuários compartilham a mesma tela de aditiva, potencialmente causando problemas com contaminação cruzada. Finalmente, a altura do poço profundo blocos torna inadequados para a maioria dos distribuidores de nanolitros. Como uma solução conveniente para contornar esses problemas, a tela deve ser transferida do bloco poço profundo para placas de perfil baixo (Figura 4).
Historicamente, aditivas telas que incluem uma ampla variedade de reagentes único (com concentrações único) têm sido muito populares35,36. No entanto, outros tipos de aditivos telas foram desenvolvidos que integram a mistura de aditivos37 ou um número reduzido de aditivos único encontrado em diferentes concentrações de38. Finalmente, uma abordagem complementar é investigar o efeito de aditivos em amostras antes da cristalização39,40.
5. mais considerações
Boas práticas: A maioria das telas contêm substâncias nocivas ou mesmo tóxicas e, portanto, a proteção pessoal adequada deve ser empregada durante os protocolos. Igualmente, as partes dos robôs móveis podem levar a lesões, especialmente quando tentando interferir manualmente enquanto um programa está sendo executado (embora a maioria dos robôs tem sistema/botão de parada de emergência). Devido as complexidades técnicas envolvidas, regulares verificação de robôs, telas e programas com anteriormente caracterizadas amostras de teste são importantes sustentados níveis elevados de reprodutibilidade.
Taxa de transferência: Como uma indicação, entre 4.000 a 8.000 LMB placas são produzidas anualmente com o sistema 1 (e posteriormente empregados pelos usuários para triagem inicial). Isso não é adaptado para estocar uma grande quantidade de chapas previamente enchidas entre 10 ° C, quando o volume de negócios esperado é muito menor, como após 4-5 meses, algumas condições vai começar a deteriorar-se e evaporar. Diferentes abordagens para protocolos de automação foram implementadas para laboratórios de pequeno para médio-tamanho41.
Armazenar e avaliar experiências: Depois de preparar as gotas, as placas são armazenadas em prateleiras de baixa-vibração em um quarto no 4 ou 18 ° C com temperatura rigidamente controlada (+ /-0,5 ° C máximo desvio). Experimentos são avaliados usando microscópios de fonte de luz fria. Vários sistemas automatizados de imagem estão disponíveis comercialmente, no entanto, deve-se considerar cuidadosamente todos os aspectos: a velocidade necessária para digitalizar uma placa será suficiente para a alta taxa de transferência? Objetos diferentes cristais interferirá com autofocus? A qualidade resultante das imagens serão suficiente para ponto cristais muito pequenos (especialmente em torno da borda das gotículas)? 42 , 43 , 44
Comparação das condições de cristalização: Após cuidadosos investigações sobre a natureza dos cristais obtidos inicialmente, um pode analisar as tendências e as semelhanças entre condições usando o <a href="http://fms-3.lmb.internal/screens2/search.html">banco de dados de tela LMB</a> ou o C6 <a href="http://c6.csiro.au/">Ferramenta Web</a>45.

Cristalografia de raios x é aplicada extensivamente para avançar ainda mais a nossa compreensão dos mecanismos biológicos e doença ao nível atómico e posteriormente ajudar racionais abordagens para descoberta de drogas1. Por isso, purificado e concentrado (2-50 mg/mL) macromolecular amostras de proteínas, DNA, RNA, outros ligantes e seus complexos são julgadas por sua propensão a forma ordenada grades tridimensionais através de cristalização2,3 ,4. Quando cristais de alta qualidade são obtidos que difração de raios-x, a estrutura de cristal pode ser resolvida perto de resolução atômica5,6. Fundamentalmente, as condições para se cristalizar uma nova amostra não podem ser previstas e o rendimento de cristais de alta qualidade é geralmente muito baixo. Uma razão subjacente é que muitas amostras de interesse desafiadoras propriedades bioquímicas, que os tornam instável a escala temporal correspondente para cristalização (normalmente alguns dias). Finalmente, o processo é agravado pelo tempo necessário para produzir amostras e variantes de amostra e para otimizar a sua purificação e cristalização7,8.
Uma condição de cristalização é uma solução com um dessensibilizador que reduz a solubilidade da amostra e condições muitas vezes também contêm buffers e aditivos. Centenas de tais reagentes são bem adaptadas para alterar os parâmetros dos experimentos de cristalização, como eles têm baixa propensão para interferir com a integridade da amostra (como proteínas ou ácidos nucleicos desdobramento). Enquanto milhões de combinações de reagentes de cristalização de teste não é praticável, testar várias a muitos kits de triagem - formulados com várias estratégias9,10 - é possível com ensaios miniaturizados e protocolos automatizados. Nesta perspectiva, a técnica mais favorável é, provavelmente, difusão de vapor com gotas de 100-200 nL sentado sobre um pequeno poço acima de um reservatório que contém a condição de cristalização (25-250 µ l), implementada em placas de cristalização especializada11 , 12. a amostra de proteína e condição muitas vezes são combinados em uma proporção de 1:1 para um volume total de 200 nL ao configurar as gotas na parte superior-poços. Cristalização de proteínas nanolitros robótico pode ser implementada com técnicas alternativas e pratos como o óleo Under lote13 e a fase cúbica lipídico14 (o mais recente um sendo aplicado especificamente às proteínas trans-membrana que são muito pouco solúvel em água).
<a href="http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/groups/JYL/WWWrobots/robot.html">A facilidade de cristalização no MRC-LMB</a> foi iniciado no início de 2000, e um resumo inicial de nossos protocolos automatizados foi apresentado em 200515. Foi apresentada uma introdução histórica à cristalização de proteínas e abordar também um resumo das vantagens da robótica nanolitros (então uma nova abordagem para a experimentação de rotina). Desde macromolecular cristalização é essencialmente um processo estocástico com muito pouco ou não útil informação prévia, empregando uma ampla variedade de condições iniciais (adequadas), aumentar o rendimento da qualidade difração cristais16. Além disso, uma vantagem de muitas vezes negligenciado, de uma grande tela inicial é reduzir significativamente a necessidade de otimização de amostras e cristais em muitos casos. Claro, um ainda pode precisar de prosseguir com a otimização de algumas condições iniciais mais tarde. Normalmente, a concentração dos reagentes e o pH são então sistematicamente investigados. Reagentes mais também podem ser introduzidos na condição (ões) otimizado para alterar mais parâmetros de cristalização. Certamente, um deve tentar cristalização com uma amostra preparada, portanto, os protocolos correspondentes devem ser simples e disponível qualquer hora.
Aqui, dois totalmente automatizada de sistemas projetados para o MRC-LMB (sistemas de 1 e 2) e os protocolos correspondentes são totalmente descritos. A principal aplicação desses dois sistemas é inicial de triagem por difusão de vapor em sentado soltar placas de cristalização. Sistema 1 integra um manipulador de líquido, um carrossel automatizado de estoque placas, uma impressora jato de tinta para a rotulagem de placa e um aferidor de placa adesiva. No sistema 1, 72 placas de 96 poços são preenchidas com kits de triagem disponíveis comercialmente (80 µ l de condição, transferida para o reservatório de um volume inicial de 10 mL em tubos de ensaio), rotuladas e seladas. As placas são então armazenadas em uma incubadora de 10 ° C, onde eles estão disponíveis para os usuários a qualquer momento (como telas iniciais chamadas 'Placas LMB').
Sistema 2 integra um manipulador de líquido, um dispensador de nanolitros e um aferidor de placa adesiva. No sistema 2, sentado gotículas (100-1.000 nL) para experiências de difusão de vapor são produzidos pela combinação de condições e a amostra no superior-poços de 20 placas de 48 ou 96-boas pré-preenchido com as condições. Isto significa 1.920 condições de rastreio inicial são julgadas quando usando 20 placas LMB no sistema 2.
Robôs também são utilizados individualmente para a otimização das condições selecionadas, e os correspondentes protocolos semi-automático também são descritos. O método 4-canto17 é empregada rotineiramente para produzir telas de otimização. O protocolo correspondente primeiro exige a preparação manual de 4 soluções ('A, B, C e D'). Dois gradientes lineares das concentrações (para dois agentes principais de cristalização) então são gerados automaticamente diretamente para os reservatórios de uma placa de cristalização. Por isso, um manipulador de líquidos baseados em seringa dispensa as soluções de 4 canto em diferentes proporções.
Para otimizar ainda mais uma condição, pode-se empregar telas aditivas que potencialmente melhoram as propriedades de resultante cristais18. Duas abordagens estão disponíveis para a seleção de aditiva: um protocolo começando com aditivos corre para os reservatórios das placas de cristalização antes de configurar as gotas (protocolo 1) e outro protocolo, onde a tela aditiva é dispensada diretamente sobre as gotas (protocolo 2).
Outros desenvolvimentos útil que foram iniciados no MRC-LMB para facilitar a cristalização macromolecular automatizada, também são apresentados. Essencialmente, placas de cristalização e dispositivos associados, tais como um empilhável sociedade de Biomolecular triagem (SBS) tampa que minimiza a evaporação das condições ao utilizar o sistema 2.
Por questões de brevidade, presume-se que os usuários estão familiarizados com as funções básicas e manutenção do aferidor de placa adesiva, a impressora jato de tinta e o dispensador de nanolitros. Salvo indicação em contrário, placas no convés dos robôs estão posicionadas tal que o poço A1 ('A1-canto') é no sentido de canto esquerdo atrás de uma operadora de placa.

<table><tbody><tr><td>Robots</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Freedom EVO&reg;</td><td>Tecan</td><td>n/a</td><td>Manipulador de líquidos (Sistema 1). Aspiração/Dispensação com base no líquido do sistema. Integra um carrossel automatizado. Software de controle EVOware plus v.2.4.12.0.&nbsp;</td></tr><tr><td>Microlab&reg; STAR&trade;</td><td>Hamilton</td><td>n/a</td><td>Manipulador de líquidos (Sistema 2). Aspiração/Dispensação com base no deslocamento positivo (tecnologia CO-RE&trade;). Software de controlo Hamilton STAR v.4.3.5.4785 com interface de gestão de métodos.</td></tr><tr><td>Mosquito&reg;</td><td>TTP Labtech</td><td>n/a</td><td>Dispensador de nanolitros à base de microsseringa usado para configurar gotículas (Sistema 2 e autônomo), deck de 3 posições. Software de controle v.3.11.0.1422.&nbsp;</td></tr><tr><td>Libélula&reg;</td><td>TTP Labtech</td><td>n/a</td><td>Manipulador de líquidos à base de seringas usado para produzir telas de otimização (método de 4 cantos). Software de controle v.1.2.1.10196.&nbsp;</td></tr><tr><td>Seladora de placas adesivas</td><td>Brandel</td><td>n/a</td><td>Integrado aos Sistemas 1 e 2 (também utilizado como robô autónomo).</td></tr><tr><td>Impressora a jato de tinta 9232</td><td>Markem-Imaje</td><td>n/a</td><td>Integrada ao Sistema 1. Interface touchscreen.</td></tr><tr><td><forte>Telas de cristalização</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tela de cristal&trade; 1</td> Kit de cristalização <td>Hampton Research</td><td>HR2-110</td><td>(tubos de ensaio, 10mL por condição) usado na tela de cristal LMB01</td></tr><tr><td>2&trade;</td>Kit de Cristalização <td>Hampton Research</td><td>HR2-112</td><td>(tubos de ensaio, 10mL por condição) usado no LMB01</td></tr><tr><td>Wizard&trade; Kit de cristalização Classic 1</td><td>Rigaku</td><td>1009530</td><td>(tubos de ensaio, 10mL por condição) usado no LMB02</td></tr><tr><td>Wizard&trade; Kit de cristalização Classic 2</td><td>Rigaku</td><td>1009531</td><td>(tubos de ensaio, 10mL por condição) usado na tela de grade LMB02</td></tr><tr><td>&trade; Kit de cristalização de sulfato de amônio</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-211</td><td>(tubos de ensaio, 10mL por condição) usado na tela de grade LMB03</td></tr><tr><td>e comércio; PEG/LiCl</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-217</td><td>Kit de cristalização (tubos de ensaio, 10mL por condição) usado em LMB03</td></tr><tr><td>Quick Screen&trade;</td>Kit de Cristalização <td>Hampton Research</td><td>HR2-221</td><td>(tubos de ensaio, 10mL por condição) usado na Tela de Grade LMB03</td></tr><tr><td>&trade; Kit</td> de Cristalização de Cloreto de Sódio <td>Hampton Research</td><td>HR2-219</td><td>(tubos de ensaio, 10mL por condição) usado na Tela de Grade LMB03</td></tr><tr><td>&trade; PEG 6000</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-213</td><td>Kit de cristalização (tubos de ensaio, 10mL por condição) usado na tela de grade LMB04</td></tr><tr><td>&trade; Kit de cristalização MPD</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-215</td><td>(tubos de ensaio, 10mL por condição) usado no LMB04</td></tr><tr><td>MemFac&trade;</td>Kit de cristalização <td>Hampton Research</td><td>HR2-114</td><td>(tubos de ensaio, 10mL por condição) usado em LMB04</td></tr><tr><td>PEG/Ion&trade;</td>Kit de cristalização <td>Hampton Research</td><td>HR2-126</td><td>(tubos de ensaio, 10mL por condição) usado no LMB05</td></tr><tr><td>Natrix&trade;</td>Kit de cristalização <td>Hampton Research</td><td>HR2-116</td><td>(tubos de ensaio, 10mL por condição) usado em LMB05</td></tr><tr><td>Crystal Screen Lite&trade;</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-128</td><td>Kit de cristalização (tubos de ensaio, 10mL por condição) usado na tela LMB06</td></tr><tr><td>Custom Lite</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>n/a</td><td>Kit de cristalização (tubos de ensaio, 10mL por condição) usado em LMB06</td></tr><tr><td>Wizard&trade; Kit de Cristalização Cryo 1</td><td>Rigaku</td><td>1009536</td><td>(tubos de ensaio, 10mL por condição) usado no LMB07</td></tr><tr><td>Wizard&trade; Cryo 2</td><td>Rigaku</td><td>1009537</td><td>Kit de cristalização (tubos de ensaio, 10mL por condição) usado em LMB07</td></tr><tr><td>JBS1</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-101L</td><td>Kit de cristalização (tubos de ensaio, 10mL por condição) usado em LMB08</td></tr><tr><td>JBS2</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-102L</td><td>Kit de cristalização (tubos de ensaio, 10mL por condição) usado em LMB08</td></tr><tr><td>JBS3</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-103L</td><td>Kit de cristalização (tubos de ensaio, 10mL por condição) usado em LMB08</td></tr><tr><td>JBS4</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-104L</td><td>Kit de cristalização (tubos de ensaio, 10mL por condição) usado em LMB08</td></tr><tr><td>JBS5</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-105L</td><td>Kit de cristalização (tubos de ensaio, 10mL por condição) usado em LMB09</td></tr><tr><td>JBS6</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-106L</td><td>Kit de cristalização (tubos de ensaio, 10mL por condição) usado em LMB09</td></tr><tr><td>JBS7</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-107L</td><td>Kit de cristalização (tubos de ensaio, 10mL por condição) usado em LMB09</td></tr><tr><td>JBS8</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-108L</td><td>Kit de cristalização (tubos de ensaio, 10mL por condição) usado em LMB09</td></tr><tr><td>JBS9</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-109L</td><td>Kit de cristalização (tubos de ensaio, 10mL por condição) usado em LMB10</td></tr><tr><td>JBS10</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-110L</td><td>Kit de cristalização (tubos de ensaio, 10mL por condição) usado no LMB10</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; Tela 1 pH 4.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Kit de cristalização (tubos de ensaio, 10mL por condição) usado em LMB10</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; Tela 1 pH 5.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Kit de cristalização (tubos de ensaio, 10mL por condição) usado em LMB10</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; Tela 1 pH 6.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Kit de cristalização (tubos de ensaio, 10mL por condição) usado em LMB11</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; Tela 1 pH 7.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Kit de cristalização (tubos de ensaio, 10mL por condição) usado em LMB11</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; Tela 1 pH 8.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Kit de cristalização (tubos de ensaio, 10mL por condição) usado em LMB11</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; Tela 2 pH 4.5</td><td>Dimensões Moleculares Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Kit de cristalização (tubos de ensaio, 10mL por condição) usado em LMB11</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; Tela 2 pH 5.5</td><td>Dimensões Moleculares Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Kit de cristalização (tubos de ensaio, 10mL por condição) usado em LMB12</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; Tela 2 pH 6.5</td><td>Dimensões Moleculares Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Kit de cristalização (tubos de ensaio, 10mL por condição) usado em LMB12</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; Tela 2 pH 7.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Kit de cristalização (tubos de ensaio, 10mL por condição) usado em LMB12</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; Tela 2 pH 8.5</td><td>Dimensões Moleculares Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Kit de Cristalização (tubos de ensaio, 10mL por condição) usado no Índice LMB12</td></tr><tr><td>&trade;</td>Kit de cristalização <td>Hampton Research</td><td>HR2-144</td><td>(tubos de ensaio, 10mL por condição) usado no LMB13</td></tr><tr><td>SaltRX&trade; 1</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-107</td><td>Kit de cristalização (tubos de ensaio, 10mL por condição) usado no LMB14</td></tr><tr><td>SaltRX&trade; 2</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-109</td><td>Kit de cristalização (tubos de ensaio, 10mL por condição) usado no LMB14</td></tr><tr><td>MemStar&trade;</td>Kit de cristalização <td>MD1-21</td> da <td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>(tubos de ensaio, 10mL por condição) usado no LMB15</td></tr><tr><td>MemSys&trade;</td>Kit de cristalização <td>MD1-25</td> da <td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>(tubos de ensaio, 10mL por condição) usado em LMB15</td></tr><tr><td>JCSG-plus&trade; Kit de</td> cristalização Suite <td>Qiagen</td><td>130720</td><td>(tubos de ensaio, 10mL por condição) usado na tela LMB16</td></tr><tr><td>MORPHEUS&reg;</td><td>Kit</td> de <td>cristalização (tubos de ensaio, 10mL por condição) usado na tela mínima LMB17</td><td></td></tr><tr><td>Pi</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-127 Kit de</td><td>cristalização (tubos de ensaio, 10mL por condição) usado na tela LMB18</td></tr><tr><td>Pi-PEG</td><td>JenaBioScience</td><td>Kit de cristalização CS-128</td><td>(tubos de ensaio, 10mL por condição) usado no LMB19</td></tr><tr><td>MORPHEUS&reg; II tela</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-91</td><td>Kit de cristalização (tubos de ensaio, 10mL por condição) usado na tela de cristalização LMB20</td></tr><tr><td>LMB&trade;</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-98</td><td>Kit de cristalização (tubos de ensaio, 10mL por condição) usado em</td></tr> <tr><td>telas de aditivos LMB21</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HT</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-138</td><td>Congelado em bloco de poço profundo de 96 poços (1 mL por poço).</td></tr><tr><td>Peneira de aditivos MORPHEUS&reg;</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-93-500</td><td>Congelado em bloco de 96 poços profundos (500 &micro; L por poço).</td></tr><tr><td>Peneira aditiva ANGSTROM&trade; &nbsp;</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-100</td><td>Congelado em bloco de poço profundo de 96 poços (1 mL por poço).</td></tr><tr><td>Tela de aditivos MORPHEUS&reg;</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-93</td><td>Congelado em cultura de células de 96 poços Placa Costar&reg; com poços em forma de V (100 &micro; L por poço).</td></tr><tr><td>Peneira aditiva ANGSTROM&trade; &nbsp;</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-100-FX</td><td>Congelado em 96 poços de cultura de células Costar&reg; placa com poço em forma de V (100 &micro; L por poço).</td></tr><tr><td>Tela de aditivos HIPPOCRATES</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>n/a</td><td>48 aditivos simples (compostos de drogas encontrados em MORPHEUS&reg; III).</td></tr><tr><td><forte>Outros consumíveis</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 poços MRC 2 placas de gotas</td><td>Swissci</td><td>MRC 96T-UVP</td><td>Placa de difusão de vapor de queda sentada. Volume recomendado do reservatório: 80&nbsp; &micro;L. Faixa de volumes úteis de gotículas: 10-1000 nL. Transmissível por UV.</td></tr><tr><td>Placa MRC de 1 gota de 48 poços ('Placa MAXI')</td><td>Swissci</td><td>MMX01-UVP&nbsp;</td><td>Placa de difusão de vapor sentada para aumento de escala/otimização. Volume recomendado do reservatório: 200&nbsp; &micro;L. Faixa de volumes úteis de gotículas: 0,1-10 &micro;L. Transmissível UV.</td></tr><tr><td>Selo suspenso MRC</td><td>Swissci</td><td>n/a</td><td>Pendurado, compatível com ambas as placas de difusão de vapor MRC (MRC 96T-UVP e MMX01-UVP). Transmissível por UV e raios X.</td></tr><tr><td>Fita adesiva de vedação</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-50</td><td>3 polegadas de largura Pato&reg; HD Clear&trade; para seladora e selagem manual.</td></tr><tr><td>Folha de alumínio adesiva</td><td>Beckman Coulter</td><td>538619</td><td>Usado para selar novamente telas de aditivos.</td></tr><tr><td>Cartucho de tinta</td><td>Markem-Imaje</td><td>9651</td><td>System 1 (impressora jato de tinta).</td></tr><tr><td>Cartucho de</td><td>solvente Markem-Imaje</td><td>8652</td><td>System 1 (impressora jato de tinta).</td></tr><tr><td>50 &micro; Dicas de L</td><td>Hamilton</td><td>235947</td><td>System 2 (STAR&trade; manipulador de líquidos). Caixa de 6 conjuntos com 1920 x CO-RE&trade; pontas em pilhas descartáveis.</td></tr><tr><td>Recipiente de reagente</td><td>Hamilton</td><td>194052</td><td>Usado para dispensar uma condição em placa(s) durante protocolos de triagem de aditivos.&nbsp;</td></tr><tr><td>placa PCR</td><td>Thermo Scientific&trade;</td><td>AB-2150</td><td>Sistema 2 (contém proteína a ser transferida para o Mosquito&reg;). Abgene Diamond ultra, 384 poços em forma de V.</td></tr><tr><td>microsseringas</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-03020</td><td>Carretel de 26.000 microseringas para o dispensador de nanolitros Mosquito&reg; (espaçamento de 9mm).</td></tr><tr><td>bloco porta-tiras</td><td>TTP Labtech</td><td>3019-05013</td><td>Dispositivo SSB para as tiras Mosquito&reg;, também conhecido como '4-way Reagent Holder'.</td></tr><tr><td>2 &micro; L Tira de 8 poços</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-03110</td><td>Contém proteína no convés do Mosquito&reg;. Caixa de 40 tiras, máx. vol. em poço é de 3,2 &micro;L.</td></tr><tr><td>5 &micro; L Tira de 8 poços</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-03100</td><td>Contém proteína no convés do Mosquito&reg;. Caixa de 40 tiras, máx. vol. em poço é de 7,5 &micro;L.</td></tr><tr><td>Seringas de 5 mL</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-07100</td><td>Corpo da seringa e pistão para o manipulador de líquidos Dragonfly&reg;. Pacote de 100.</td></tr><tr><td>Calhas/Reservatórios</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-07103</td><td>Contém soluções de estoque no convés do Dragonfly&reg;. Pacote de 50.</td></tr><tr><td>Agitador de microplacas orbital</td><td>CamLab Limited</td><td>n/a</td><td>Variomag&reg; para condições de mistura em uma única placa (0-2000 rpm).</td></tr><tr><td>Misturador de microplacas</td><td>TTP Labtech</td><td>3121-01015</td><td>MxOne. Condição de mistura em uma única placa com 96 pinos vibratórios.</td></tr></tbody></table>

automated protocolos para cristalização macromolecular no laboratório de biologia molecular mrc

Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology

Quando cristais de alta qualidade são obtidos que difração de raios-x, a estrutura de cristal pode ser resolvida perto de resolução atômica. As condições para cristalizar proteínas, DNA, RNAs e seus complexos no entanto não podem ser previsto. Empregando uma ampla variedade de condições é uma maneira de aumentar o rendimento de cristais de difração de qualidade. Dois sistemas totalmente automáticos foram desenvolvidos para o MRC laboratório de Biologia Molecular (Cambridge, Inglaterra, MRC-LMB) que facilitam a seleção de cristalização contra 1.920 condições iniciais por difusão de vapor em gotas de nanolitros. Protocolos semi-automático também foram desenvolvidos para otimizar as condições, alterando as concentrações dos reagentes, o pH, ou através da introdução de aditivos que potencialmente melhorar propriedades dos cristais resultantes. Todos os protocolos correspondentes serão descritos detalhadamente e brevemente discutidos. Tomados em conjunto, possibilitam a cristalização macromolecular altamente eficiente e conveniente numa instalação multi-usuário, dando aos usuários controle sobre parâmetros-chave de suas experiências.

Sistemas automatizados e protocolos para a preparação de rotina de um grande número de telas e gotículas de cristalização nanolitros para experimentos de difusão de vapor são descritos e discutidos.

Automated protocolos para cristalização Macromolecular no laboratório de Biologia Molecular MRC

When high quality crystals are obtained that diffract X-rays, the crystal structure may be solved at near atomic resolution. The conditions to crystallize ...

O objetivo geral deste procedimento é produzir cristais de alta qualidade a partir de condições iniciais de triagem de cristalização. Os cristais podem ser utilizados para estudar as estruturas de proteínas, DNA, RNA e seus complexos. Algo sobre as estruturas macromoleculares tornou-se crescentemente desafiador.E fornecer uma ampla variedade de condições iniciais aumenta o rendimento de cristais úteis, ao mesmo tempo que reduz a necessidade de otimização da amostra e dos cristais. Os dois sistemas totalmente automatizados, do LMB, facilitam a preparação de até 1.920 experimentos de difusão por vapor em gotas de nanolitros. Por brevidade, assume-se que os usuários já estão familiarizados com as funções básicas e a manutenção do dispensador de nanolitros, da impressora jato de tinta e do selador adesivo de placas.Antes de realizar o procedimento, certifique-se de que os robôs do sistema estão inicializados e que o software de controle está aberto. Ligue o refrigerador do suporte de resfriamento de tubos cerca de 30 minutos antes do início do programa principal. Coloque uma placa de teste no suporte SBS motorizado do selador de placas.Execute o selador de placas e verifique se o filme foi adequadamente aplicado. Repita este teste mais duas vezes para confirmar que o selador de placas está pronto. Em seguida, adicione 20 litros de água desionizada ao recipiente principal do manipulador líquido.Desconecte os insertos de acoplamento do recipiente menor com a solução de enxágue de 20% de etanol e conecte os insertos ao recipiente principal. Insira o nome da tela apropriado na tela sensível ao toque da impressora jato de tinta. Em seguida, abra e feche a porta do carrossel para acionar a rotação do carrossel.Abra a porta quando a primeira pilha aparecer. Carregue completamente a primeira pilha com 22 placas de cristalização, cada uma com a coluna um voltada para fora. Carregue completamente as próximas duas pilhas da mesma maneira.Carregue os seis placas restantes nas posições superiores da quarta pilha e, em seguida, feche a porta do carrossel. Verifique se o visor do refrigerador indica 14 graus Celsius. Inverta suave e repetidamente os kits de triagem selecionados durante um minuto.Em seguida, abra o painel frontal do manipulador de líquidos. Abra os tubos e coloque-os no suporte refrigerado dispostos no formato padrão de 96 poços. Ao colocar cada tubo no suporte, coloque sua tampa na bandeja, mantendo o mesmo alinhamento de 96 poços.Ao utilizar o Sistema 1, os cabos dos rótulos são colocados na bandeja no formato de 96 poços para permitir a verificação cruzada de que os tubos estão dispostos corretamente. Verifique as posições dos tubos e certifique-se de que todos os tubos estão nivelados e bem assentados no suporte. Em seguida, feche o painel frontal.No menu Inicial do software do manipulador líquido, selecione Executar Manutenção e abra o programa de Lavagem. Execute o programa para remover o etanol 20% do sistema e lavar as partes externas das ponteiras de dispensação de líquidos. Quando a lavagem estiver concluída, clique em Cancelar para retornar ao menu Inicial.Selecione Executar um Processo Existente e clique em Iniciar sua Seleção. Abra o programa de dispensação do Kit MRC. Preencha 18" para Instâncias na tela de Configuração e execute o programa. Monitore o sistema enquanto as quatro primeiras placas são etiquetadas, preenchidas e seladas.Não deixe o sistema sem supervisão até que a preparação das primeiras quatro placas esteja concluída. Depois que todas as 72 placas forem preparadas e recolocadas na platina, troque os conectores do recipiente com água desionizada para o recipiente com etanol a 20%. Execute o programa de lavagem inicial usando o mesmo procedimento anterior.Desligue o refrigerador e descarte os tubos vazios do kit de triagem. Remova cuidadosamente as 72 placas preparadas do carrossel. Descarte as placas preenchidas incorretamente ou mal seladas.Armazene as placas prontas para uso a 10 graus Celsius. Primeiro, certifique-se de que os robôs do sistema estão ligados, o dispensador de nanolitros está inicializado com seu software aberto e o gerenciador de métodos do manipulador de líquidos está aberto. Ligue o suporte de refrigeração para microtubos cerca de 15 minutos antes de o programa principal ser iniciado.Coloque uma placa de teste no suporte SBS motorizado do selador de placas. Execute o selador de placas e verifique se a placa foi selada corretamente. Teste o selador de placas três vezes.Em seguida, execute o dispensador de nanolitros para depositar gotas de 100 nanolitros da solução-teste em uma placa de teste. Aqui é mostrada uma micrografia em luz visível de uma gota de 100 nanolitros, produzida pelo dispensador de nanolitros, com a solução-teste preparada com corante vermelho. Feche o software do dispensador de nanolitros e remova o bloco porta-faixas da plataforma.Em seguida, coloque, em um suporte de placa personalizado, uma placa de cristalização de 96 poços pré-preenchida com a maior quantidade relativa de reagentes voláteis em suas condições. Remova o filme adesivo da placa. Abra o painel frontal do manipulador líquido e coloque a placa não selada na plataforma na parte traseira do primeiro carrinho deslizante.Cubra a placa com uma tampa de alumínio SBS. Posicione a tampa no canto traseiro esquerdo do suporte aplicando pressão suave no canto oposto da tampa. Ao utilizar o Sistema 2, kits de triagem com quantidades significativas de reagentes voláteis devem ser processados primeiro.Isso evita a formação de condensação nos leads SBS, o que poderia afetar o manuseio automatizado dos leads ou a vedação da placa. Desvaze, carregue nas plataformas deslizantes e cubra as 19 placas restantes da mesma maneira, trabalhando das condições mais às menos voláteis. Assim que o suporte de resfriamento do microtubo atingir 4 graus Celsius, indicado por uma luz verde, remova sua tampa.Corte a tampa de um microtubo contendo pelo menos 440 microlitros de uma amostra de proteína. Certifique-se de que a amostra não tenha espuma acima do menisco, pois isso interferirá no sistema de detecção de líquido. Coloque o tubo na Posição 1 do suporte refrigerado para microtubos.Coloque uma placa de PCR no suporte do manipulador líquido na frente do porta-adaptador de movimentação de placas. Em seguida, feche o painel frontal. Na interface de gerenciamento de métodos do manipulador líquido, selecione Configurar Placas.Monitore a inicialização de ambos os sistemas e preencha os parâmetros da corrida, incluindo o tipo de placa e o número de gotas para cada condição, o tamanho da gota, a posição da primeira placa a ser processada e o número de placas. Clique em Não quando perguntado se deseja ajuda para carregar o deck. Depois de verificar que não há suportes de ponteiras vazios, clique em OK. Após confirmar que há ponteiras suficientes para a corrida, clique em OK. Quando necessário, atualize o sistema de gerenciamento de ponteiras e clique em OK. Certifique-se de que o deck do dispensador de nanolitros esteja livre do bloco do suporte de tiras e de que o porta-objetos esteja na parte traseira das pilhas de ponteiras de 50 microlitros, as quais devem estar livres das tampas de alumínio SBS.Verifique novamente se todos os outros componentes necessários estão prontos e, em seguida, inicie o processo. Monitore o sistema enquanto o dispensador de nanolitros deposita as gotas na primeira placa e o selador de placas posteriormente selar a placa. Não deixe o sistema sem supervisão até que a preparação da primeira placa esteja concluída.Após todos os 20 placas terem sido preparadas com gotas de cristalização e retornarem automaticamente aos portadores deslizantes, abra o painel frontal e remova cuidadosamente as placas. Verifique se as placas estão adequadamente seladas antes de armazená-las para cristalização. Limpe as tampas SBS com a solução de etanol 20% antes de empilhá-las no lado esquerdo do manipulador líquido para armazenamento.Descarte a placa de PCR e o microtubo. Desligue o suporte refrigerado para microtubos e remova o condensado. Deixe uma toalha de papel sobre a superfície fria para absorver qualquer condensação adicional.Em seguida, substitua a tampa do porta-amostras e feche o painel frontal. OmpF e MreB foram inicialmente triados usando esses protocolos totalmente automatizados. Cristais de OmpF de qualidade suficiente para difração de raios X foram encontrados no poço A4 da placa LMB 7.Foram encontrados cristais de qualidade para difração de MreB no poço D12 da placa LMB 20. Armazenar as placas pré-incubadas a 10 graus Celsius é um compromisso para evitar o congelamento e o armazenamento a 4 graus, o que pode causar deterioração das condições de cristalização e problemas relacionados à condensação. Quando armazenadas dessa forma, as placas podem ser utilizadas dentro de quatro a cinco meses.Entre 4 e 8.000 placas LMB são produzidas anualmente com o Sistema 1 e posteriormente utilizadas para triagem inicial. Os protocolos devem ser otimizados de forma diferente quando a rotatividade esperada for muito menor. Todo o nosso conjunto de placas pré-combustível é normalmente usado como uma triagem inicial ampla para uma amostra nova.No entanto, menos placas podem ser selecionadas de acordo com requisitos de amostra mais específicos. Após o preparo das gotículas, as placas são armazenadas em prateleiras com baixa vibração e temperatura rigorosamente controlada a 4 ou 18 graus Celsius. Os experimentos são avaliados com microscópios de fonte de luz rolante.Após investigar cuidadosamente a natureza dos cristais, características e semelhanças entre diferentes condições podem ser analisadas com ferramentas baseadas na web, como as bases de dados LMB ou C6 Screen. Pode ser ainda necessário otimizar as condições de cristalização. Outros protocolos automatizados, com os métodos de quatro cantos e triagem de aditivos, são descritos em nosso artigo.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

A estrutura 3-D de uma molécula fornece um entendimento único de como as funções molécula. O principal método para determinação da estrutura de quase-atômica resolução é cristalografia de raios X. Aqui, demonstramos os métodos atuais de obtenção de cristais tridimensionais de qualquer macromolécula, uma vez que são adequados para determinação de estrutura por cristalografia de raios X.

Cristalização de proteínas para cristalografia de raios X

Aqui é descrito um método para robótica de alto rendimento de cristalização de proteínas de membrana em mesofases lipídicos para utilização na determinação da estrutura utilizando a cristalografia de raios-X macromolecular. Três robôs capazes de lidar com o viscoso e pegajoso mesofase proteína-laden integrante do método são introduzidos.

A utilização de um robô para alta capacidade de cristalização de proteínas de membrana em mesofases lipídicas

Aqui nós descrevemos um método geral para triagem aleatória matriz microseed. Esta técnica é mostrado para aumentar significativamente a taxa de sucesso de proteína de cristalização experimentos de triagem, reduzir a necessidade de otimização, e fornecer um suprimento confiável de cristais para a coleta de dados e experimentos ligante de imersão.

Melhorar a taxa de sucesso de cristalização de proteínas pela Random Microseed Matrix Screening

Aqui, descrevemos como usar a triagem automatizada e opções de coleta de dados disponíveis em um pouco de luz síncroton síncrotron. Os cientistas enviar amostras de cryocooled para o síncrotron e as propriedades de difração são selecionadas, os conjuntos de dados são recolhidos e tratados e, sempre que possível, uma solução de estrutura é realizada — tudo sem intervenção humana.

Caracterização totalmente autónoma e coleta de dados de cristais de macromoléculas biológicas

Um suporte novo da amostra para o cristalografia macromolecular do raio X junto com um protocolo de manipulação apropriado é apresentado. O sistema permite o crescimento de cristal, a imersão de cristal e a coleta de dados de difração in situ em temperatura ambiente e criogênica sem a necessidade de qualquer manipulação ou montagem de cristais.

Um suporte de amostra tudo-em-um para a cristalografia macromolecular do raio X com espalhamento mínimo do fundo

Estudos estruturais de biomacromolecules por cristalografia requerem cristais de alta qualidade. Aqui demonstramos um protocolo que pode ser usado pelo OptiCrys (um instrumento totalmente automatizado desenvolvido em nosso laboratório) e/ou botões de microdiálise para o crescimento de grandes cristais de alta qualidade com base no conhecimento do diagrama de fase de cristalização.

Otimização do Crescimento de Cristal para Cristalização Macromolecular de Nêutrons

A relação sinal-ruído dos dados é uma das considerações mais importantes na realização de medições de difração de raios-X a partir de microcristais. A linha de feixe VMXm fornece um ambiente de baixo ruído e micróbios para tais experimentos. Aqui, descrevemos métodos de preparação de amostras para montagem e resfriamento de microcristais para VMXm e outras linhas de cristalografia macromolecular microfocus.

Um pipeline de preparação de amostras para microcristais na linha de feixe VMXm

Aqui, descrevemos como usar os dutos de cristalografia macromolecular automatizados para análises de proteínas para estrutura, análise rápida do complexo ligante-proteína e triagem de fragmentos em larga escala com base na tecnologia CrystalDirect no Laboratório HTX em EMBL Grenoble.

Os gasodutos automatizados de cristalização no embl HTX Facility em Grenoble

Este protocolo detalha a triagem de cristalização de alto rendimento, desde a preparação da placa de microensaio de 1.536 até o final de uma janela de tempo experimental de 6 semanas. Detalhes são incluídos sobre a configuração da amostra, as imagens obtidas e como os usuários podem realizar análises usando uma interface gráfica de usuário habilitada por inteligência artificial para identificar de forma rápida e eficiente as condições de cristalização macromolecular.

Triagem de alto rendimento para obter hits de cristal para cristalografia de proteínas

Apresentamos um protocolo para a cristalização de proteínas usando a instalação de cristalização no Complexo de Pesquisa em Harwell e subsequente coleta de dados cristalográficos de raios X in situ de cristais dentro das placas na linha de luz Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi) de Diamond. Descrevemos os requisitos da amostra, protocolos de cristalização e diretrizes de coleta de dados.

Cristalização e Coleta de Dados de Temperatura Ambiente In Situ Usando a Instalação de Cristalização em Harwell e Linha de Luz VMXi, Fonte de Luz Diamante

Aprenda a preparar cristais de alta qualidade para estudos estruturais de macromoléculas usando sistemas automatizados de difusão de vapor. Este método permite até 1.920 experimentos com gotículas nanolíticas.

Automated protocolos para cristalização Macromolecular no laboratório de Biologia Molecular MRC

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