Uso de Immunolabeling para analisar os microtúbulos estáveis, dinâmicos e emergentes no embrião Zebrafish

O objetivo geral desses procedimentos de marcação é imaginar e quantificar microtúbulos estáveis, dinâmicos e nascentes no embrião em desenvolvimento de peixe-zebra. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área da neurobiologia do desenvolvimento, como, por exemplo, como os microtúbulos contribuem para o estabelecimento da polaridade celular. A principal vantagem dessa técnica é que ela otimiza a detecção e a quantificação de populações distintas de microtúbulos in situ.

Em geral, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades devido aos desafios em manter a integridade dos microtúbulos. Após desclorinar embriões de peixe-zebra em estágios definidos de acordo com o protocolo descrito, transfira-os para tubos de centrífuga de 1,5 mL, removendo o máximo de meio possível. Adicione um mililitro de PFA a 4% em tampão de montagem de microtúbulos ou MAB para fixar os embriões a 28,5 °C durante cinco minutos.

Em seguida, use uma pipeta para aspirar o fixador e substituí-lo por um mililitro de fixador fresco. Incube as amostras em um agitador horizontal à temperatura ambiente por três horas. Aspire o fixador e adicione um mililitro de tampão TBS NP-40.

Agite suavemente os embriões em um agitador durante cinco minutos. Repita a lavagem mais duas vezes. Em seguida, após substituir o tampão por um mililitro de TBS NP-40 fresco, armazene os embriões a quatro graus Celsius por não mais de sete dias.

Após a remoção da gema e o encapsulamento dos embriões em agarose de acordo com o protocolo descrito, coloque a placa de corte contendo TBS NP-40 e use um vibrátomo para gerar seções de 40 micrômetros ao longo do eixo mais longo dos embriões embebidos em agarose. Utilize pinças finas para transferir as seções de interesse para 500 microlitros de TBS NP-40 em uma placa de 24 poços. Remova o tampão e adicione 500 microlitros da solução bloqueadora.

Em seguida, agite as seções à temperatura ambiente por pelo menos uma hora. Substitua a solução bloqueadora por 300 microlitros de anticorpos primários diluídos no tampão bloqueador e incube as amostras em agitador a quatro graus Celsius por 36 a 72 horas. Utilize 600 microlitros de TBS NP-40 para lavar as amostras duas vezes.

Coloque-as em um agitador à temperatura ambiente por 30 minutos cada. Adicione 300 microlitros de anticorpos secundários conjugados a fluoróforo diluídos em tampão bloqueador às seções e incube-as no escuro em um agitador a quatro graus Celsius por 16 a 24 horas. Em seguida, lave as amostras duas vezes conforme acabou de ser demonstrado.

Em seguida, adicione 500 microlitros de solução de DAPI aos embriões e incube-os à temperatura ambiente por 30 minutos. Depois, use TBS NP-40 para lavar as amostras três vezes à temperatura ambiente, durante cinco minutos cada. Após as lavagens, coloque uma gota de meio de montagem com agente anti-desvanecimento no centro de uma lâmina livre de poeira.

Use pinças finas para transferir as seções para a gota de meio de montagem. Em seguida, coloque uma lamínula livre de poeira sobre a amostra. Armazene as lâminas envolvidas em papel-alumínio, em local seco, escuro e fresco até a realização da imagem.

Usando os detalhes descritos no protocolo textual, capture imagens confocais em z stack com configurações de canais para os fluoróforos da segunda anticorpo selecionados e salve os arquivos de imagem. Com um software de análise 3D, como o Image J, abra a cópia do arquivo de dados. Crie uma imagem mesclada sobrepondo os canais de interesse ao selecionar imagem, cor, mesclar canais.

Selecione os canais de 594 nanômetros, 488 nanômetros e DAPI para serem coloridos artificialmente em vermelho, verde e azul, respectivamente. Marque a opção, crie uma composição e selecione, OK. Visualize a pilha z mesclada como uma única imagem 2D realizando uma projeção de intensidade máxima da pilha z usando imagens, pilha, projetar z.

Insira as posições inicial e final dos planos z internos melhores como lâmina inicial e corte final, respectivamente. Selecione intensidade máxima como o tipo de projeção e clique em ok. No software de análise 3D, selecione criar biblioteca e forneça um nome descritivo para a biblioteca de imagens.

Clique, crie e arraste arquivos de imagem bruta para a biblioteca. Em seguida, selecione um arquivo para analisar. Depois, no menu exibir, escolha foco estendido para exibir a imagem mesclada por canal na janela principal.

Selecione a ferramenta de ROI de mão livre e delimite a região de interesse a ser analisada. Selecione a aba ações, seguida por recortar para seleção, para cortar a imagem. Em seguida, salve o arquivo de imagem recortada com um novo nome.

Em seguida, clique na guia medições para criar o protocolo de filtragem de objetos específicos relevantes para a análise em 3D. Depois, arraste e localize os objetos na janela do protocolo e renomeie o primeiro protocolo como DAPI. Selecione o canal da beta tubulina no menu suspenso.

Em seguida, arraste as seguintes configurações para o protocolo da tubulina beta e posicione-as abaixo de "encontrar objetos", na seguinte ordem: preencher buracos e objetos, separar objetos que se tocam, excluir objetos por tamanho e excluir objetos que não tocam nas ROIs. Agora, selecione "medir" na parte inferior de cada protocolo.

Em seguida, para todos os canais exceto DAPI, selecione a medição de intensidade e volume e o comprimento esquelético para todas as marcações de tubulina. Desenhe uma ROI ao redor da região a ser medida. Na guia resumo, observe as medições após o software processar a região.

Em seguida, copie os dados e salve-os em uma planilha utilizável conforme mostrado aqui. Para montar um aparato de fluxo contínuo com múltiplas cavidades, utilizando uma guia ou uma serra de fita, divida um tubo de centrífuga de 50 mililitros ao meio longitudinalmente. De uma malha de náilon de 70 micrômetros, recorte sete semicírculos com um raio de três centímetros e ajuste-os para encaixar firmemente em uma metade do tubo de centrífuga dividido.

Usando selante de silicone seguro para aquários, cole as semicircunferências no tubo de centrífuga paralelamente às marcações de graduação de 10 mililitros. Após deixar o dispositivo secar por dois dias, enxágue-o mergulhando-o em um béquer com água por duas a três horas. Forre a extremidade superior roscada do tubo de centrífuga cortado com massa de modelar, de modo que a altura do líquido retido no dispositivo de fluxo tenha uma profundidade de um quarto de polegada.

Prepare o aparelho de lavagem removendo o êmbolo de uma seringa de 50 mililitros e inserindo 30 centímetros de tubo fino na ponta. Empurre o tubo até onde for possível e use massa de modelar para selar ao redor da junção. Com meio para embriões, umedeça previamente a malha para permitir que o líquido passe por todo o dispositivo de fluxo contínuo.

Incline o dispositivo sobre gelo de modo que o líquido preencha todos os compartimentos, mas ainda escoe pela frente, onde se localiza a borda de argila. Suspenda o aparelho de lavagem em um suporte com anel acima do dispositivo de fluxo contínuo sobre gelo. Resfrie 200 mililitros de meio para embrião em gelo e despeje uma quantidade suficiente no aparelho de lavagem para garantir que todas as bolhas de ar sejam removidas e que a taxa de fluxo seja de aproximadamente sete mililitros por minuto.

Ajuste a taxa de fluxo alterando a altura da seringa. Após desclorinar os embriões e preparar a nocodazol de acordo com o protocolo descrito no texto, utilize 10 mililitros da solução de trabalho de nocodazol fria para trocar o meio dos embriões do grupo tratado com nocodazol. Coloque as placas de Petri sobre gelo por um tempo apropriado para o estágio de desenvolvimento.

Em seguida, utilizando uma pipeta de vidro de um mililitro com ponta flamejada, transfira os embriões para o aparato de fluxo contínuo, usando compartimentos separados para cada grupo experimental. Inicie a lavagem do nocodazol despejando o meio para embriões gelado na parte superior da seringa de 50 mililitros. Permita o re crescimento dos microtúbulos após 20 minutos de lavagem à temperatura ambiente, utilizando uma pipeta de vidro de um mililitro com ponta flamejada para transferir os embriões para placas de Petri de vidro contendo meio para embriões aquecido.

Assim que os embriões forem transferidos, inicie um cronômetro. Por fim, fixe os embriões de controle e de lavagem após um, cinco e dez minutos, pipetando aproximadamente 10 embriões para um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro contendo um mililitro de fixador MAB 4% PFA e fixe as amostras conforme demonstrado anteriormente neste vídeo. Utilizando glu-tubulina e tyr-tubulina como marcadores para microtúbulos estáveis e dinâmicos.

Mostra-se que microtúbulos dinâmicos predominam no cérebro posterior na fase da vesícula neural. Conforme a vesícula se desenvolve em bastão neural, uma fase de epitelialização acentuada, qualitativamente, há menos microtúbulos imunorreativos com o anticorpo anti-tir-tubulina, especialmente no bastão neural ventral. Em contraste, a glu-tubulina é dispersa e pontuada ao longo de toda a vesícula neural, mas está enriquecida no bastão neural ventral ao longo do trajeto dos microtúbulos.

As setas indicam feixes ou estruturas microtubulares específicos onde a marcação está aumentada. O tratamento com nocodazol despolimeriza os microtúbulos, resultando em marcação difusa. À medida que os microtúbulos se regeneram, eles se estendem a partir do centróssomo.

No entanto, isso pode não ser evidente em um único plano devido às suas trajetórias não planares. Apesar disso, alguns softwares de análise de imagem são capazes de medir comprimentos em 3D, permitindo uma avaliação do crescimento dos microtúbulos após a lavagem do nocodazol. O comprimento médio dos microtúbulos parece aumentar ao longo do tempo após a lavagem do nocodazol em todas as regiões do tubo neural analisadas.

Uma vez que a análise dos dados é concluída utilizando o software de análise de imagens 3D e o controle de qualidade é realizado, informações úteis podem ser obtidas a partir dos dados brutos, como o comprimento médio dos microtúbulos totais e dos microtúbulos estáveis, além da proporção de microtúbulos estáveis em relação aos microtúbulos totais. Após dominada, esta técnica não leva mais do que uma semana do início ao fim. Ao tentar realizar este procedimento, é importante lembrar de coletar e processar as amostras em tempo hábil, pois os microtúbulos se despolimerizam facilmente.

Este procedimento também pode ser aplicado à análise de mutantes. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como capturar populações distintas de microtúbulos no embrião intacto.