Name: Microcristalografia de Cristais de Proteína e Em Cellulo Difração (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Aprenda cristalografia de raios X para microcristais de proteínas produzidos em células vivas, eliminando purificações complexas. Este método simplifica a análise estrutural em fontes síncrotron.

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Os autores gostariam de reconhecer Chan-Sien Lay por fornecer imagens de microcristais purificados, Daniel Eriksson e Tom Caradoc-Davies para obter suporte na linha de transmissão MX2 do Synchrotron australiano e Kathryn Flanagan e Andrew Fryga da unidade FlowCore na Universidade Monash para os seus Assistência inestimável.

<ol><li>Tari, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+utility+of+structural+biology+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Bio+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">The utility of structural biology in drug discovery.</a> Methods Mol Bio (Clifton, N.J). 841, 1-27 (2012).</li>
<li>Gati, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+crystallography+on+in+vivo+grown+microcrystals+using+synchrotron+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation.</a> IUCrJ. 1 (2), 0(2014).</li>
<li>Redecke, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natively+inhibited+Trypanosoma+brucei+cathepsin+B+structure+determined+by+using+an+X-ray+laser%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Natively inhibited Trypanosoma brucei cathepsin B structure determined by using an X-ray laser.</a> Science. 339 (2013), 227-230 (2013).</li>
<li>Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. <a target="_blank" href="https://elifesciences.org/articles/01345">Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals.</a> eLife. 2 (0), e01345(2013).</li>
<li>Evans, G., Axford, D., Waterman, D., Owen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/0889311X.2010.527964">Macromolecular microcrystallography.</a> Crystallog. Rev. 17 (2), 105-142 (2011).</li>
<li>Smith, J. L., Fischetti, R. F., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-crystallography+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Micro-crystallography comes of age.</a> Curr Opin Struct Biol. 22 (5), 602-612 (2012).</li>
<li>Boudes, M., Garriga, D., Coulibaly, F. <a target="_blank" href="http://www.publish.csiro.au/CH/CH14455">Reflections on the Many Facets of Protein Microcrystallography.</a> Aust J Chem. 67 (12), 1793-1806 (2014).</li>
<li>Nelson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+cross-beta+spine+of+amyloid-like+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the cross-beta spine of amyloid-like fibrils.</a> Nature. 435 (7043), 773-778 (2005).</li>
<li>Coulibaly, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+organization+of+cypovirus+polyhedra%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The molecular organization of cypovirus polyhedra.</a> Nature. 446 (7131), 97-101 (2007).</li>
<li>Coulibaly, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+atomic+structure+of+baculovirus+polyhedra+reveals+the+independent+emergence+of+infectious+crystals+in+DNA+and+RNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The atomic structure of baculovirus polyhedra reveals the independent emergence of infectious crystals in DNA and RNA viruses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22205-22210 (2009).</li>
<li>Johansson, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+photosynthetic+reaction+centre+determined+by+serial+femtosecond+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Structure of a photosynthetic reaction centre determined by serial femtosecond crystallography.</a> Nat Comm. 4, (2013).</li>
<li>Li, D., Boland, C., Aragao, D., Walsh, K., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harvesting+and+Cryo-cooling+Crystals+of+Membrane+Proteins+Grown+in+Lipidic+Mesophases+for+Structure+Determination+by+Macromolecular+Crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography.</a> J Vis Exp. (67), (2012).</li>
<li>Roedig, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+micro-patterned+silicon+chip+as+sample+holder+for+macromolecular+crystallography+experiments+with+minimal+background+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A micro-patterned silicon chip as sample holder for macromolecular crystallography experiments with minimal background scattering.</a> Sci Rep. 5, 10451(2015).</li>
<li>Koopmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+protein+crystallization+opens+new+routes+in+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo protein crystallization opens new routes in structural biology.</a> Nature Methods. 9 (3), 259-262 (2012).</li>
<li>Gallat, F. -X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+crystallography+at+X-ray+free-electron+lasers%3A+the+next+generation+of+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Phil+Trans+R+Soc+B%22%5BJournal%5D)">In vivo crystallography at X-ray free-electron lasers: the next generation of structural biology.</a> Phil Trans R Soc B. 369 (1647), 20130497(2014).</li>
<li>Duszenko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+protein+crystallization+in+combination+with+highly+brilliant+radiation+sources+offers+novel+opportunities+for+the+structural+analysis+of+post-translationally+modified+eukaryotic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst.+F%22%5BJournal%5D)">In vivo protein crystallization in combination with highly brilliant radiation sources offers novel opportunities for the structural analysis of post-translationally modified eukaryotic proteins.</a> Acta Cryst. F. 71 (8), 929-937 (2015).</li>
<li>Axford, D., Ji, X., Stuart, D. I., Sutton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+cellulo+structure+determination+of+a+novel+cypovirus+polyhedrin%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst+D%22%5BJournal%5D)">In cellulo structure determination of a novel cypovirus polyhedrin.</a> Acta Cryst D. 70 (5), 1435-1441 (2014).</li>
<li>Sawaya, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+crystal+structure+obtained+at+2.9+%C3%85+resolution+from+injecting+bacterial+cells+into+an+X-ray+free-electron+laser+beam%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Protein crystal structure obtained at 2.9 Å resolution from injecting bacterial cells into an X-ray free-electron laser beam.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (35), 12769-12774 (2014).</li>
<li>Tsutsui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Diffraction-Quality+Protein+Crystal+Processed+as+an+Autophagic+Cargo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">A Diffraction-Quality Protein Crystal Processed as an Autophagic Cargo.</a> Mol Cell. 58 (1), 186-193 (2015).</li>
<li>Boudes, M., Garriga, D., Fryga, A., Caradoc-Davies, T., Coulibaly, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pipeline+for+structure+determination+of+in+vivo-grown+crystals+using+in+cellulo+diffraction%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst+D%22%5BJournal%5D)">A pipeline for structure determination of in vivo-grown crystals using in cellulo diffraction.</a> Acta Cryst D. 72, 576-585 (2016).</li>
<li>Doye, J. P. K., Poon, W. C. K. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1359029405000956">Protein crystallization in vivo.</a> Curr Opin Colloid Interface Sci. 11 (1), 40-46 (2006).</li>
<li>Mori, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Bombyx+mori+cytoplasmic+polyhedrosis+virus+polyhedrin+in+insect+cells+by+using+a+baculovirus+expression+vector%2C+and+its+assembly+into+polyhedra%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Expression of Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus polyhedrin in insect cells by using a baculovirus expression vector, and its assembly into polyhedra.</a> J Gen Virol. 74, Pt 1 99-102 (1993).</li>
<li>Arevalo, M. T., Wong, T. M., Ross, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+Purification+of+Virus-like+Particles+for+Vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination.</a> J Vis Exp. (112), (2016).</li>
<li>Yates, L. A., Gilbert, R. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Production+and+Purification+of+Recombinant+Murine+Kindlin-3+from+Insect+Cells+for+Biophysical+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies.</a> J Vis Exp. (85), (2014).</li>
<li>Berger, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MultiBac+Protein+Complex+Production+Platform+at+the+EMBL%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL.</a> J Vis Exp. (77), (2013).</li>
<li>Margine, I., Palese, P., Krammer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Functional+Recombinant+Hemagglutinin+and+Neuraminidase+Proteins+from+the+Novel+H7N9+Influenza+Virus+Using+the+Baculovirus+Expression+System%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System.</a> J Vis Exp. (81), (2013).</li>
<li>Khurana, A., Kronenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+For+Production+of+Recombinant+mCD1d+Protein+in+Insect+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.</a> J Vis Exp. (10), (2007).</li>
<li>Ricardo, R., Phelan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+and+Determining+the+Viability+of+Cultured+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Counting and Determining the Viability of Cultured Cells.</a> J Vis Exp. (16), (2008).</li>
<li>Baskaran, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+cellulo-derived+structure+of+PAK4+in+complex+with+its+inhibitor+Inka1%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">An in cellulo-derived structure of PAK4 in complex with its inhibitor Inka1.</a> Nat Comm. 6, 1-11 (2015).</li>
<li>Armour, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-target+Parallel+Processing+Approach+for+Gene-to-structure+Determination+of+the+Influenza+Polymerase+PB2+Subunit%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit.</a> J Vis Exp. (76), (2013).</li>
<li>Otwinowski, Z., Minor, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+X-ray+diffraction+data+collected+in+oscillation+mode%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode.</a> Methods Enzymol. 276, 307-326 (1997).</li>
<li>Battye, T. G. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., Leslie, A. G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iMOSFLM%3A+a+new+graphical+interface+for+diffraction-image+processing+with+MOSFLM%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst+D%22%5BJournal%5D)">iMOSFLM: a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM.</a> Acta Cryst D. 67, Pt 4 271-281 (2011).</li>
<li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XDS%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst+D%22%5BJournal%5D)">XDS.</a> Acta Cryst D. 66, Pt 2 125-132 (2010).</li>
<li>French, S., Wilson, K. <a target="_blank" href="http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?a15572">On the treatment of negative intensity observations.</a> Acta Cryst.A. 34, 517-525 (1978).</li>
<li>Winn, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+the+CCP4+suite+and+current+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst+D%22%5BJournal%5D)">Overview of the CCP4 suite and current developments.</a> Acta Cryst D. 67, Pt 4 235-242 (2011).</li>
<li>Foadi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clustering+procedures+for+the+optimal+selection+of+data+sets+from+multiple+crystals+in+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst+D%22%5BJournal%5D)">Clustering procedures for the optimal selection of data sets from multiple crystals in macromolecular crystallography.</a> Acta Cryst D. 69 (8), 1617-1632 (2013).</li>
<li>Rey, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virology%3A+holed+up+in+a+natural+crystal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Virology: holed up in a natural crystal.</a> Nature. 446 (7131), 35-37 (2007).</li>
<li>Schönherr, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+investigation+of+dynamic+protein+crystallization+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Struct+Dyn%22%5BJournal%5D)">Real-time investigation of dynamic protein crystallization in living cells.</a> Struct Dyn. 2 (4), 041712(2015).</li>
<li>Hasegawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+crystallization+of+human+IgG+in+the+endoplasmic+reticulum+of+engineered+Chinese+hamster+ovary+%28CHO%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">In vivo crystallization of human IgG in the endoplasmic reticulum of engineered Chinese hamster ovary (CHO) cells.</a> J Biol Chem. 286 (22), 19917-19931 (2011).</li>
<li>Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+Delivery+of+Protein+Microcrystals+in+Lipidic+Cubic+Phase+for+Serial+Femtosecond+Crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography.</a> J Vis Exp. (115), e54463(2016).</li>
<li>Zander, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MeshAndCollect%3A+an+automated+multi-crystal+data-collection+workflow+for+synchrotron+macromolecular+crystallography+beamlines%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst.+D%22%5BJournal%5D)">MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines.</a> Acta Cryst. D. 71, 2328-2343 (2015).</li>
<li>Fan, G. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+calcineurin+crystals+formed+using+the+baculovirus+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Micros+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">In vivo calcineurin crystals formed using the baculovirus expression system.</a> Micros Res Tech. 34 (1), 77-86 (1996).</li>
<li>Nass, K. <a target="_blank" href="NULL">Investigation of protein structure determination using X-ray free-electron lasers</a>. , Hamburg University. PhD dissertation (2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este protocolo fornece duas abordagens para analisar os microcristais com o objetivo de facilitar a análise de cristais muito pequenos que teriam sido ignorados no passado. Passos críticos para a purificação de microcristal O protocolo apresentado foi otimizado usando o poliedrino Bombyx mori CPV1 expresso em células Sf9 como um modelo de sistema. No entanto, os microcristais in vivo apresentam uma grande variabilidade na resistência mecânica. Por ex...

O uso de cristalografia de raios-X para a determinação de estruturas de alta resolução de macromoléculas biológicas experimentou uma progressão constante ao longo das duas últimas décadas. A crescente aceitação da cristalografia de raios-X por pesquisadores não especializados exemplifica a democratização desta abordagem em muitos campos das ciências da vida 1 . Historicamente, os cristais com dimensões abaixo de ~ 10 μm foram considerados desafiadores, se não inutilizáveis, para a determinação da estrutura. A crescente disponibilidade de linhas de feixe de microfoco dedicadas em fontes de radiação sincrotrona em todo o mundo e os avanços tecnológicos, como o desenvolvimento de ferramentas para manipular microcristas, eliminaram grande parte dessas barreiras que bloquearam o amplo uso da microcristalografia de raios-X. Avanços em microcristalografia serial em raios-X 2 , 3 e difração micro-eletrônica 4 haMostramos que o uso de micro e nanocristais para a determinação da estrutura não é apenas viável, mas também às vezes preferível ao uso de cristais grandes 5 , 6 , 7 . Estes avanços foram primeiro aplicados ao estudo de péptidos 8 e cristais naturais produzidos por vírus de insetos 9 , 10 . Eles são agora utilizados para uma variedade diversificada de macromoléculas biológicas, incluindo os sistemas mais difíceis, como proteínas de membrana e grandes complexos 11 . Para facilitar a análise desses microcristais, eles foram analisados em meso , particularmente proteínas de membrana 12 e em chips de microfluídica 13 . A disponibilidade dessas novas metodologias de microcristalografia aumentou a possibilidade de usar emCristalização in vivo como uma nova rota para biologia estrutural 14 , 15 , 16 oferecendo uma alternativa à cristalogênese clássica in vitro . Infelizmente, mesmo quando os cristais in vivo podem ser produzidos, vários obstáculos permanecem como a degradação ou perda de ligandos durante a purificação das células, a dificuldade na manipulação e visualização dos cristais na linha do sincrotrão e as tediosas experiências de difracção de raios X. Como os cristais alternativos também foram analisados ​​diretamente dentro da célula sem qualquer passo de purificação 17 , 18 , 19 . Uma análise comparativa sugere que tal em abordagens de celulo pode ser mais eficiente do que a análise de cristais purificados e produzir dados de maior resolução 20 . Este protocolo está emTendeu a auxiliar pesquisadores novos na microcristalografia protéica. Ele fornece metodologias com foco na preparação e manipulação de amostras para experiências de difracção de raios X em uma linha de luz de sincrotrona. Duas opções são propostas usando cristais isolados para microcristalografia clássica ou células contendo cristais classificadas por citometria de fluxo para análise celular ( Figura 1 ).

<table><tbody><tr><td>Células Sf9</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SF900-SFM meio de cultura de células</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 L frasco de cultura de células</td><td>Thermofisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de agitação para cultura de células de insetos</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tubos cônicos de 50 mL</td><td>Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge com baldes giratórios para 50 mL tubos</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonicator equipado com uma sonda de 19 mm</td><td>MSE Soniprep 150&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de vidro</td><td>Hemacitômetro Hampton Research</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iodeto de propídio</td><td>Thermofisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Influx classificador de células&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hampton Heavy atom screens Hampton</td><td>Research</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromesh</td><td>Mitigen</td><td></td><td>700/25 malhas oferecem uma superfície maior. Malhas indexadas podem ser adquiridas para estudos sistemáticos.</td></tr><tr><td>Pavio de papel</td><td>Mitigen</td><td></td><td>O tamanho do pavio de papel pode ser variado para um fluxo ideal. Isso dependerá em grande parte da natureza dos cristais e do crioprotetor usado.</td></tr><tr><td>Etilenoglicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MX2 linha de luz microfoco</td><td>Síncrotron</td><td></td> australiano <td>Uma lista de linhas de luz microfoco disponíveis pode ser encontrada em Boudes et al. (2014) Reflexões sobre as muitas facetas da microcristalografia de proteínas . Australian Journal of Chemistry 67 (12), 1793&ndash; 1806, doi:10.1071/CH14455.</td></tr></tbody></table>

microcristalografia de cristais de proteína e<em&gt; em cellulo</em&gt; difração

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

O advento de linhas de luz de microfoco de alta qualidade em muitas instalações de sincrotrona permitiu a análise de rotina de cristais menores que 10 μm em sua maior dimensão, o que representava um desafio. Apresentamos dois fluxos de trabalho alternativos para a determinação da estrutura de microcristais de proteínas por cristalografia de raios X com foco particular em cristais crescidos in vivo . Os microcristais são extraídos de células por sonicação e purificados por centrifugação diferencial, ou analisados em celulo após classificação celular por citometria de fluxo de células que contêm cristais. Opcionalmente, os cristais purificados ou as células que contêm cristais são embebidos em soluções de átomos pesados ​​para a fase experimental. Essas amostras são então preparadas para experiências de difracção de maneira similar por aplicação em um suporte micromesh e refrigeração instantânea em nitrogênio líquido. Nós descrevemos e comparamos brevemente experiências de difracção em série de microcristais isolados e cristal-Contendo células usando uma linha de luz de sincrotron microfocus para produzir conjuntos de dados adequados para faseamento, modelagem e refinamento. Esses fluxos de trabalho são exemplificados com cristais do poliedro Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1) produzido por infecção de células de insetos com um baculovírus recombinante. Neste estudo de caso, a análise do cellulo é mais eficiente do que a análise de cristais purificados e produz uma estrutura em ~ 8 dias da expressão ao refinamento.

Uma visão geral de ambos os métodos alternativos para a determinação da estrutura utilizando microcristais in vivo é apresentada ( Figura 1 ). Os poliedros podem ser facilmente purificados por sonicação e centrifugação. Devido à sua densidade, eles formam uma camada na parte inferior do tubo por baixo de uma camada de detritos que podem ser removidos por pipetagem ( Figura 3a e 3b ). A amostra é então s...

Um protocolo é apresentado para cristalografia de raios X usando microcristais de proteína. São comparados dois exemplos de análise de microcristos criados em vivo após purificação ou em celulósio .

Microcristalografia de Cristais de Proteína e<em&gt; Em Cellulo</em&gt; Difração

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in ...

O objetivo geral deste protocolo é apresentar metodologias de cristalografia por raios X aplicadas a microcristais, especialmente àqueles produzidos em células, considerados cristais in vivo. A principal vantagem dessa abordagem é que ela fornece um processo simples e eficiente para produzir, detectar e analisar microcristais. Este método visa facilitar o uso de microcristais por meio de cristais cultivados no interior de células vivas, eliminando a necessidade de processos complexos de purificação e ensaios com sedação por Aprocox.Neste vídeo, vamos nos concentrar na preparação e manipulação simples para experimentos de desvio de raios X em uma linha de luz de sincrotrão. Mostraremos os passos que mais diferem da cristalografia clássica. Nesta demonstração, usaremos cristais da proteína poliedro vital cultivados com sucesso, mas o método também pode ser aplicado a proteínas que formam cristais em células bacterianas, de insetos, mamíferas ou leveduras.Primeiro, incube 30 mililitros de células Sf9 superexpressando a proteína poliedral do cipovírus por três dias a 27 graus Celsius em uma plataforma rotativa. Transfira 500 microlitros de cultura de células Sf9 para um tubo de microce

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Avaliação bidimensional ensaios (2D) de cristalização para a formação de matrizes de proteína de membrana ordenado é uma tarefa altamente crítico e difícil em cristalografia de elétrons. Aqui, descrevemos a nossa abordagem na triagem para identificação de cristais e 2D de proteínas da membrana predominantemente de pequena faixa de 15 - 90 kDa.

Avaliar Trials bidimensional cristalização de proteínas da membrana Pequenas de Estudos Biologia Estrutural por Cristalografia Electron

Este artigo descreve a metodologia de microscopia crioeletrônica, que é usada para obter imagens microscópicas de alta qualidade de macromoléculas em seu estado quase nativo. O método produz imagens adequadas para processamento computadorizado adicional usando a abordagem de partícula única, concebida para gerar a reconstrução 3D de uma macromolécula.

Fazer e não fazer de Microscopia Cryo-elétron: uma cartilha sobre Preparação de Amostras e coleta de dados de alta qualidade para a Reconstrução Macromolecular 3D

Este protocolo descreve em detalhes como fabricar e operar dispositivos microfluídicos para coleta de dados de difração de raios x em temperatura ambiente. Além disso, descreve como monitorar a cristalização de proteínas por difusão dinâmica da luz e como processar e analisar obtidos dados de difração.

Chips microfluídicos por difração de raio x de cristal In Situ e In Situ Difusão dinâmica da luz de cristalografia de Serial

Este artigo detalha o protocolo de fabricação de chips microfluidos desenvolvidos para cristalização de proteínas on-chip com o método de diálise e experimentos de difração de raios-X in situ. O processo de microfabização permite integrar uma membrana de diálise regenerada de celulose regenese semipermável com qualquer corte de peso molecular, entre duas camadas do chip.

Cristalização de proteínas no chip por microdiálise para estudos de difração de raios-X in situ

Aqui, descrevemos os procedimentos desenvolvidos em nosso laboratório para a preparação de pós de cristais de pequenas moléculas para experimentos de difração eletrônica de microcristais (MicroED).

Difração de Elétrons Microcristal de Pequenas Moléculas

A determinação da estrutura dos complexos macromoleculares utilizando o crioEM tornou-se rotina para certas classes de proteínas e complexos. Aqui, este pipeline é resumido (preparação de amostras, triagem, aquisição e processamento de dados) e os leitores são direcionados para recursos e variáveis mais detalhados que podem ser alterados no caso de espécimes mais desafiadores.

Microscopia crio-elétron de partículas únicas: da amostra à estrutura

Monocamadas lipídicas têm sido usadas como base para a formação de cristais proteicos bidimensionais (2D) para estudos estruturais por décadas. Eles são estáveis na interface ar-água e podem servir como um material de suporte fino para imagens eletrônicas. Aqui apresentamos os passos comprovados na preparação de monocamadas lipídicas para estudos biológicos.

Preparação da amostra usando um método de monocamadas lipídica para estudos cristalográficos eletrônicos

Esta contribuição descreve como configurar a cristalização de proteínas em dispositivos cristal sobre cristal e como executar a coleta automatizada de dados seriais à temperatura ambiente usando a plataforma de cristalização no chip.

Cristalização no chip e difração serial em larga escala à temperatura ambiente

Mapas crio-EM de alta resolução de macromoléculas também podem ser alcançados usando microscópios TEM de 200 kV. Este protocolo mostra as melhores práticas para definir alinhamentos ópticos precisos, esquemas de aquisição de dados e seleção de áreas de imagem que são essenciais para a coleta bem-sucedida de conjuntos de dados de alta resolução usando um TEM de 200 kV.

Coleta rotineira de conjuntos de dados crio-EM de alta resolução usando microscópio eletrônico de transmissão de 200 KV

O protocolo apresentado descreve uma abordagem direta para triagem de condições de cristalização de proteínas e crescimento de cristais usando uma placa de diálise de alto rendimento de 96 poços. O uso de tubos dialisadores para o crescimento em larga escala de microcristais também é demonstrado para aplicações de cristalografia seriada e MicroDE.

Cristalização de proteínas de alto rendimento via microdiálise

Aprenda cristalografia de raios X para microcristais de proteínas produzidos em células vivas, eliminando purificações complexas. Este método simplifica a análise estrutural em fontes síncrotron.

Microcristalografia de Cristais de Proteína e

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