Microcristalografia de Cristais de Proteína e
21 de julho de 2017
Um protocolo é apresentado para cristalografia de raios X usando microcristais de proteína. São comparados dois exemplos de análise de microcristos criados em vivo após purificação ou em celulósio .
O objetivo geral deste protocolo é apresentar metodologias de cristalografia por raios X aplicadas a microcristais, especialmente àqueles produzidos em células, considerados cristais in vivo. A principal vantagem dessa abordagem é que ela fornece um processo simples e eficiente para produzir, detectar e analisar microcristais. Este método visa facilitar o uso de microcristais por meio de cristais cultivados no interior de células vivas, eliminando a necessidade de processos complexos de purificação e ensaios com sedação por Aprocox.
Neste vídeo, vamos nos concentrar na preparação e manipulação simples para experimentos de desvio de raios X em uma linha de luz de sincrotrão. Mostraremos os passos que mais diferem da cristalografia clássica. Nesta demonstração, usaremos cristais da proteína poliedro vital cultivados com sucesso, mas o método também pode ser aplicado a proteínas que formam cristais em células bacterianas, de insetos, mamíferas ou leveduras.
Primeiro, incube 30 mililitros de células Sf9 superexpressando a proteína poliedral do cipovírus por três dias a 27 graus Celsius em uma plataforma rotativa. Transfira 500 microlitros de cultura de células Sf9 para um tubo de microcentrífuga utilizando uma pipeta serológica estéril, tomando cuidado para garantir que a esterilidade da cultura principal seja mantida mediante o uso de uma cabine de segurança biológica classe II e seguindo técnicas assépticas padrão. Pipete cinco microlitros de células do tubo de microcentrífuga sobre uma lâmina de vidro.
Em seguida, incline suavemente uma lamínula de vidro sobre a amostra com uma borda tocando a gota e abaixe cuidadosamente a lamínula sobre o líquido, evitando a formação de bolhas de ar. Depois, visualize a lâmina com um microscópio invertido. Examine cuidadosamente as células, iniciando com aumento de 200x e aumentando ao máximo o zoom ao detectar um cristal potencial.
Procure por bordas nítidas e alterações na refratividade. Se cristais forem identificados, examine o cultivo diariamente para monitorar o crescimento dos cristais, repetindo os passos anteriores. Para células Sf9, colha transferindo o cultivo para um tubo de centrífuga.
Coloque o tubo no gelo e prossiga para o próximo passo o mais rápido possível. Para o isolamento de células contendo cristais, pipete quatro mililitros de células Sf9 infectadas em um tubo adaptado para análise por citometria de fluxo. Prepare um segundo tubo com um número equivalente de células Sf9 de uma cultura controle não infectada como controle.
Em seguida, adicione iodeto de propídio a ambas as amostras até uma concentração final de um micrograma por mililitro, imediatamente antes da avaliação por citometria de fluxo. Agora, aplique as células da amostra controle a um citômetro de fluxo padrão capaz de separar células de acordo com FSC e SSC. Analise pelo menos 20.000 eventos.
Após descartar células mortas, agregados celulares e detritos da análise, gere o gráfico de FSC versus SSC. Em seguida, analise pelo menos 20.000 eventos da amostra contendo cristais. Compare o gráfico de FSC versus SSC com o controle e observe o surgimento de uma população distinta correspondente às células contendo cristais.
Defina as portas ao redor da população de células contendo cristais, que geralmente aparece com valores mais altos de SSC ou FSC. Usando esse direcionamento, separe cerca de 150.000 a 200.000 células contendo cristais em um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro previamente preenchido com 50 microlitros de tampão PBS. Imagem as amostras separadas por microscopia de luz conforme descrito anteriormente para confirmar qual população está associada às células contendo cristais.
Nesta etapa, as células podem estar em incubação com soluções de átomos pesados, caso seja necessária a determinação de fases experimentais. Esta abordagem segue a triagem de diversos compostos e tempos de incubação conforme descrito no texto e em outras revisões. Prepare as ferramentas para montagem da amostra fixando primeiro uma micromalha montada em um pino à extremidade de uma haste magnética.
Coloque a haste na horizontal na fenda de uma boia de diálise. Em seguida, pegue uma mecha de papel com um par de pinças e fixe-as. Verifique novamente se a montagem está completa antes de prosseguir.
Agora, misture as células com um volume igual de solução de azul de tripano 0,4% para obter uma concentração final de 0,2%. Após ressuspender as células, pipete 0,5 microlitros das células classificadas sobre a malha micro. Depois de permitir que as células se depositem na superfície da malha micro, remova a maior parte do líquido em excesso por meio de absorção com uma mecha de papel. Se a malha micro não for suficientemente seca, as células estarão em profundidades diferentes dentro do líquido em excesso, o que complicará seu alinhamento com o feixe de raios X no sincrotrão.
Além disso, o excesso de líquido aumentará o espalhamento de raios X de fundo. Se a malha micro for pressionada em excesso, o líquido será completamente removido e a amostra não permanecerá nas aberturas da grade. Com um tempo ideal de pressão, apenas uma fina camada de líquido permanece na malha micro, protegendo a amostra e forçando-a para dentro das aberturas da grade.
Alguns cristais exigirão o uso de um crioprotetor. Isso não é necessário no nosso caso, mas o procedimento seria o mesmo que para a aplicação da amostra e, em seguida, a remoção com papel absorvente. Certifique-se de que apenas uma fina camada de líquido permaneça.
Resfrie imediatamente a malha micro em nitrogênio líquido e transfira-a para um puck robótico para transporte até uma linha de feixe microfoco de sincrotrão. Devido ao tamanho pequeno dos cristais in vivo, colete os dados de fração em uma linha de feixe de cristalografia microfoco. Primeiro, monte a malha micro no goniômetro.
Agora, comece centralizando a malha microscópica com o trajeto do feixe utilizando as orientações frontal e lateral. Com a malha microscópica voltada para frente, ajuste finamente o alinhamento alinhando o centro de uma das faixas horizontais da malha microscópica. Colete dados ao longo desta faixa horizontal com apenas pequenos reajustes no alinhamento.
Após testar todos os cristais da fileira, prossiga para a próxima fileira e repita o procedimento de alinhamento. Certifique-se de que as fileiras já processadas sejam claramente identificadas para que nenhum cristal seja ignorado ou irradiado duas vezes, utilizando a mudança de cor do azul de tripano como orientação. É apresentada uma visão geral de dois métodos para determinação de estrutura utilizando microcristais in vivo.
A linha superior descreve a abordagem clássica que envolve a purificação de cristais a partir de células, enquanto a linha inferior mostra a abordagem de cristalografia in cellulo, que mantém os cristais nas células hospedeiras para a coleta de dados. Para a abordagem in cellulo, o perfil de citometria de fluxo de células não infectadas é comparado com o perfil de células contendo cristais e utilizado para determinar qual população celular deve ser selecionada para separar as células contendo cristais das demais células. Neste exemplo, as células contendo poliedros apresentam um espalhamento lateral mais alto do que as células não infectadas.
Células coradas com azul de tripano podem ser facilmente visualizadas usando câmeras disponíveis na maioria das linhas de luz de sincrotrons. Embora cristais purificados sejam trabalhosos para identificar e alinhar com o feixe de raios X devido ao seu tamanho reduzido, ao coletar dados é melhor prosseguir em um padrão de grade, a fim de minimizar os procedimentos de centralização e evitar expor a mesma célula ou cristal mais de uma vez ou deixar de analisar células e cristais. Uma vez dominado, esse fluxo leva cerca de meio dia, desde a colheita das células contendo cristais até a coleta de dados.
Este procedimento é compatível com imersões em átomos pesados para determinação experimental de fases. No caso do poliedro, a estrutura normal foi obtida em oito dias a partir do início da expressão proteica. Não se esqueça de que trabalhar com nitrogênio líquido pode ser extremamente perigoso e que precauções contra asfixia e queimaduras devem ser tomadas.
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Visão Geral
Este protocolo apresenta metodologias de cristalografia por raios X aplicadas a microcristais, especialmente aqueles produzidos em células vivas. O método simplifica a produção e análise de microcristais, eliminando processos complexos de purificação.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Cristalografia por raios X
- Microcristais de proteínas
- Biologia celular
Contexto
- Microcristais podem ser cultivados em células vivas, denominados cristais in vivo.
- Essa abordagem oferece um método direto para a produção e análise de cristais.
- Os processos tradicionais de purificação podem ser trabalhosos e demorados.
- O protocolo tem como objetivo aumentar o acesso às técnicas de cristalografia de raios X.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar técnicas de cristalografia por raios X para microcristais.
- Destacar as vantagens do uso de cristais cultivados in vivo.
- Fornecer um protocolo claro para pesquisadores da área.
Métodos Utilizados
- Preparação de microcristais a partir de proteínas cultivadas em células vivas.
- Manipulação de cristais para experimentos de difração de raios X.
- Utilização de linhas de feixe de sincrotrons para análise.
- Comparação de microcristais cultivados in vivo e in cellulo.
Resultados Principais
- Demonstração bem-sucedida da cristalografia de raios X com microcristais.
- Ilustração das diferenças em relação aos métodos clássicos de cristalografia.
- Aplicação do método a diversos tipos de proteínas.
- Facilitação do acesso mais fácil às técnicas de cristalografia para pesquisadores.
Conclusões
- O protocolo oferece uma abordagem simplificada para a cristalografia de raios X.
- Microcristais cultivados in vivo apresentam vantagens significativas.
- Este método pode ser adaptado para diversos sistemas biológicos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A microcristalografia de cristais proteicos cultivados em células vivas permite a análise estrutural direta sem purificação extensiva, reduzindo o tempo e o investimento de recursos na validação inicial de alvos. Esta abordagem auxilia na redução de riscos mecanicistas ao fornecer dados estruturais de alta confiança obtidos a partir de ambientes celulares nativos, contribuindo para a identificação de compostos líderes e maior confiança preditiva nos processos de descoberta de fármacos. O método é particularmente relevante para proteínas difíceis de cristalizar convencionalmente, oferecendo um caminho para obter informações estruturais sobre alvos desafiadores.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a caracterização estrutural de alvos proteicos em seu contexto celular nativo, reduzindo ambiguidades mecanicistas.
- Valor Operacional: Elimina etapas complexas de purificação, acelerando os prazos de validação de alvos.
- Valor Preditivo: Fornece dados estruturais de alta resolução para apoiar testes de hipóteses e redução de riscos em alvos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Produz microcristais de qualidade para difração, adequados para triagem de fragmentos e análise de sítios de ligação.
- Valor Operacional: Padroniza a preparação de amostras por meio de triagem por citometria de fluxo e montagem em micromalha para coleta reprodutível de dados em sincrotron.
- Escalabilidade: Permite o processamento paralelo de células contendo cristais para triagem estrutural de alto rendimento.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Apoia a validação estrutural de alvos em sistemas relevantes para doenças, como células de insetos expressando poliedrina viral.
- Continuidade Tradutiva: Conecta dados estruturais da fase de descoberta com a validação pré-clínica de alvos por meio de informações moleculares consistentes.
- Mitigação de Riscos: Reduz o risco de falhas ao confirmar a estrutura do alvo e o potencial de ligação de ligantes precocemente na fase de desenvolvimento.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra ao fluxo de trabalho de descoberta como uma ferramenta de biologia estrutural que sucede a expressão do alvo e antecede a otimização do fármaco inicial, fornecendo insights em nível atômico para a progressão de acertos para fármacos iniciais.
- Biologia da Descoberta: Facilita a validação de alvos ao permitir a observação direta da estrutura proteica e dos estados conformacionais in vivo.
- Triagem: Gera microcristais com estrutura validada, passíveis de uso em campanhas de triagem que exigem dados de ligação em resolução atômica.
- Análises: Fornece mapas de densidade eletrônica e modelos refinados que permitem a avaliação quantitativa da ligação de ligantes e da dinâmica proteica.
- Pesquisa Translacional: Garante a continuidade estrutural desde a expressão celular até modelos pré-clínicos, ao validar a integridade do alvo.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma plataforma reutilizável para análise estrutural de alvos de difícil cristalização em múltiplos projetos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Estrutura de alvo de alta confiança obtida de ambientes celulares nativos aprimora a modelagem preditiva.
- Valor Operacional: Fluxo de trabalho simplificado, desde o cultivo celular até a coleta de dados, reduz o tempo de manipulação e a variabilidade técnica.
- Valor Estratégico: Acelera decisões de avançar ou não ao fornecer validação estrutural precoce de alvos.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base na viabilidade estrutural e na farmacologicidade.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cultura celular, microscopia de fluorescência e citometria de fluxo para classificação de células contendo cristais.
- Depende do acesso a linhas de feixe de sincrotrão com microfoco e infraestrutura para manipulação de amostras criogênicas.
- Necessita padronização da preparação de amostras entre equipes para garantir a reprodutibilidade dos dados de difração.
- A adaptação entre sistemas modelo pode exigir otimização das condições de imersão em átomos pesados e de crioprotetores.
- As limitações práticas incluem restrições de tamanho dos cristais e dispersão de fundo provocada pelo material celular, o que exige cuidadosa remoção de líquido e alinhamento do feixe.
