Pré-condicionamento hipóxico de células progenitoras derivadas da medula como fonte para a geração de células maduras de Schwann

O objetivo geral desta técnica de cultura de células é enriquecer os progenitores neurais da medula óssea para facilitar sua diferenciação em células de Schwann funcionais. Este método aborda uma questão-chave nas células-tronco e na medicina regenerativa: como usar uma fonte limitada de neuroprogenitores para gerar glia para auxiliar no crescimento axonal pós-traumático e remielinização. Uma vantagem dessa técnica é o uso de condicionamento de cultura eficiente para facilitar a expansão das células neurais das células estromais da medula óssea para seu uso em terapia celular autóloga.

Após dois dias de cultura, remover 75% do meio gasto e das células não aderentes e enxaguar as células aderentes com três lavagens de PBS de 10 milímetros. Após a terceira lavagem, substitua o PBS por 10 mililitros de meio de crescimento de células estomais da medula, ou MSC, e retorne a cultura à incubadora. As colônias visíveis devem aparecer no sexto ao sétimo dia.

No dia 10, lave a cultura em PBS fresco e separe as células com 1,5 mililitros de reagente de dissociação celular enzimática recombinante. Após cinco minutos a 37 graus Celsius, adicione três mililitros de meio de crescimento MSC para neutralizar a reação e coletar as células destacadas por centrifugação. Ressuspenda o pellet em cinco mililitros de meio de crescimento MSC fresco e semeie as células em uma densidade de quatro vezes 10 a quatro células por centímetro quadrado em uma nova placa de cultura de tecidos de 10 centímetros.

As células devem atingir 80 a 90% de confluência dentro de dois dias após a passagem. Para pré-condicionamento hipóxico, primeiro solte o grampo do anel e limpe as partes expostas com etanol 70%. Desmonte ainda mais a câmara de hipóxia em componentes e coloque-os em uma capela de fluxo laminar para esterilização sob luz ultravioleta por 15 minutos.

Em seguida, lave uma cultura de MSC 80 a 90% confluente com 10 mililitros de PBS, como acabamos de demonstrar, e trate as culturas com meio de crescimento MSC fresco suplementado com hepes 25 milimolares. Coloque a cultura tratada na câmara de hipóxia remontada e aperte o anel clamp. Sele as extremidades de conexão da câmara para garantir que não haja vazamento de gás e lave uma mistura de gás de 99% de nitrogênio e 1% de oxigênio na câmara a uma taxa de fluxo de 10 litros por minuto.

Após cinco minutos, colocar a câmara na incubadora de cultura de células durante 16 horas. Na manhã seguinte, retire as células como acabamos de demonstrar e colete-as por centrifugação. Ressuspenda o pellet em meio progenitor neural e semeie seis vezes 10 até o terço das células por centímetro quadrado em placas de 6 poços de baixa fixação para sua cultura a 37 graus Celsius e 5% de CO2 por 12 dias.

Esferas de células não aderentes consideráveis devem ser observadas no sexto ao sétimo dia. Com mais neuroesferas aparentes em culturas condicionadas por hipóxia do que aquelas sob normóxia nos dias 10 a 12. No dia 12, use uma pipeta de 10 mililitros para transferir as neuroesferas para um tubo cônico de 15 mililitros e colete as neuroesferas por centrifugação.

Ressuspenda as esferas em DMEM / F12 e coloque de cinco a 10 neuroesferas por centímetro quadrado em placas de 6 poços revestidas com lamina de poli-D-lisina em 1,5 mililitros de meio de indução glial por poço. Manter a cultura de células esféricas durante, pelo menos, sete dias, refrescando o meio de três em três dias. Para colher os gânglios da raiz dorsal, transfira o primeiro embrião para uma placa de cultura de 10 centímetros contendo PBS em temperatura ambiente sob um microscópio de dissecação em decúbito ventral e insira uma pinça de microdissecação ao longo de ambos os lados da medula espinhal.

Usando dissecção romba, separe a medula espinhal do tecido mole circundante usando uma pinça para extirpar a medula espinhal ao longo da abertura do pescoço e do toco da cauda. Remova o tecido mole residual da medula espinhal liberada até que apenas a medula espinhal, as raízes nervosas e o gânglio da raiz dorsal anexados permaneçam. Separe os gânglios da raiz dorsal individuais de suas raízes nervosas de conexão.

Em seguida, use uma caneta de pipeta equipada com uma ponta de pipeta de um mililitro para transferir até 100 gânglios da raiz dorsal para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros de PBS. Colete os gânglios por centrifugação e ressuspenda os pellets em 200 microlitros de reagente de dissociação enzimática recombinante por tubo. Após 10 minutos a 37 graus Celsius, centrifugue os gânglios da raiz dorsal novamente usando uma ponta de pipeta de 200 microlitros para triturar suavemente os pellets no meio de manutenção do neurônio do gânglio da raiz dorsal.

Semeie as células do gânglio da raiz dorsal em cinco vezes 10 até o terço das células por centímetro quadrado em placas de 6 poços revestidas com lamina de poli-D-lisina em 1,5 mililitros de meio de manutenção do neurônio do gânglio da raiz dorsal por poço. Após dois dias em cultura a 37 graus Celsius e 5% de CO2, lave as células e retorne as culturas de células neuronais à incubadora em meio fresco de purificação de neurônios do gânglio da raiz dorsal por mais dois dias. Após três a quatro ciclos de manutenção e purificação, as culturas de células do gânglio da raiz dorsal devem ser positivas para o marcador neuronal Tuj-1 e negativas para o marcador de células gliais S100 beta.

No sétimo dia da cultura de células semelhantes a células de Schwann, enxágue as células em PBS seguido de dissociação com 0,5 mililitros de reagente de dissociação celular enzimática recombinante por poço a 37 graus Celsius por cinco minutos. Ressuspenda o pellet celular em meio de co-cultura e semeie as células semelhantes a células de Schwann na cultura purificada de neurônios do gânglio da raiz dorsal de uma vez 10 a terceiras células por centímetro quadrado por 14 dias de co-cultura a 37 graus Celsius e 5% de CO2. As MSCs saudáveis exibem uma morfologia cônica em contraste com a aparência quadrangular das MSCs que foram mantidas por um grande número de passagens e perderam sua multipotência.

As colônias expandidas de MSC devem demonstrar a expressão de marcadores de MSC, a ausência de marcadores de células-tronco hematopoiéticas e a capacidade de diferenciação em linhagens adipogênicas, osteogênicas e condrogênicas. A cultura de MSC saudável que foi submetida a pré-condicionamento hipóxico demonstra neuroesferas maiores em número e tamanho. A pureza da rede de neurônios do gânglio da raiz dorsal pode ser confirmada pela expressão do marcador neuronal Tuj-1 e pela ausência concomitante do marcador de células de Schwann S100.

Após 14 dias em co-cultura com neurônios do gânglio da raiz dorsal, as células semelhantes a células de Schwann adquirem as características e propriedades funcionais das células de Schwann maduras comprometidas com o destino. Uma vez dominada, a subpopulação de progenitores neurais pode ser expandida em BMSCs humanos ou de ratos em 10 dias se a técnica de expansão celular for realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de confirmar que a amostra de BMSC é dotada de neuroprogenitores nestin-positivos e os progenitores hematopoiéticos CD45 positivos foram todos removidos.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como obter BMSCs, enriquecer para a subpopulação de progenitores neurais e direcionar a diferenciação de progenitores neurais em células de Schwann comprometidas com o destino para uso no aprimoramento do crescimento axonal pós-traumático e remielinização. Após este procedimento, a glia mielinizante, como as células maduras de Schwann, pode ser derivada para seu uso no desenvolvimento de terapias para lesões e doenças desmielinizantes do sistema nervoso periférico e central.