Pré-condicionamento hipóxico de células progenitoras derivadas da medula como fonte para a geração de células maduras de Schwann

O objetivo geral dessa técnica de cultura celular é enriquecer progenitores neurais da medula óssea para facilitar sua diferenciação em células de Schwann funcionais. Este método aborda um problema fundamental na medicina regenerativa e em células-tronco: como usar uma fonte limitada de neuroprogenitores para gerar gliócitos que auxiliem no crescimento axonal pós-traumático e na remielinização. Uma vantagem dessa técnica é o uso de condicionamento eficiente da cultura para facilitar a expansão de células neurais a partir de células estromais da medula óssea, visando seu emprego em terapia celular autóloga.

Após dois dias em cultura, remova 75% do meio usado e as células não aderentes e lave as células aderentes com três lavagens de PBS 10 milimolar. Após a terceira lavagem, substitua o PBS por 10 mililitros de meio de crescimento para células estromais da medula, ou células ME, e retorne a cultura para a estufa. Colônias visíveis devem aparecer entre o sexto e o sétimo dia.

No dia 10, lave a cultura com PBS fresco e desprenda as células com 1,5 mililitro de reagente recombinante enzimático para dissociação celular. Após cinco minutos a 37 graus Celsius, adicione três mililitros de meio de crescimento para MSC para neutralizar a reação e recolha as células destacadas por centrifugação. Resuspenda o pellet em cinco mililitros de meio de crescimento fresco para MSC e semeie as células numa densidade de quatro vezes 10 à quarta células por centímetro quadrado em uma nova placa de cultura tecidual de 10 centímetros.

As células devem atingir 80 a 90% de confluência dentro de dois dias após a repicagem. Para o pré-condicionamento hipóxico, primeiro solte o grampo do anel e limpe as partes expostas com etanol a 70%. Em seguida, desmonte ainda mais a câmara de hipóxia em componentes e coloque-os em uma cabine de fluxo laminar para esterilização sob luz UV por 15 minutos.

Em seguida, lave uma cultura de MSC com 80 a 90% de confluência com 10 mililitros de PBS, conforme acabou de ser demonstrado, e trate as culturas com meio de crescimento para MSC fresco suplementado com 25 milimolar de HEPES. Coloque a cultura tratada na câmara de hipóxia remontada e aperte o grampo anelar. Selle as extremidades de conexão da câmara para garantir que não haja vazamento de gás e borbulhe uma mistura gasosa de 99% de nitrogênio e 1% de oxigênio na câmara a uma taxa de fluxo de 10 litros por minuto.

Após cinco minutos, coloque a câmara no incubador de cultivo celular por 16 horas. Na manhã seguinte, desprenda as células conforme demonstrado e colete-as por centrifugação. Re-suspenda o pellet no meio de progenitores neurais e semeie seis vezes 10 à terceira células por centímetro quadrado em placas de 6 poços com baixa adesão para seu cultivo a 37 graus Celsius e 5%CO2 por 12 dias.

Esferas celulares não aderentes de tamanho considerável devem ser observadas no sexto ao sétimo dia. Com mais neuroesferas aparentes em culturas condicionadas à hipóxia do que naquelas sob normóxia entre os dias 10 e 12. No dia 12, utilize uma pipeta de 10 mililitros para transferir as neuroesferas para um tubo cônico de 15 mililitros e colete as neuroesferas por centrifugação.

Resuspenda as esferas em DMEM/F12 e plaque de cinco a dez neuroesferas por centímetro quadrado em placas de 6 poços revestidas com poli-D-lisina e laminina, adicionando 1,5 mililitro de meio de indução glial por poço. Mantenha a cultura de esferas por pelo menos sete dias, renovando o meio a cada três dias. Para coletar os gânglios da raiz dorsal, transfira o primeiro embrião para uma placa de cultura de 10 centímetros contendo PBS à temperatura ambiente sob um microscópio estereoscópico, posicionado em decúbito ventral, e insira pinças de dissecação microcirúrgicas em ambos os lados da medula espinhal.

Usando dissecação romba, separe a medula espinhal dos tecidos moles circundantes com pinça para excisar a medula espinhal ao longo da abertura do pescoço e do coto da cauda. Remova o tecido mole residual da medula espinhal liberada até que apenas a medula espinhal, as raízes nervosas e os gânglios da raiz dorsal anexos permaneçam. Desconecte os gânglios individuais da raiz dorsal de suas raízes nervosas conectantes.

Em seguida, utilize um pipetador equipado com uma ponteira de pipeta de um mililitro para transferir até 100 gânglios da raiz dorsal para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro contendo PBS. Colete os gânglios por centrifugação e ressuspenda os pellets em 200 microlitros de reagente recombinante enzimático para dissociação celular por tubo. Após 10 minutos a 37 graus Celsius, centrifugue novamente os gânglios da raiz dorsal utilizando uma ponteira de pipeta de 200 microlitros para triturar suavemente os pellets em meio de manutenção para neurônios de gânglio da raiz dorsal.

Semeie as células do gânglio da raiz dorsal a cinco vezes 10 elevado ao terceiro por centímetro quadrado em placas de 6 poços revestidas com poli-D-lisina e laminina, utilizando 1,5 mililitro de meio de manutenção de neurônios do gânglio da raiz dorsal por poço. Após dois dias em cultura a 37 graus Celsius e 5% de CO₂, lave as células e retorne as culturas neuronais ao incubador em meio fresco de purificação de neurônios do gânglio da raiz dorsal por mais dois dias. Após três a quatro ciclos de manutenção e purificação, as culturas de células do gânglio da raiz dorsal devem apresentar resultado positivo para o marcador neuronal Tuj-1 e negativo para o marcador de células gliais S100 beta.

No sétimo dia do cultivo de células semelhantes a células de Schwann, lave as células com PBS seguido pela dissociação com 0,5 mililitros de reagente enzimático recombinante para dissociação celular por poço, a 37 graus Celsius por cinco minutos. Suspender o pellet celular em meio de cocultivo e semear as células semelhantes a células de Schwann sobre o cultivo purificado de neurônios de gânglio da raiz dorsal na proporção de um vezes 10 à terceira células por centímetro quadrado, por 14 dias de cocultivo a 37 graus Celsius e 5%CO2. MSCs saudáveis exibem uma morfologia afilada, em contraste com a aparência quadrangular das MSCs que foram mantidas por um alto número de passagens e perderam sua multipotência.

As colônias expandidas de CMM devem demonstrar a expressão de marcadores de CMM, a ausência de marcadores de células-tronco hematopoiéticas e a capacidade de diferenciação em linhagens adipogênicas, osteogênicas e condrogênicas. Culturas saudáveis de CMM submetidas à pré-condicionamento hipóxico demonstram neuroesferas maiores tanto em número quanto em tamanho. A pureza da rede de neurônios do gânglio da raiz dorsal pode ser confirmada pela expressão do marcador neuronal Tuj-1 e pela ausência concomitante do marcador de células de Schwann S100.

Após 14 dias em co-cultura com neurônios do gânglio da raiz dorsal, células semelhantes a células de Schwann adquirem as características e propriedades funcionais de células de Schwann maduras e comprometidas com o destino celular. Uma vez dominada, a subpopulação de progenitores neurais pode ser expandida em BMSCs humanos ou de rato em 10 dias, se a técnica de expansão celular for realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de confirmar que a amostra de BMSCs possui progenitores neurogênicos positivos para nestina e que todos os progenitores hematopoiéticos positivos para CD45 foram removidos.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como obter CSMOs, enriquecer a subpopulação de progenitores neurais e direcionar a diferenciação desses progenitores em células de Schwann comprometidas com o destino celular, para utilização no aumento do rebrotamento axonal pós-traumático e na remielinização. Após este procedimento, glias mielinizantes, como as células de Schwann maduras, podem ser obtidas para uso no desenvolvimento de terapias para lesões e doenças desmielinizantes do sistema nervoso periférico e central.