Seção de mamíferos mamários completos para identificação de lesões

O objetivo geral deste procedimento é criar seções coradas de alta qualidade de todo o tecido mamário de camundongo montado para identificação de lesões no nível microscópico. Este método pode ajudar a responder a questões-chave envolvendo a avaliação da glândula mamária, como a identificação histopatológica de tipos de lesões identificados macroscopicamente em montes inteiros mamários. A principal vantagem dessa técnica é que ela aumenta a chance de identificar lesões que possam existir dentro das glândulas mamárias ao usar tecidos inteiros montados.

Tivemos a ideia para este método pela primeira vez quando comparamos fenótipos de montagens inteiras com relatórios histopatológicos para formalina se encaixa em glândulas contralaterais coradas com H e E dos mesmos animais. Vimos uma discrepância nos diagnósticos, mais lesões foram evidentes em montagens inteiras. A demonstração visual desse método é importante, pois todas as etapas de remoção e incorporação da montagem são essenciais para o sucesso desse procedimento.

A glândula é delicada devido à sua natureza fina e friável. Depois de preparar amostras inteiras de memória de montagem e analisar o tecido em busca de anormalidades de acordo com o protocolo de texto, remova as lamínulas e o meio de montagem submergindo as lâminas em um frasco de coloração de vidro cheio de xileno. Incube durante a noite ou mais.

Transfira as lâminas para xileno fresco e deixe as amostras de molho por seis horas. Em seguida, transfira as amostras novamente para xileno fresco e deixe de molho durante a noite. Em seguida, com a mão enluvada, segure a corrediça e use uma pinça para remover cuidadosamente a lamínula inteira.

Pode haver variabilidade na facilidade de remoção da lamínula, dependendo da espessura do meio de montagem e do tempo desde que toda a montagem foi lamínula. Portanto, é imperativo que a lâmina permaneça em xileno até que a lamínula seja facilmente liberada. Depois que a lamínula for removida, use uma lâmina de barbear descartável afiada para remover a amostra deslizando a lâmina em um único movimento pela lâmina.

Em seguida, mergulhe rapidamente o bloco de memória em uma placa de Petri de vidro cheia de xileno para garantir que o tecido não seque ao ar. Use uma navalha para cortar tecidos maiores ao meio. Em seguida, para minimizar os danos aos tecidos, use uma pinça de ponta serrilhada de ponta romba para agarrar a borda da almofada de gordura e coloque as metades com o lado direito para cima em dois rotulados separados que acomodarão o tamanho do tecido.

Coloque o em um recipiente de xileno por até duas horas antes de colocá-lo no processador de tecidos. Em seguida, coloque manualmente o número máximo de no processador de tecidos. Antes de começar, programe o processador para processamento de tecidos.

Para automatizar o procedimento, selecione a estação, a temperatura e o vácuo ligados. Automatize o processador para embeber os em xileno por 30 minutos a 37 graus Celsius, seguido por uma segunda imersão em xileno fresco nas mesmas condições. Em seguida, automatize o processador para remover os da solução de xileno e transferir os tecidos para uma câmara dentro do processador contendo uma mistura de xileno para parafina derretida de um para um ajustada a 60 graus Celsius por 30 minutos.

Quando todas as etapas forem concluídas, selecione OK ou comece a continuar. Coloque os no tanque de retenção de um banho de parafina a 58 graus Celsius até que estejam prontos para colocá-los no molde. Remova as tampas dos para determinar o melhor tamanho de molde para os tecidos.

Adicione três a quatro milímetros de parafina derretida do bico ao molde e, em seguida, oriente o tecido na parafina derretida de modo que toda a superfície de montagem mamária adjacente à parte inferior da lâmina de vidro e à parte inferior do fique voltada para cima no molde. Transfira o molde para uma placa de resfriamento e ajuste rapidamente o tecido conforme necessário para que fique paralelo ao fundo do molde. Usando uma pinça, coloque o rotulado firmemente em cima do molde.

Dispense parafina derretida adicional no molde em um movimento contínuo para cobrir todo o. Mova o molde da placa quente para uma placa fria para promover a fixação na posição exata escolhida para o seccionamento. Quando o bloco de parafina solidificar completamente, separe o bloco do molde.

E armazene-o em temperatura ambiente até que esteja pronto para o seccionamento. Antes do corte, incubar os blocos de parafina a menos 20 graus Celsius durante uma hora. Em seguida, prepare o micrótomo ligando o banho-maria contendo água destilada fresca e ajuste a temperatura para 42 a 45 graus Celsius.

Em seguida, coloque uma lâmina nova de baixo perfil no micrótomo e ajuste-a em quatro micrômetros. Insira o bloco no micrótomo com a cera voltada para a lâmina e alinhada com o plano vertical. Em seguida, umedeça uma seção de gaze em água fria e coloque-a no bloco por alguns minutos.

Dicione o bloco girando a roda grande no sentido horário em combinação com a roda avançada de curso até obter uma face completa ou seção representativa do bloco. Em seguida, transfira a seção de tecido manualmente para um banho de água morna antes de usar uma lâmina limpa para pegá-la. Coloque as lâminas em um suporte de secagem para remover o excesso de água.

Em seguida, armazene as seções de tecido a 37 graus Celsius durante a noite. Depois de remover as lâminas da incubadora de 37 graus Celsius, armazene-as em temperatura ambiente até que estejam prontas para colorir. Para coloração automatizada, selecione H e E nas opções de coloração no menu principal para manchar as lâminas.

A desparafinização, coloração e desidratação são concluídas no corante automatizado. Use meio de montagem e uma lamínula para montar as seções. Para determinar a espessura ideal do tecido mamário, foram preparados quatro cortes micrométricos e seis micrômetros.

As seções de quatro micrômetros produziram resultados ideais, onde as áreas epiteliais e estromais e os tipos de células correspondentes foram facilmente distinguidos. Essas figuras representam cortes histológicos de glândulas normais. Ambas as glândulas apresentam estruturas ductais circundadas por uma população robusta e homogênea, rica em adipócitos.

Cada ducto é revestido por uma única camada de células epiteliais cuboidais simples e é mantido por uma segunda camada de células basais. As montagens inteiras contralaterais continham uma área de opacidade aumentada que envolvia os ductos das glândulas de memória. No entanto, não ficou claro se a opacidade era de uma alteração hiperplásica, inflamatória ou neoplásica.

Montagens inteiras contralaterais são mostradas aqui. Essas seções foram diagnosticadas como inflamação perivascular devido ao aumento do número de linfócitos ao redor de um grande vaso sanguíneo na seção das glândulas mamárias. Nessas amostras, a arquitetura lobular da glândula mamária foi mantida, mas foi aumentada pelo aumento do número e tamanho dos alvéolos normais e ductos para hiperplasia alveolar lobular.

Os lóbulos aumentados continham um número aumentado de alvéolos e ductos revestidos por células epiteliais bem diferenciadas, muitas vezes vacuoladas, que formavam lúmens que continham fluido proteico. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o tecido é frágil devido ao xileno e pode quebrar facilmente, destruindo sua amostra. Fotos de alta qualidade de montagens inteiras usando um scanner de mesa são encorajadas antes de tentar esse método.

Esta é uma oportunidade para o campo da patologia toxicológica se mover na direção da avaliação de montagem completa para triagem química. Portanto, quando as lesões são identificadas nesse nível, cortes de alta qualidade podem ser produzidos para diagnóstico histopatológico. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como remover, incorporar e seccionar montagens mamárias inteiras para identificação de lesões.

Não se esqueça de que, ao trabalhar com xileno, precauções como jalecos e luvas devem ser usadas e o trabalho deve ocorrer sob um capuz.