Name: Seção de mamíferos mamários completos para identificação de lesões (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Aprenda a criar seções coradas de alta qualidade a partir de tecido mamário de camundongo montado em lâmina para identificação de lesões em nível microscópico. Este método aumenta a chance de detectar lesões.

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Os autores gostariam de reconhecer Pam Ovwigho, Tenette Jones e Natasha Clayton, NIEHS, por sua experiência técnica e suporte com este projeto.

Todos os animais utilizados e procedimentos para este estudo foram aprovados pelo NIEHS Laboratory Animal Comitê de Atendimento e Uso e conduzido em uma Associação de Avaliação e Credenciamento de Instalação especializada em laboratório veterinário. 1. Preparação Mammary Whole-mount 2 , 3 , 6 , 7 <ol><li> Remova as glândulas mamárias inguinais de um lado de um mouse fêmea não gravida de CD-1, conforme descrito na referência 3 , e coloque-as em um slide eletrostático. </li><li> Cubra a glândula com papel ou filme antiaderente e coloque outro slide no topo. Adicione pressão ( isto é, pesos de água) ao slide para espalhar a glândula para fora, de modo que a glândula fique presa ao slide para fixação. </li><li> Submergir as lâminas no fixador ( por exemplo, 100% de etanol, clorofórmio e ácido acético glacial numa proporção de 6: 3: 1)Durante a noite a temperatura ambiente. </li><li> Remova as glândulas do fixador e lave-se em etanol por 15 a 30 minutos. Após a lavagem de 30 minutos, mude gradualmente para a água, despejando 1/3 do etanol e adicionando água. Deixe a lavagem ficar por cerca de 5 minutos cada vez e repita com a adição de água 3 vezes. </li><li> Mancha ( por exemplo, solução de alumínio de carmim) durante 12-24 h. NOTA: Tecidos mais espessos exigirão tempos de coloração mais longos. Consulte a referência 3 para detalhes da coloração. </li><li> Despeje a mancha após o tempo alocado e lave as lâminas na água por 30 s. Desidratar os tecidos lavando as lâminas em etanol a 70% durante 15 minutos, seguido de uma lavagem de 15 min em etanol a 95% e uma lavagem final em etanol a 100% durante 20 min. </li><li> Limpe a gordura dos tecidos colocando-os em xileno por um mínimo de 24 h, ou mais, se o tecido for grosso, de modo que todas as áreas opacas ou brancas sejam removidas. </li><li> Remova o tecido do xileno e adicione rapidamente mMeio de montagem no slide para evitar a desidratação do tecido; Coloque uma lamínula no topo. Deixe o slide secar durante pelo menos 48 h. </li><li> Avalie todo o tecido montado para anormalidades, conforme descrito em 2 . NOTA: Quando as lesões são detectadas em montagens inteiras e a seção é necessária para estabelecer sua identidade, as seguintes etapas devem ser seguidas. </li></ol> 2. Remoção do Monte Monográfico Mammary de um Slide de Vidro <ol><li> Remova o lamínula e o meio de montagem submergindo o slide de montagem total mamária em um frasco de coloração de vidro cheio com xileno durante a noite. NOTA: Tecidos e lâminas mais espessas com solução de montagem excessiva podem exigir um tempo adicional para a remoção da lamínula. </li><li> Após a imersão durante a noite inicial, coloque as lâminas em xileno fresco e mergulhe durante 6 h. Execute um mergulho final em xileno fresco durante a noite. NOTA: O lamínula facilmente cairá do slide após o último mergulho. </li><li> Com agAmado mão, segure o slide e remova cuidadosamente a lamínula com um par de fórceps para garantir que ele seja removido de uma só peça. NOTA: No caso em que a lamínula ainda esteja ligada à corrediça de vidro, continue a imergir até que ela possa ser removida com pouco esforço. </li><li> Uma vez que o lamínula é removido, segure o slide perpendicularmente a uma placa de Petri de vidro contendo xileno, coloque cuidadosamente uma lâmina de barbear descartável e descarta e deslize a lâmina em um único movimento pelo escorregão. </li><li> Uma vez que o tecido é removido, submergir rapidamente a almofada mamária em uma placa de Petri de vidro cheia de xileno para garantir que o tecido não seque ao ar. NOTA: tenha cuidado com esta etapa. Todo o suporte é fino (≤ 1 mm) e frágil do processamento de xileno. Qualquer impressão ou lágrima pode mudar a morfologia do tecido e complicar as avaliações posteriores. </li></ol> 3. Processamento de tecidos <ol><li> Uma vez que o tecido está na placa de Petri, transfira-o cuidadosamentePara uma cassete de histologia rotulada. Pegue a borda da almofada de gordura com fórceps com ponta dentada de nariz sem corte para minimizar os danos nos tecidos. <ol><li> Usando uma navalha, corte tecidos maiores (especialmente para ratos) pela metade e coloque-os em duas cassetes rotuladas separadas que acomodarão o tamanho do tecido. Coloque o tecido do lado direito para cima (use o nódulo linfático como referência). Certifique-se de que o tecido sem os linfonodos seja mantido na mesma posição vertical quando é transferido para a cassete. </li></ol></li><li> Coloque a cassete em um recipiente de xileno até 2 h antes de colocá-lo no processador de tecido. NOTA: Recomenda-se processar as amostras no mesmo dia em que são colocadas na cassete. A remoção prolongada no xileno não foi testada. </li><li> Carregue o número máximo de cassetes no processador de tecido à mão. </li><li> Antes do início, programe todos os reagentes que serão usados ​​para este processo na lista de reagentes do processador. Para automatizar o movimentoDe uma estação para outra, use as opções do menu e crie um novo programa. Quando todas as etapas foram concluídas, selecione &#39;OK&#39; para prosseguir. NOTA: O processador permitirá a revisão de todos os detalhes da estação antes de começar. <ol><li> Automatize o processador para embeber as cassetes em xileno durante 30 min a 37 ° C, seguido de uma segunda imersão em xileno fresco nas mesmas condições. Automatize o processador para remover as cassetes da solução de xileno e transfira os tecidos para a próxima estação contendo uma mistura 1: 1 de xileno: parafina fundida, ajustada a 60 ° C, durante 30 min. NOTA: O processador então transferirá as cassetes para uma nova câmara que contém parafina fundida durante 1 h. Após 1 h, as amostras serão automaticamente transferidas para uma nova câmara de parafina fundida fresca e serão processadas por mais 2 h. Ambas as etapas são realizadas a 60 ° C. </li><li> O processador então transfere as cassetes para a estação que contém o parágrafo fundidoPor 1 h. Em seguida, as amostras são transferidas automaticamente para a estação final de parafina fundida fresca e processadas por mais 2 h. Ambas as etapas são realizadas a 60 ° C. </li></ol></li></ol> 4. Incorporação do tecido mamário processado <ol><li> Coloque as cassetes no tanque de retenção de parafina de 58 ° C da estação de encaixe até estar pronto para incorporar o tecido no molde. </li><li> Remova a tampa da cassete para determinar o melhor tamanho do molde para o tecido. Certifique-se de que o molde é grande o suficiente para acomodar o tecido e deixar espaço suficiente para ter uma borda livre de tecido de parafina em torno do perímetro. </li><li> Adicione 3-4 mm de parafina fundida ao molde e oriente a superfície de montagem total mamária, que foi adjacente à parte inferior da lâmina de vidro e ao fundo da cassete, voltada para cima no molde. </li><li> Transfira o molde para uma placa de resfriamento e ajuste rapidamente o tecido conforme necessário para que seja paralelo ao molde bOttom. NOTA: Uma vez que a parafina endurece, o tecido será assegurado no lugar. </li><li> Usando pinças quentes, coloque a metade inferior da cassete na parte superior do molde; Pressione firmemente usando a pinça. </li><li> Adicione uma parafina em pó adicional ao molde em um movimento contínuo para cobrir toda a cassete. Mova o molde da placa quente para uma placa fria para completar o endurecimento do bloco. </li><li> Remova o bloco do molde quando a parafina se solidifica completamente para evitar rachaduras ou bolhas de ar. NOTA: Armazene os tecidos embebidos em parafina à temperatura ambiente até estar pronto para a seção. </li></ol> 5. Seção do tecido mamário embutido na parafina no microtome <ol><li> Antes de seccionar, incubar os blocos de parafina a -20 ° C durante 1 h. NOTA: Haverá meio de montagem residual no bloco a partir do tecido de montagem total revestido original. A refrigeração do bloco melhora a seção de bloqueio e a fita adesiva. </li><li> Prepare o microfoneRotome, ligando o banho-maria, contendo água destilada fresca e ajuste a temperatura entre 42-45 ° C. Coloque uma lâmina fresca e de baixo perfil no microtomo e coloque-a a 4 μm. NOTA: A qualidade da seção é reduzida com secções maiores que 4 μm devido à presença de meio de montagem residual no tecido. </li><li> Insira o bloco no microtomo com a cera voltada para a lâmina e alinhada com o plano vertical. Em seguida, umedeça uma seção de gaze em água fria e coloque no bloco por vários minutos. </li><li> Corte o bloco girando a roda grande no sentido horário, em combinação com a roda avançada grossa, até obter uma face completa ou seção representativa do bloco. NOTA: O tecido é fino por causa da limpeza do xileno durante todo o processo de montagem. Alinhe o bloco corretamente com a lâmina para minimizar o número de cortes na obtenção de uma seção representativa. </li><li> Escolha a fitaSepare manualmente, coloque cuidadosamente a fita no banho-maria quente (45 ° C) (preparada antecipadamente), deixe as rugas do tecido se dissipar e flutuar com cuidado uma seção em uma lâmina de vidro limpa. </li><li> Coloque as lâminas na posição vertical sobre uma grade de secagem para remover o excesso de água. Incubar os slides em uma caixa deslizante ligeiramente aberta durante a noite a 37 ° C. </li></ol> 6. Coloração Automática e Manual de H &amp; E de Tecidos Mamários Secados <ol><li> Antes da coloração, as lâminas são armazenadas à temperatura ambiente. </li><li> Para coloração automatizada, selecione H &amp; E a partir das opções de mancha no menu principal. A desparafinação, a coloração e a desidratação estão todas concluídas no stainer automatizado. Use um suporte de montagem e uma lamínula para montar as seções. </li><li> Se estiver manchando manualmente as lâminas, desparafine as secções imergindo as lâminas no xileno durante 5 min. Transfira para xileno fresco e repita durante 5 min. </li><li> Rehydrate as lâminas por imersãoEm duas vezes em etanol a 100% durante 3 min cada, seguido de duas repetições em etanol fresco a 95% e duas lavagens separadas em tampão de lavagem 1X a 5 min cada. </li><li> Enxaguar as lâminas em água destilada. </li><li> Adicione as lâminas à hematoxilina por 1-2 minutos. Remova as lâminas e enxaguá-las com água corrente durante 5 min. NOTA: Filtre a hematoxilina antes de cada uso. </li><li> Coloque as lâminas em 1% de ácido acético glacial durante 30 s para promover a diferenciação de cores e depois enxaguar na água da torneira durante 1 min. </li><li> Adicione os slides a 1X PBS durante 30 s a 1 min para o azul as seções de tecido, seguido de um enxaguamento de 5 min na água da torneira e depois com 95% de álcool durante 15 a 20 s. </li><li> Contrapeso com solução de eosina durante 30 s a 1 min. Depois disso, desidrate as lâminas duas vezes em 95% de etanol fresco, seguido por duas repetições frescas em etanol a 100%. Execute cada lavagem por 5 min. </li><li> Limpe as lâminas em xileno, com duas mudanças em xileno por 5 minutos cada. </li><li> CoverslipA seção de tecido com meio de montagem e seca plana durante a noite à temperatura ambiente. </li></ol>

<ol><li>Rudel, R. A., Fenton, S. E., Ackerman, J. M., Euling, S. Y., Makris, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+exposures+and+mammary+gland+development%3A+State+of+the+science%2C+public+health%2C+implications%2C+and+research+recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Environmental exposures and mammary gland development: State of the science, public health, implications, and research recommendations.</a> Environ Health Perspect. 119 (8), 1053-1061 (2011).</li>
<li>Keenan, K. P., Wallig, M. A., Hascheck, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature+via+Nurture%3A+Effect+of+Diet+on+Health%2C+Obesity%2C+and+Safety+Assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Nature via Nurture: Effect of Diet on Health, Obesity, and Safety Assessment.</a> Toxicol Pathol. 41 (2), 190-209 (2013).</li>
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<li>Hvid, H., Thorup, O., Oleksiewicz, M. B., Sjogren, I., Jensen, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+alternative+method+for+preparation+of+tissue+sections+from+the+rat+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Toxicol+Path%22%5BJournal%5D)">An alternative method for preparation of tissue sections from the rat mammary gland.</a> Exp Toxicol Path. 63 (4), 317-324 (2011).</li>
<li>Munoz-de-Toro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perinatal+exposure+to+bisphenol-A+alters+peripubertal+mammary+gland+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Perinatal exposure to bisphenol-A alters peripubertal mammary gland development in mice.</a> Endocrinology. 146 (9), 4138-4147 (2005).</li>
<li>Padilla-Banks, E., Jefferson, W. N., Newbold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+exposure+to+the+phytoestrogen+genistein+alters+mammary+gland+growth+and+developmental+programming+of+hormone+receptor+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Neonatal exposure to the phytoestrogen genistein alters mammary gland growth and developmental programming of hormone receptor levels.</a> Endocrinology. 147 (10), 4871-4882 (2006).</li>
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</ol>

Os autores não têm interesses contraditórios para declarar em relação à pesquisa, autoria e / ou publicação deste artigo.

A montagem completa da glândula mamária é uma ferramenta poderosa que pode ser usada para ilustrar o desenvolvimento mamário normal e as alterações morfológicas que podem surgir e persistir após a exposição a produtos químicos, incluindo os disruptores endócrinos. Quando uma montagem completa e a seção H &amp; E do mesmo animal são avaliadas em conjunto, elas podem fornecer uma imagem instantânea precisa de alterações precoces, que podem avançar para um estado mais doente. A capacidade de ob...

O mountis completo mamário é um método útil e barato implementado em muitos estudos de ratos e ratos para entender o desenvolvimento anormal e induzido quimicamente. Em geral, uma glândula mamária coletada em vários estágios durante o desenvolvimento de roedores ( ou seja, adolescência, puberdade, gestação média e tardia e fase de involução) mostrará mudanças morfológicas na arquitetura celular e celular influenciada por fatores paracrinos, endócrinos e autocrinos 1 . No rato envelhecido, as porções epiteliais e estromadas da glândula tornam-se cada vez mais densas, o que dificulta a medição de parâmetros morfológicos em um monte inteiro. Assim, é prática comum coletar uma glândula para avaliação histológica para identificar mudanças em um nível microscópico. Ambos os processos são especialmente úteis em estudos envolvendo exposição química ( ou seja, ambiental ou farmacêutico) ou para examinar as alterações morfológicas acompanhadas de alterações genéticasAções. Técnicas e capacidades para usar a glândula mamária na avaliação de risco continuam a evoluir. Embora a preparação de montagem total seja rotineira e padronizada, as modificações na seção continuam 2 , 3 . Muitos grupos de pesquisa de diferentes origens ( ie, academia, governo e indústria) adaptaram as seções coronal / longitudinal do tecido mamário como um método preferido, enquanto alguns laboratórios ainda usam cortes transversais através da pele 4 . O último método resulta em uma representação desordenada da epiderme (pele), em vez do tecido de interesse: o epitélio da glândula mamária 2 . As seções coronais ou longitudinais são mais úteis para caracterizar o tecido normal 5 e melhoram muito a detecção de anormalidades e lesões devido ao aumento da área de superfície e ao número de estruturas presentes. No geral, isso faz com que todo o mundoNão é um método adequado para a avaliação histopatológica comparativa da glândula mamária 1 , 2 . Quer usando um ratinho ou um rato, a recuperação e a conservação do 4 e 5 de gânglios inguinais é altamente recomendada para a comparação do conjunto de montagem para uma secção contralateral H &amp; E. Quando usado em combinação, a seção H &amp; E e a montagem total fornecem uma conta precisa das mudanças celulares e morfológicas induzidas pela exposição ambiental. Isto é especialmente verdadeiro em certas cepas de roedores nas quais o modelo possui uma baixa susceptibilidade à formação de tumor ou um tumor não é visivelmente visível. Em algumas circunstâncias, a obtenção do tecido necessário nem sempre é possível usando ambas as técnicas ( ou seja, quantidade de tecido insuficiente, recursos ou resultados experimentais inesperados). No nosso caso, observaram-se anormalidades no conjunto total mamário, enquanto o histopathoOs achados lógicos na glândula contrárea H &amp; E foram na sua maioria normais. A discrepância esmagadora entre as glândulas contralaterais nos levou a desenvolver um procedimento econômico e eficiente para identificar as anormalidades em toda a montagem. Utilizando um procedimento de processamento e incorporação modificado, foram preparadas secções coloridas com H &amp; E de alta qualidade a partir de montagens inteiras integradas em parafina. Imaginamos que este protocolo se torne uma poderosa ferramenta de detecção para efeitos de exposição química, aumentando as comparações entre laboratórios.

<table><tbody><tr><td>Xileno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>214736</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td>mídia de montagem para lamínula montagens inteiras e H& E seções</td></tr><tr><td>Processador automatizado Leica</td><td>Biosystems</td><td>Modelo # ST5020</td><td></td></tr><tr><td>HM 355S Micrótomo Automático</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>905200</td><td></td></tr><tr><td>Parafina</td><td>Leica Biosystems</td><td>EM-400</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost plus lâminas de microscópio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4951PLUS-001</td><td>eletrostaticamente carregado</td></tr><tr><td>Fisher Finest 24x60x1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-548-5P</td><td>lamínulas</td></tr><tr><td>Varistain Gemini ES Coloração automática de lâminas</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A78000014</td><td></td></tr><tr><td>Sta-On</td><td>Leica Biosystems</td><td>3803107</td><td>adesivo líquido; usado em banho-maria no seccionamento</td></tr><tr><td>Hematoxilina Harris modificada 72711</td><td>Richard-Allan Scientific (parte da Thermo Scientific)</td><td>72711</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Leica Biosystems</td><td>3801600</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato de lítio</td><td>SkyTech Laboratories</td><td>LCQ500</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A38-500</td><td>necessário no fixador de Carnoy</td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>4440-04</td><td>necessário no fixador de Carnoy</td></tr><tr><td>100% Etanol</td><td>A Warner Graham Company</td><td>6505001050000</td><td>necessária no fixador e lâminas de lavagem de Carnoy</td></tr><tr><td>95% Etanol</td><td>The Warner Graham Company</td><td>6505011137320190</td><td></td></tr><tr><td>Carmine Alum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1022-25G</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de potássio de alumínio dodecahidratado, Sigma Ultra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7210-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de lavagem de automação, 20X</td><td>Biocare Medical</td><td>TWB945</td><td></td></tr></tbody></table>

seção de mamíferos mamários completos para identificação de lesões

Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification

O desenvolvimento normal da glândula mamária pode ser alterado pela exposição a substâncias tóxicas ambientais e produtos farmacêuticos, exposição excessiva a hormonas e alterações genéticas. As montagens inteiras da glândula mamária são um método barato para capturar a progressão das alterações morfológicas que podem surgir após a exposição. No entanto, na vida posterior, quando as anormalidades são mais propensas a desenvolver, a única dependência deste método pode nem sempre fornecer informações suficientes para fazer um diagnóstico adequado da anormalidade. Historicamente, em estudos de diretrizes de teste químico, uma única glândula mamária é removida na necropsia e preparada como uma seção mantida com hematoxilina e eosina (H &amp; E). A incorporação de coleta e análise de mamíferos contralaterais inteiros diminui a probabilidade de uma avaliação falso-negativa. A avaliação de todo o suporte é limitada pela presença de uma ou duas glândulas mamárias inteiras em um slide e, em alguns casos, as anormalidades observadas em todo o suporte não sãoT uniformemente representado na seção H &amp; E. O objetivo deste estudo foi desenvolver um protocolo para a conversão de montagens completas mamárias revestidas em seções manchadas de H &amp; E para que as lesões que de outra forma tenham sido perdidas ou que sejam difíceis de diagnosticar possam ser identificadas. Aqui, detalhamos um método para produzir uma seção de H &amp; E integrada em parafina de alta qualidade de uma glândula mamária que inicialmente foi preparada como uma montagem total. Em comparação com um tecido que foi intencionalmente preparado para seção de H &amp; E, todo o suporte requer preparação adicional para remoção e processamento de tecido. No entanto, este método é considerado barato, uma vez que requer reagentes de laboratório comuns e pouco tempo adicional. Como resultado, este método pode fornecer informações inestimáveis ​​sobre como as exposições químicas e ambientais alteram o desenvolvimento mamário normal, bem como exibir mudanças que ocorrem devido a modificações genéticas.

Este método é eficaz para auxiliar nos diagnósticos que, de outra forma, poderiam ter sido perdidos se a seção contralateral original de H &amp; E da almofada mamária não apresentasse alterações histológicas. No entanto, o resultado só será útil se for tomado cuidado durante a preparação inicial inicial, bem como durante a preparação do tecido para a avaliação histológica. A incorporação de parafina proporcionará proteção e ajudará a preservar o tecido para futuras secções. <p class=...

Desenvolvemos um método para remover, processar, cortar e manchar com sucesso, para avaliação histopatológica, tecido mamário que inicialmente havia sido fixado em slides como montagens inteiras. Este método pode promover a coleta e avaliação de montantes inteiros de glândula mamária em estudos de diretrizes de testes reprodutivos e de desenvolvimento.

Seção de mamíferos mamários completos para identificação de lesões

Normal mammary gland development may be altered by exposure to environmental toxicants and pharmaceutical products, excessive exposure to hormones, and ...

O objetivo geral deste procedimento é criar cortes corados de alta qualidade a partir de tecido mamário de camundongo montado inteiro, para a identificação de lesões ao nível microscópico. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais envolvendo a avaliação da glândula mamária, como a identificação histopatológica de tipos de lesões identificadas macroscopicamente em montagens inteiras da mama. A principal vantagem desta técnica é que aumenta a probabilidade de identificar lesões que possam existir dentro das glândulas mamárias ao se utilizar tecidos montados inteiros.Tivemos pela primeira vez a ideia deste método ao comparar fenótipos em montagem inteira com laudos de histopatologia para glândulas contralaterais coradas com hematoxilina e eosina em formalina provenientes dos mesmos animais. Observamos uma discrepância nos diagnósticos, com mais lesões evidentes nas montagens inteiras. A demonstração visual deste método é importante, pois as etapas de remoção e inclusão em montagem inteira são fundamentais para o sucesso deste procedimento.A glândula é delicada devido à sua natureza fina e frágil. Após preparar amostras de montagem total de tecido e analisar o tecido em busca de anormalidades de acordo com o protocolo descrito, remova as lamínulas e o meio de montagem submergindo as lâminas em um frasco de vidro para coloração cheio de xilol. Incubar durante a noite ou por período mais longo.Transfira as lâminas para xilol fresco e deixe as amostras embebidas por seis horas. Em seguida, transfira novamente as amostras para xilol fresco e deixe embebidas durante a noite. Depois, com a mão usando luva, segure a lâmina e use um par de pinças para remover cuidadosamente a lamínula inteira.Pode haver variabilidade na facilidade de remoção da lamínula, dependendo da espessura do meio de montagem e do tempo decorrido desde que o preparo foi montado. Portanto, é fundamental que a lâmina permaneça em xilol até que a lamínula seja liberada com facilidade. Após a remoção da lamínula, utilize uma lâmina de barbear descartável e afiada para remover a amostra, deslizando a lâmina em um único movimento ao longo da lâmina.Em seguida, mergulhe rapidamente o coxim de tecido em uma placa de Petri de vidro contendo xilol para garantir que o tecido não seque ao ar. Utilize uma lâmina para cortar em duas partes os tecidos maiores. Depois, para minimizar danos ao tecido, use pinças rombas com pontas serrilhadas para segurar a borda do coxim adiposo e posicione as metades com a face voltada para cima em duas cápsulas separadas e identificadas, que acomodem o tamanho do tecido.Coloque a cassete em um recipiente com xilol por até duas horas antes de colocá-la no processador de tecidos. Em seguida, carregue manualmente o número máximo de cassetes no processador de tecidos. Antes de iniciar, programe o processador para o processamento dos tecidos.Para automatizar o procedimento, selecione a estação, a temperatura e o vácuo em ligado. Automatize o processador para imergir as caixas em xilol por 30 minutos a 37 graus celsius, seguido por uma segunda imersão em xilol fresco nas mesmas condições. Em seguida, automatize o processador para remover as caixas da solução de xilol e transferir os tecidos para uma câmara dentro do processador contendo uma mistura de xilol a parafina fundida na proporção de um para um, ajustada a 60 graus celsius por 30 minutos.Após a conclusão de todas as etapas, selecione ok ou iniciar para prosseguir. Coloque as cassete no tanque de espera de um banho de parafina a 58 graus celsius até o momento de posicioná-las na forma. Remova as tampas das cassete para determinar o tamanho ideal da forma para os tecidos.Adicione três a quatro milímetros de parafina fundida proveniente do bico ao molde, depois oriente o tecido na parafina fundida de modo que a superfície do preparado integral da mama, que estava adjacente ao fundo da lâmina de vidro e ao fundo do cassete, fique voltada para cima no molde. Transfira o molde para uma placa de resfriamento e ajuste rapidamente o tecido conforme necessário para que fique paralelo ao fundo do molde. Usando pinças, posicione firmemente o cassete identificado sobre o molde.Despeje parafina fundida adicional no molde com movimento contínuo para cobrir completamente a cassete. Transfira o molde da placa aquecida para uma placa fria para promover a fixação na posição exata escolhida para o corte. Quando o bloco de parafina solidificar completamente, separe o bloco do molde.E armazene-o em temperatura ambiente até o momento do corte. Antes do corte, incube os blocos de parafina a menos 20 graus Celsius por uma hora. Em seguida, prepare o micrótomo ligando o banho-maria contendo água destilada fresca e ajuste a temperatura para 42 a 45 graus Celsius.Em seguida, coloque uma lâmina nova de perfil baixo no micrótomo e ajuste-a em quatro micrômetros. Insira o bloco no micrótomo com a parafina voltada para a lâmina e alinhada com o plano vertical. Em seguida, umedeça um pedaço de gaze com água fria e coloque-o sobre o bloco por vários minutos.Corte o bloco girando a roda grande em movimento horário em combinação com a roda de avanço grosseiro até obter uma face completa ou uma seção representativa do bloco. Em seguida, transfira a seção tecidual manualmente para um banho de água morna antes de recolhê-la com uma lâmina limpa. Coloque as lâminas em um suporte de secagem para remover o excesso de água.Em seguida, armazene as seções de tecido a 37 graus Celsius durante a noite. Após remover as lâminas do incubador a 37 graus Celsius, armazene-as à temperatura ambiente até o momento da coloração. Para coloração automatizada, selecione H e E entre as opções de coloração no menu principal para corar as lâminas.A desparafinização, coloração e desidratação são realizadas no coloridor automático. Use meio de montagem e uma lamínula para montar as seções. Para determinar a espessura ideal do tecido mamário, foram preparadas seções de quatro micrômetros e seis micrômetros.As seções de quatro micrômetros produziram resultados ideais, onde as áreas epiteliais e estromais e os respectivos tipos celulares foram facilmente diferenciados. Essas figuras representam cortes histológicos de glândulas normais. Ambas as glândulas mostram estruturas ductais cercadas por uma população rica em adipócitos, robusta e homogênea.Cada ducto é revestido por uma única camada de células epiteliais cúbicas simples e é mantido por uma segunda camada de células basais. Os cortes completos contralaterais continham uma área de opacidade aumentada que envolvia os ductos das glândulas da memória. No entanto, não estava claro se a opacidade era decorrente de uma alteração hiperplásica, inflamatória ou neoplásica.Montagens inteiras contralaterais são mostradas aqui. Essas seções foram diagnosticadas como inflamação perivascular devido ao aumento no número de linfócitos ao redor de um grande vaso sanguíneo na seção das glândulas mamárias. Nessas amostras, a arquitetura lobular da glândula mamária foi mantida, mas estava aumentada pelo maior número e tamanho de alvéolos e ductos normais, caracterizando hiperplasia alveolar lobular.Lóbulos aumentados continham um número elevado de alvéolos e ductos revestidos por células epiteliais bem diferenciadas, muitas vezes vacuolizadas, que formavam lúmens contendo fluido proteico. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o tecido é frágil devido ao xilol e pode quebrar facilmente, destruindo sua amostra. Recomenda-se obter fotos de alta qualidade de preparações inteiras utilizando um scanner de mesa antes de tentar este método.Esta é uma oportunidade para a área de patologia toxicológica avançar na direção da avaliação de preparações inteiras para triagem química. Assim, quando lesões forem identificadas nesse nível, cortes de alta qualidade podem agora ser produzidos para o diagnóstico histopatológico. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como remover, incluir e seccionar preparações inteiras da mama para identificação de lesões.Não se esqueça de que, ao trabalhar com xilol, precauções, como o uso de jalecos e luvas, devem ser adotadas e o trabalho deve ser realizado sob capela.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

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