Name: Predicando silenciamento de genes através do controle Spatiotemporal da liberação de siRNA de Nanocarriers poliméricos com fotos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Descubra como prever o silenciamento de genes usando copolímeros fotossensíveis e modelagem cinética. Este método permite o controle espaciotemporal da expressão proteica sem efeitos off-target, com aplicações em descoberta de medicamentos e medicina regenerativa.

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Os autores agradecem ao Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) pelo apoio financeiro através de um Prêmio de Desenvolvimento Institucional (IDeA) sob o número de concessão P20GM103541, bem como o número de concessão P20GM10344615. As declarações aqui contidas não refletem as opiniões do NIH. Também reconhecemos o Delaware Biotechnology Institute (DBI) eo Delaware Economic Development Office (DEDO) para apoio financeiro através do prêmio Bioscience Center for Advanced Technology (Bioscience CAT) (12A00448).

1. Formulação de siRNA Nanocarriers <ol><li> Prepare soluções separadas de siRNA e mPEG- b- P (APNBMA) com volumes iguais diluídos em tampão 20 mM de ácido 4- (2-hidroxietil) piperazina-1-etanossulfónico (HEPES) a pH 6,0. <ol><li> Adicionar siRNA a uma concentração de 32 μg / mL a 20 mM de solução de HEPES. NOTA: O siRNA foi uma sequência de controle negativa universal não-direcionada; No entanto, o siRNA pode ser projetado para direcionar qualquer gene de interesse. </li><li> Dissolver os polímeros mPEG- b- P (APNBMA) em uma solução de 20 mM de HEPES. Adicione uma quantidade apropriada de mPEG- b- P (APNBMA) para fazer uma solução de 220 μg / mL de modo que a relação N / P (N, grupos de amina em mPEG- b- P (APNBMA); P, grupos de fosfato em siRNA) É 4. NOTA: O protocolo sintético para os polímeros mPEG- b- P (APNBMA) é relatado em outro lugar 30 . </li></ol></li><li> Adicione a solução mPEG- b- P (APNBMA), gota a gota, a um volume igualE da solução de siRNA enquanto mistura suavemente em uma máquina vortex. Continue a vórtice durante 30 s após a adição de polímero. Incubar as amostras no escuro a temperatura ambiente durante 30 min. </li></ol> 2. Medindo a liberação de siRNA usando eletroforese em gel <ol><li> Formule os nanocarriers de acordo com as etapas 1.1-1.2 e dimensione os volumes para acomodar o número de amostras desejadas. </li><li> Misture o nanocarrier com dodecilsulfato de sódio (SDS). <ol><li> Prepare uma solução de SDS de 1 mg / ml em água. Alíquota a quantidade de solução SDS necessária para produzir soluções com uma relação S / P (S, grupos sulfato em SDS, P, grupos fosfato em siRNA) de 15. NOTA: Se a solução de polyplex contiver 1 μg de siRNA, devem ser adicionados 13 μg de SDS para atingir uma relação S / P de 15. </li><li> Adicione a solução SDS a cada solução de nanocarrier gota a gota enquanto se misturam suavemente em uma máquina vortex. Continue a vórtice por 30 s após a adição do SDS. </li><li&gt; Centrifugar as amostras a 3.000 xg por 5 s. Incubar as amostras no escuro a temperatura ambiente durante 30 min. </li></ol></li><li> Calibre e ajuste um laser UV com um filtro de 365 nm para uma intensidade de 200 W / m. Certifique-se de que a intensidade da luz seja medida a partir da localização em que o fundo da solução de amostra será assentado. </li><li> Coloque a solução nanocarrier / SDS em uma câmara de vidro composta por lâminas de vidro separadas por uma junta de borracha. <ol><li> Prelavar as lâminas de vidro em uma solução de etanol / água 7: 3 (v / v) em água e secar completamente. Corte um buraco (~ 2 x 3 cm de retângulo) em uma junta de borracha. Coloque a junta de borracha em uma lâmina de vidro. </li><li> Pipetar a solução nanocarrier / SDS no slide de vidro dentro do orifício da junta de borracha. Carregue um excesso de solução (20 μL excedente) no deslize de vidro evitando o contato com a junta de borracha. NOTA: Alguns líquidos serão perdidos durante as etapas subsequentes. </li><li> Coloque o segundo copoDeslize na parte superior da junta deslizante. Para evitar a geração de bolhas de ar, coloque uma extremidade do slide em primeiro lugar e, em seguida, abaixe lentamente a outra extremidade. </li><li> Anexe clipes de ligação a cada lado da câmara de vidro para mantê-lo fechado. </li></ol></li><li> Irradiate as amostras para o período de tempo desejado ( por exemplo , 0-60 min) usando o laser UV com um filtro de 365 nm com uma intensidade de 200 W / m. Remova os clipes da pasta e abra a câmara. </li><li> Pipetar 25 μL das amostras de nanocarrier / SDS irradiadas em um tubo de microcentrífuga. Incubar as soluções no escuro à temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Prepare um gel de agarose a 2% em peso pré-corado com 0,5 ug / mL de brometo de etidio em solução tampão Tris / Borate / EDTA (TBE) de acordo com os protocolos padrão 31 . Prepare um tampão de carga composto de 3: 7 (v / v) de glicerol / água. </li><li> Adicione 5 μL da solução tampão de carga a 25 μL de cada amostra nanocarrier / SDS. Incube as amostras no escuro emTemperatura ambiente por 10 min. </li><li> Carregue 30 μL de cada amostra nanocarrier / SDS no gel de agarose a 2%. Execute o gel no escuro a 100 V por 30 min. Imagine o gel usando um sistema de imagem em gel com filtros de brometo de etidio. Salve os arquivos de imagem em gel e avance para a etapa 2.10 para a quantificação da intensidade da banda. Certifique-se de que as intensidades da banda são suficientemente brilhantes para visualizar claramente, mas não muito brilhantes, que os sinais estão saturados. </li><li> Quantifique as intensidades da banda usando o software ImageJ disponível publicamente 32 . <ol><li> Usando a ferramenta ROI do ImageJ, determine a intensidade de fluorescência das bandas de siRNA gratuitas em cada faixa, desenhando um retângulo ao redor de cada banda. Trace as curvas de intensidade de cada pista e integre a área sob as curvas, desenhando uma linha horizontal através das curvas de intensidade e clicando na varinha de rastreamento dentro das áreas incluídas. </li><li> Calcule a intensidade relativa de cada pista dividindo a área sob o comandoRve de cada amostra pela área sob a curva do controle positivo de siRNA (sem mPEG- b -P (APNBMA) adicionado e sem SDS adicionado). Relate a porcentagem de siRNA liberada como a intensidade da banda normalizada de cada amostra. </li></ol></li></ol> 3. Medindo a liberação de siRNA usando a espectroscopia de correlação de fluorescência (FCS) <ol><li> Obtenha siRNA marcado com um único fluoróforo na extremidade 5 &#39;da cadeia sensora. NOTA: O siRNA pode ser comprado pré-recozido com os rótulos conjugados no local desejado. O fluoróforo deve ser foto-estável e absorver / emitir entre 450 e 750 nm para evitar a extinção da luz UV e transferência de energia com mPEG- b- P (APNBMA). </li><li> Formule os nanocarriers de acordo com as etapas 1.1-1.2 usando o siRNA marcado. Dimensione os volumes para acomodar o número de amostras desejadas. </li><li> Incubar as soluções em SDS e irradiar durante o período desejado de acordo com as etapas 2.2-2.6. </li><li> PrepararCâmara de amostra FCS. <ol><li> Lave uma lâmina de vidro com uma solução de etanol / água 7: 3 (v / v) e secar completamente o vidro usando uma limpeza e uma corrente de ar. </li><li> Remova os pedaços de papel de um espaçador adesivo de dupla face para expor o espaçador adesivo de dupla face. Anexe o espaçador a uma lamínula de vidro. </li><li> Pipetar a solução de nanocarrier / SDS no deslizamento da cobertura no meio do orifício do espaçador adesivo. </li><li> Coloque o slide de vidro em cima da lamínula. Pressione o escorregador de vidro para garantir que o escorregador de vidro e a lamínula estejam bem unidos e formem uma vedação. </li></ol></li><li> Use um microscópio confocal para medições de FCS 33 . Use um objetivo de apochromat de imersão em água 40X com uma abertura numérica de 1,2. Use o canal laser de excitação apropriado (488 nm) para coletar pelo menos 30 medidas de 10 s cada por amostra 34 . Certifique-se de que a intensidade do laser eo alinhamento do detector permanecemO mesmo para cada amostra. <ol><li> Além das amostras experimentais, controle de medidas, incluindo: uma amostra em branco sem siARN marcado; E uma amostra de siRNA grátis com siRNA marcado, mas sem mPEG- b- P (APNBMA). </li></ol></li><li> Analise os dados usando o software específico do FCS. Identifique a taxa de contagem de linha de base de cada amostra, determinando a taxa de contagem estável durante um período em que não há nanocarriers passando pelo volume confocal 29 . <ol><li> Subtrair a taxa de contagem da amostra em branco de cada valor da taxa de contagem da base da amostra. Normalize os valores resultantes para o controle de siRNA gratuito para calcular a porcentagem de siRNA livre 35 . </li></ol></li></ol> 4. Modelagem cinética para prever o silenciamento de genes <ol><li> Crie scripts em uma linguagem de programação matemática usando o conjunto simples de equações diferenciais ordinárias para prever o silenciamento de genes 29. NOTA: Os scripts podem ser disponibilizados mediante solicitação. <ol><li> Escreva o conjunto de equações diferenciais ordinárias como: <img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/55803/55803eq1.jpg" /> (1) <img alt="Equação 2" src="/files/ftp_upload/55803/55803eq2.jpg" /> (2) <img alt="Equação 3" src="/files/ftp_upload/55803/55803eq3.jpg" /> (3) NOTA: Para as equações 1-3, os termos k mRNA , k siRNA e k prot são as constantes de taxa para a produção de mRNA, siRNA e proteína, respectivamente. Os termos k m, deg , k s, deg e k p, deg são as constantes de velocidade para a degradação de mRNA, siARN e proteína, respectivamente. As constantes da taxa de degradação são calculadas com base nas semi-vidas dos componentes e as constantes da taxa de produção são adequadas para garantir que os valores do mRNA e da estabilidade da proteína sejam atingidos na ausência oSIRRNA. <ol><li> Determine as meias-vidas do mRNA e da proteína para o (s) gene (s) de interesse, seja experimentalmente como descrito na referência 36 ou da literatura (ver Discussão ). Além disso, determine o tempo de duplicação para a linha celular. Insira esses valores nas expressões da taxa de degradação apropriada. </li><li> Sintonize as constantes de taxa de produção para que os níveis de expressão de genes permaneçam estáveis ​​a um valor normalizado de 100 se nenhum siARN for introduzido. Especificamente, definir [siRNA] para zero e variar os valores das constantes de taxa de produção k mRNA , k siRNA e k prot até [mRNA] e [proteína] permanecerem dentro de 1% do valor normalizado inicial de 100% durante a duração de A simulação. </li><li> Usando as quantidades relativas de siRNA liberado da eletroforese em gel previamente descrita e dos ensaios FCS como estimativas, ajuste a concentração relativa inicial de siRNA no script. Especificamente, variar [siRNA] para ser proporcional à quantidade relativa de siRNA liberado, com um valor de 100 correspondente à quantidade máxima 29 . </li></ol></li></ol></li></ol> 5. Cultura celular e entrega in vitro de siRNA <ol><li> Cultura NIH / 3T3 fibroblastos embrionários murinos de acordo com os protocolos do fornecedor. <ol><li> Crescer as células em meio de crescimento (Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro de bovino fetal inactivado pelo calor e 1% de penicilina-estreptomicina). Manter as células a 37 ° C em um ambiente humidificado com 5% de CO 2 . </li></ol></li><li> Semeie as células em placas tratadas com cultura de tecido de 6 poços. <ol><li> Siga o procedimento de subcultivação recomendado do fornecedor. Contar as células usando um hemocitômetro. Diluir as células em meios de crescimento suplementados a uma concentração de 75.000 células / mL. </li><li> Adicionar 2 mL de suspensão celular (75.000 célulasS / mL) para cada poço da placa de 6 poços. Deixe as células aderir e recuperar durante 24 h na incubadora. </li></ol></li><li> Prepare as células para transfecção lavando com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e adicionando 1,5 ml de meio de transfecção sem soro e antibiótico (ver Tabela de Materiais ) a cada poço. </li><li> Formule os nanocarriers siRNA de acordo com as etapas 1.1-1.2. Adicione 25 μL de solução de nanocarrier contendo 30 pmol de siRNA para cada poço. Agrida levemente a mídia para cima e para baixo para misturar. Coloque as células na incubadora por 3 h. </li><li> Remova o meio de transfecção e lave cada poço com PBS. Adicione 1 mL de meio de crescimento suplementado e coloque as células na incubadora para recuperar durante 30 min. </li><li> Para preparar as células para tratamento com um fotoestimulante, remova os meios de crescimento suplementados. Adicione 1 mL de meio de transfecção (sem vermelho fenol) a cada poço. NOTA: Certifique-se de que a mídia de transfecção não contém vermelho de fenol. </li><li>Calibre e ajuste um laser UV com um filtro de 365 nm para uma intensidade de 200 W / m. Certifique-se de que a intensidade da luz seja medida a partir da localização em que o fundo da placa celular será assentado. </li><li> Coloque as células em uma placa quente ajustada para 37 ° C. Remova a tampa da placa das células. Irradiate as células de acima da placa durante o tempo desejado (até 20 min) usando o laser UV com um filtro de 365 nm com uma intensidade de 200 W m -2 . </li><li> Remova o meio de transfecção e adicione 2 mL de meio de crescimento suplementado. Coloque na incubadora até análise posterior ( por exemplo , 24 h para qPCR e 48 h para Western blot). <ol><li> Medir mudanças na expressão de genes usando uma variedade de técnicas, tais como Western Blot 37 e qPCR. 38 Para genes com sinais visíveis, como GFP, use microscopia de fluorescência 29 . NOTA: Estas técnicas são sugeridas devido à sua facilidade de uso e precisãoNa quantificação da expressão gênica </li></ol></li></ol> 6. Controlando o silenciamento de genes de forma Spatiotemporal <ol><li> Cultura, semente e células transfectadas de acordo com as etapas 5.1-5.7. </li><li> Prepare uma fotomátema que bloqueie completamente a luz de 365 nm e minimiza as reflexões. NOTA: Neste caso, foram utilizados fragmentos de papel de alumínio de 10 x 10 cm e papel de construção preto para bloquear a luz e reduzir as reflexões, respectivamente. A folha de alumínio e o papel de construção foram colados para formar uma única unidade. <ol><li> Corte / soco / máquina a forma desejada na fotomáscara. Por exemplo, use uma lâmina afiada e um perfurador para formar um padrão de linha reta (~ 5 cm de comprimento) e um padrão circular (~ 7 mm de diâmetro) na fotomáscara, respectivamente. </li></ol></li><li> Cola a fotomask no fundo da placa de 6 poços com o padrão centrado sob o poço contendo as células com o lado anti-reflexo ( por exemplo , preto cPapel de impressão) de frente para a placa. Certifique-se de que a cola não está colocada perto da borda (dentro de ~ 3 mm) do padrão. </li><li> Configure dois suportes de anel a aproximadamente 25 cm de distância e prenda uma plataforma a cada suporte de anel para que as plataformas sejam de igual altura. Suspenda a placa da célula entre os dois suportes, descansando a placa sobre as plataformas. Certifique-se de que a placa esteja nivelada. </li><li> Irradiar as células de abaixo da amostra durante o tempo desejado (até 20 min) usando o laser UV com um filtro de 365 nm com uma intensidade de 200 W / m 2 . </li><li> Remova o meio de transfecção e adicione 2 mL de meio de crescimento suplementado. Coloque na incubadora para recuperar por pelo menos 24 h. Imagem das células usando microscopia de fluorescência como descrito 29 . </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Existem alguns passos no método que são particularmente críticos. Ao formular os nanocarriers, a ordem de adição de componentes e velocidade de mistura são dois parâmetros importantes que influenciam a eficácia 39 . Este protocolo requer que o componente catiónico, mPEG- b- P (APNBMA), seja adicionado ao componente aniónico, siARN, de forma gota a gota enquanto se agita com vortex. Dependendo do volume total da formulação, este processo de mistura leva 3-6 s. Para testar se os nanocarrie...

Os pequenos ARNs de interferência (siRNAs) medeiam o silenciamento de genes pós-transcrição através de uma via de RNAi catalítica que é altamente específica, potente e adaptada a praticamente qualquer gene alvo 1 . Essas características promissoras permitiram que a terapia com siRNA avançasse em ensaios clínicos em humanos para o tratamento de numerosas doenças, incluindo melanoma metastático e hemofilia 2 , 3 . No entanto, persistem persistentes problemas de entrega que prejudicaram a tradução 4 . Em particular, os veículos de entrega devem permanecer estáveis ​​e proteger siRNAs de degradação extracelular, mas também liberar a carga útil no citoplasma 5 . Além disso, muitas aplicações de RNAi requerem métodos aprimorados para regular o silenciamento de genes no espaço e no tempo 6 , o que reduzirá os efeitos colaterais na terapêutica com siRNA 7 e possibilitará transformar aDvances em aplicações que vão desde microarrays celulares para a descoberta de drogas 8 até a modulação de respostas celulares em andaimes regenerativos 9 . Esses desafios destacam a necessidade de novos materiais e métodos para controlar melhor a ligação e a liberação nos nanocarriers de siRNA. Uma das estratégias mais promissoras para controlar a liberação de siRNA e melhorar a regulação espaciotemporal é o uso de materiais sensíveis ao estímulo 10 . Por exemplo, uma grande variedade de biomateriais foram projetados com afinidade de ligação de ácido nucleico variável em resposta ao potencial redox ou pH alterado, ou campos magnéticos aplicados, ultra-som ou luz 11 . Embora muitos desses sistemas demonstrem um controle melhorado sobre a atividade do ácido nucleico, o uso da luz como gatilho é particularmente vantajoso devido à sua resposta temporal instantânea, resolução espacial precisa e facilidade de afinação <suP class = &quot;xref&quot;&gt; 12. Além disso, o potencial das tecnologias sensíveis à foto para a regulação da expressão gênica foi demonstrado por sistemas de regulação induzível induciável e sistemas reguladores optogênicos de última geração; No entanto, esses sistemas sofrem de inúmeros desafios, incluindo capacidades limitadas para regular genes endógenos, preocupações de segurança, como imunogenicidade e dificuldades na entrega de conjuntos de componentes múltiplos 13 , 14 , 15 . Photo-responsive siRNA nanocarriers são ideais para superar essas desvantagens e proporcionar uma abordagem mais simples e mais robusta para spatiotemporally modular a expressão de genes 16 , 17 , 18 . Infelizmente, métodos para prever com precisão a resposta resultante da redução de proteína permanecem difíceis. Um desafio fundamental é que as avaliações quantitativas da liberação de siRNA sãoRaro 19 , 20 , e mesmo quando essas avaliações são realizadas, elas não foram acopladas a análises da dinâmica de rotação de siRNA / proteína. Tanto a quantidade de siRNA liberada quanto a persistência / vida são determinantes importantes da dinâmica de silenciamento de genes resultante; Daí, a falta de tal informação é uma grande desconexão que impede uma previsão precisa de dose-resposta no RNAi 21 . Dirigir-se a este desafio agilizaria a formulação das relações estrutura-função apropriadas em nanocarriers e melhor informará os projetos de biomateriais 22 . Além disso, tais abordagens permitiriam o desenvolvimento de protocolos de dosagem de siARN mais eficazes. Na tentativa de entender a resposta dinamizante ao silenciamento, vários grupos investigaram modelos matemáticos de RNAi 23 , 24 , 25 . Esses quadros foramBem sucedido em fornecer informações sobre as mudanças mediadas pelo siRNA na expressão gênica e na identificação das etapas de limitação de taxa 26 . No entanto, esses modelos foram aplicados apenas aos sistemas comerciais de administração de genes ( por exemplo , Lipofectamina e polietilenimina (PEI)) que não são capazes de liberação de siRNA controlada e a complexidade dos modelos limitou severamente sua utilidade 27 . Essas deficiências destacam uma necessidade insatisfeita de novos materiais capazes de obter uma versão de siRNA sintonizável, combinada com modelos cinéticos preditivos simplificados e fáceis de usar. Nosso método aborda todos esses desafios através da integração de uma plataforma de nanocarrier sensível à luz com métodos acoplados para quantificar siRNA e dinâmica de RNAi de modelo. Em particular, o lançamento de siRNA precisamente controlado da nossa plataforma 28 é monitorado por dois métodos complementares para quantificar com precisão encapsulado vs.SiRNA ligado. Os dados experimentais desses ensaios são inseridos em um modelo cinético simples para prever as eficiências de silenciamento de genes a priori 29 . Finalmente, a natureza on / off dos nanocarriers é facilmente explorada para gerar padrões de células na expressão gênica com controle espacial na escala de comprimento celular. Assim, este método fornece um método facilmente adaptável para controlar e prever o silenciamento de genes em uma variedade de aplicações que se beneficiarão da regulação espaciotemporal do comportamento celular.

<table><tbody><tr><td>siRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SIC001</td><td>não direcionado, controle negativo universal</td></tr><tr><td>mPEG-b-P(APNBMA)</td><td>sintetizado em nosso laboratório</td><td>N/A</td><td>polímero foto-responsivo</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-100</td><td></td></tr><tr><td>dodecil sulfato de sódio&nbsp;</td>Junta de borracha <td>436143</td><td></td> <td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td></td><td>McMaster-Carr</td><td>3788T21</td><td>Laser UV de 0,5 mL de espessura</td></tr><tr><td>&nbsp;</td>Lente colimadora <td>Excelitas Technologies</td><td>Omnicure S2000</td><td>e filtro de 365 nm usado</td></tr><tr><td>agarose</td> Brometo de etídio <td>Fisher Scientific</td><td>BP160-100</td><td></td></tr> SiRNA <tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1302-10</td><td></td></tr><tr><td>marcado com Dy547</td><td>GE Healthcare Dharmacon, Inc.</td><td>fluoróforo de pedido personalizado</td><td>conjugado a lâmina de microscópio de fio de fim de sentido de 5'</td></tr><tr><td>Fisher</td><td>Scientific</td><td>12-550-A3</td><td>vidro pré-limpo</td></tr><tr><td>Espaçador de vedação segura</td><td>Life Technologies</td><td>S24735</td><td>adesivo dupla face</td></tr><tr><td>LSM 780&nbsp;</td><td>Microscópio confocal</td> <td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td></tr><tr><td>ZEN 2010</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>FCS software de análise</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>N/A</td><td>linguagem de programação</td></tr><tr><td>NIH/3T3 cells&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-1658</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Mediatech</td><td>10-013-CV</td><td>meio de crescimento</td></tr><tr><td>fetal bovino</td><td>Mediatech</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>penicilina-estreptomicina</td> inativada por calor <td>Mediatech</td><td>&nbsp; 30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 6 poços</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>11058021</td><td>meios de transfecção</td></tr></tbody></table>

predicando silenciamento de genes através do controle spatiotemporal da liberação de sirna de nanocarriers poliméricos com fotos

Predicting Gene Silencing Through the Spatiotemporal Control of siRNA Release from Photo-responsive Polymeric Nanocarriers

São necessários novos materiais e métodos para controlar melhor a ligação e a liberação de ácidos nucleicos para uma ampla gama de aplicações que requerem uma regulação precisa da atividade gênica. Em particular, os novos materiais responsivos aos estímulos com controle espaciotemporal melhorado sobre a expressão gênica destravam plataformas traduzíveis em tecnologias de descoberta de drogas e medicina regenerativa. Além disso, uma capacidade aprimorada para controlar a liberação de ácido nucleico a partir de materiais permitiria o desenvolvimento de métodos simplificados para prever a eficácia do nanocarrier a priori , levando a triagem acelerada dos veículos de entrega. Aqui, apresentamos um protocolo para prever a eficiência de silenciamento gênico e alcançar o controle espaciotemporal sobre a expressão gênica através de um sistema nanocarrier modificador fotossensível modular. O pequeno ARN de interferência (siRNA) é complexado com mPEG- b- poli (metacrilato de 5- (3- (amino) propoxi) -2-nitrobenzilo) (mPEG- b- P (APNBMA)) paraRm estabilidade nanocarriers que podem ser controlados com luz para facilitar sintonizável, on / off siRNA libertação. Descrevemos dois ensaios complementares que utilizam espectroscopia de correlação de fluorescência e eletroforese em gel para a quantificação precisa da liberação de siRNA a partir de soluções que imitam ambientes intracelulares. As informações obtidas a partir desses ensaios foram incorporadas em um modelo cinético simples de RNAi (RNAi) para prever as respostas de silenciamento dinâmico a várias condições de fotoestimulação. Por sua vez, essas condições de irradiação otimizadas permitiram o refinamento de um novo protocolo para controle espacial controlando o silenciamento gênico. Este método pode gerar padrões celulares na expressão de genes com resolução célula a célula e sem efeitos detectáveis ​​fora do alvo. Em conjunto, nossa abordagem oferece um método fácil de usar para prever mudanças dinâmicas na expressão gênica e controlar com precisão a atividade de siRNA no espaço e no tempo. Este conjunto de ensaios pode ser facilmente adaptado para testar uma grande variedade de otSeus sistemas responsivos ao estímulo para abordar os principais desafios pertinentes a uma multiplicidade de aplicações em pesquisa biomédica e medicina.

Após a formulação dos nanocarriers, os ensaios de libertação de siRNA foram conduzidos para informar as condições de irradiação a serem utilizadas nas transfecções in vitro . Várias doses de luz foram aplicadas para determinar a porcentagem de siRNA que foi liberado. O primeiro ensaio utilizou eletroforese em gel para separar as moléculas de siRNA gratuitas das moléculas de siRNA ainda complexas / associadas ao polímero. Nanocarriers que não foram tratados com luz permaneceram e...

Apresentamos um novo método que usa copolímeros de blocos foto-responsivos para um controle spatiotemporal mais eficiente do silenciamento gênico sem efeitos detectáveis ​​fora do alvo. Além disso, as mudanças na expressão gênica podem ser previstas usando ensaios diretos de liberação de siRNA e modelagem cinética simples.

Predicando silenciamento de genes através do controle Spatiotemporal da liberação de siRNA de Nanocarriers poliméricos com fotos

New materials and methods are needed to better control the binding vs. release of nucleic acids for a wide range of applications that require the precise ...

O objetivo geral desses métodos é permitir a previsão da eficiência do silenciamento gênico mediado por RNA de interferência de pequeno porte e facilitar o controle sobre os níveis resultantes de expressão proteica, de maneira espacial e temporal. Este método pode elucidar relações estrutura-função e veículos de liberação responsivos a estímulos. Obter um controle melhor sobre ligação versus liberação pode desbloquear plataformas traduzíveis e a descoberta de fármacos, bem como tecnologias em medicina regenerativa.As principais vantagens desta técnica são que as alterações na expressão gênica podem ser controladas e previstas com base em ensaios simples de liberação de siRNA e modelagem cinética. Embora esses métodos utilizem polímeros foto-responsivos inovadores, este conjunto de ensaios pode ser facilmente adaptado para testar uma grande variedade de outros sistemas responsivos a estímulos. Para começar, prepare uma solução de siRNA a 32 microgramas por mililitro, adicionando siRNA a uma solução de HEPES 20 micromolar com pH seis.Em seguida, prepare uma solução polimérica adicionando polímeros do bloco mPEG-poliAPN BMA dissolvidos a uma solução de HEPES 20 milimolar com pH 6. Para atingir uma concentração de 220 microgramas por mililitro, essa concentração resultará em uma razão N/P de quatro, o que significa que haverá quatro vezes mais grupos amina no polímero do que grupos fosfato no siRNA. A seguir, adicione a solução polimérica gota a gota a um volume igual da solução de siRNA, sob mistura suave em um vórtex.Continue a vórtex por 30 segundos após a adição do polímero. Em seguida, incube as amostras no escuro, à temperatura ambiente, por 30 minutos. Adicione a solução de STS a cada solução de nanocarreador gota a gota, sob mistura suave em um aparelho de vórtex.Continue a vórtex por 30 segundos após a adição de SDS. Centrifugue as amostras a 3.000 Gs por cinco segundos e, em seguida, incube as amostras no escuro à temperatura ambiente por 30 minutos. Calibre e configure um laser UV com filtro de 365 nanômetros para uma intensidade de 200 watts por metro quadrado.Em seguida, corte um orifício em uma junta de borracha, coloque a junta de borracha sobre uma lâmina de vidro lavada e seca. Pipete a solução de SDS de nanocarreadores sobre a lâmina de vidro, dentro do orifício da junta de borracha. Aplique um excesso de solução sobre a lâmina de vidro, evitando o contato com a junta de borracha.Coloque a segunda lâmina de vidro sobre a junta da lâmina. Para evitar a formação de bolhas de ar, apoie uma das extremidades da lâmina primeiro e, em seguida, abaixe lentamente a outra extremidade. Prenda clipes de papel em cada lado da câmara de vidro para mantê-la fechada.Irradie as amostras pelo tempo desejado, utilizando o laser UV com o filtro de 365 nanômetros em uma intensidade de 200 watts por metro quadrado. Remova os clipes de papel e abra a câmara. Em seguida, pipete 25 microlitros das amostras de SDS de nanocarregadores irradiados para tubos de microcentrífuga.Incube as soluções no escuro, à temperatura ambiente, por 30 minutos. Adicione cinco microlitros da solução de tampão de carregamento a 25 microlitros de cada amostra de nanocarreador SDS. Incube as amostras no escuro, à temperatura ambiente, por 10 minutos.Em seguida, carregue 30 microlitros de cada amostra de nanocarreador SDS em um gel de agarose a 2%, previamente corado com brometo de etídio. Execute o gel no escuro a 100 volts por 30 minutos. Imagem o gel utilizando um sistema de imagem de gel com filtros para brometo de etídio.Salve os arquivos de imagem do gel e prossiga para a quantificação da intensidade da banda conforme descrito no protocolo textual. Remova os pedaços de papel de um espaçador adesivo dupla face para expor a superfície adesiva. Afixe o espaçador a uma lamínula de vidro.Pipete a solução de SDS do nanocarreador sobre a lamínula. Em seguida, posicione uma lâmina de vidro pré-lavada sobre a lamínula, com o orifício do espaçador adesivo centralizado ao redor da amostra. Pressione a lâmina de vidro para garantir que ela e a lamínula estejam bem aderidas e formem um selo.Utilize um microscópio confocal com uma objetiva imersa em água de 40 vezes, acromática, com abertura numérica de 1,2 para medições de FCS. Use o canal apropriado do laser de excitação para coletar pelo menos 30 medições de 10 segundos cada, por amostra. Em seguida, insira os dados de liberação de siRNA provenientes da FCS em um modelo cinético para prever respostas de silenciamento gênico, conforme detalhado no protocolo textual.Para preparar a entrega in vitro de siRNA, adicione primeiro dois mililitros de suspensão celular a cada poço de uma placa de seis poços. Deixe as células aderirem e recuperarem por 24 horas no incubador. Após lavar as células com solução salina tamponada com fosfato, prepare-as para a transfeção adicionando 1,5 mililitro de meio de transfeção livre de soro e antibiótico.Em seguida, adicione 25 microlitros de solução de nanocarreador, contendo 30 picomoles de siRNA a cada poço. Pipete suavemente o meio para cima e para baixo para misturar. Coloque as células no incubador por três horas.Remova o meio de transfeção e lave cada poço com PBS. Em seguida, adicione um mililitro de meio de crescimento suplementado e coloque as células no incubador para recuperação por 30 minutos. Para preparar as células para o tratamento com um estímulo fotônico, remova o meio de crescimento suplementado.Em seguida, adicione um mililitro de meio de transfeção a cada poço. Após calibrar o laser UV conforme descrito no protocolo textual, coloque as células em uma placa aquecida regulada em 37 graus Celsius. Remova a tampa da placa de seis poços.Irradie as células a partir da parte superior da placa pelo tempo desejado, utilizando o laser UV com filtro de 365 nanômetros em uma intensidade de 200 watts por metro quadrado. Remova o meio de transvecção e adicione dois mililitros de meio de crescimento suplementado. Coloque as células no incubador até a análise posterior.Para preparar uma máscara fotográfica que bloqueie completamente a luz de 365 nanômetros e minimize reflexos, primeiro corte, perfure e/ou usine a forma desejada na máscara fotográfica. Cole a máscara fotográfica na parte inferior da placa de seis poços, com o padrão centralizado no poço contendo as células e o lado antirreflexo voltado para a placa. Monte dois tripés a aproximadamente 25 metros de distância um do outro e fixe uma plataforma em cada tripé, de modo que as plataformas fiquem na mesma altura.Suspenda a placa de células entre os dois suportes, apoiando a placa sobre as plataformas. Irradie as células a partir da parte inferior da amostra pelo tempo desejado, utilizando um laser UV com filtro de 365 nanômetros, com intensidade de 200 watts por metro quadrado. Remova o meio de transvecção e adicione dois mililitros de meio de crescimento suplementado.Em seguida, coloque as células no incubador para recuperação por pelo menos 24 horas. Obtenha imagens das células utilizando microscopia de fluorescência conforme descrito anteriormente. Aqui é mostrado um exemplo de modelagem cinética simples da dinâmica de silenciamento gênico.O modelo foi executado para prever as concentrações de mRNA, proteína e siRNA, como função do tempo após a liberação fotoinduzida de siRNA. As quantidades relativas de siRNA liberadas após diferentes doses de luz foram inseridas como concentração inicial de siRNA no modelo cinético. As previsões resultantes do modelo para os níveis de expressão proteica estavam de acordo com os níveis de expressão determinados experimentalmente por meio de western blotting.Para visualização, células que expressavam GFP foram tratadas com siRNA direcionado ao GFP e uma máscara fotográfica anular foi colocada sobre a placa antes da irradiação, a fim de gerar um padrão circular. As células que foram protegidas da luz exibiram intensidade de fluorescência indistinguível das amostras controle não tratadas com siRNA e luz. No entanto, quase todas as células dentro do padrão circular não exibiram expressão de GFP, indicando liberação eficiente do siRNA e silenciamento gênico.Além disso, o uso de luz é um gatilho que permite a expressão gênica, a ser controlada em escalas de comprimento celular. Em resumo, este método permite a determinação rápida de condições de irradiação para controlar espacial e temporalmente a liberação de siRNA e prever a silenciamento gênico a priori. A utilização deste protocolo ajudará a elucidar as relações estrutura-função que regem a estabilidade e eficácia de nanocarreadores.Essa técnica pode viabilizar aplicações na medicina regenerativa que exigem controle espacial e temporal sobre a expressão gênica. Essas formulações também são adequadas para o tratamento de distúrbios localizados, como câncer de pele, bem como distúrbios dermatológicos.

predicting-gene-silencing-through-spatiotemporal-control-sirna

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

RNA de interferência (RNAi) possui muitas vantagens sobre knockout do gene e tem sido amplamente utilizada como uma ferramenta em estudos de genes funcionais. A invenção da tecnologia de RNAi DNA vector baseado fez a longo prazo e knockdown induzível gene possível, e também aumentou a viabilidade de silenciamento do...

DNA Vector baseado em RNA de interferência para estudar a função Gênica em Câncer

Este vídeo demonstra o uso de pequenos RNAs interferentes (siRNA) para silenciar genes específicos de interesse em células-tronco neurais e diferenciá-los em tipos de células desejados usando o meio de diferenciação apropriado. Este procedimento permite o estudo do papel crítico de genes específicos no processo de diferenciação de células-tronco neurais.

Silenciamento de genes mediado por siRNA em células-tronco neurais

Repetidas injeções de retro-orbital dos complexos liposomes/siRNA/ITSN-1s catiônicos em camundongos, a cada 72 horas por 24 dias, entregar eficientemente o duplex siRNA para a microcirculação do pulmão do rato reduzindo mRNA ITSN-1s e expressão da proteína em 75%. Esta técnica é altamente reprodutível num modelo animal, não tem efeitos adversos e evita mortes.

Silenciando a longo prazo de Intersectin-1s nos pulmões do rato por entrega repetida de um siRNA específico via lipossomos catiônicos. Avaliação dos efeitos Knockdown por microscopia eletrônica

Entrega continua a ser o principal desafio para a aplicação terapêutica de RNA de interferência pequeno (siRNA). Este protocolo envolve a utilização de uma plataforma de entrega de siRNA multifuncional e biocompativel, que consiste de arginina e polietilenoimina enxertado micropartículas de silício poroso.

Porous Silicon micropartículas para entrega de siRNA Therapeutics

Aqui, descrevemos um processo para a inibição da função do gene em vectores mosquitos doença através do uso de quitosano / interferindo nanopartículas de RNA que são ingeridos pelas larvas.

A quitosana / RNA de interferência Nanoparticle Mediated silenciamento gênico na Doença Vector Mosquito Larvas

Continua a ser um grande desafio para desenvolver condicional gene nocaute ou eficaz knockdown do gene-em órgãos adultos do zebrafish. Aqui nós relatamos um protocolo para desempenho siRNA nanoparticle-mediada silenciamento no coração de adultos do zebrafish, proporcionando assim um novo método de perda-de-função para estudar órgãos adultos no zebrafish e outros organismos-modelo.

SiRNA Nanoparticle-mediada-silenciamento no coração de Zebrafish adulto

Nós descrevemos um método de usar polyethyleneimine (PEI)-revestido de nanopartículas de óxido de ferro superparamagnético para macrófagos transfecting com siRNA. Essas nanopartículas podem eficientemente entregar siRNA expressão macrófagos gene-alvo em vitro e in vivo e silêncio.

Nanopartículas de óxido de ferro revestido de Polyethyleneimine como um veículo para a entrega de RNA de interferência pequeno para macrófagos In Vitro e In Vivo

Demonstramos a síntese de nanopartículas de silício poroso fusogenic para entrega efectiva do oligonucleotide in vitro e in vivo. Nanopartículas de silício poroso são carregadas com siRNA para formar o núcleo, que é revestido por fusogenic lipídios através da extrusão para formar o reservatório. Direcionamento functionalization moiety e caracterização de partículas estão incluídos.

Síntese e caracterização de nanopartículas de silício poroso de Fusogenic para a entrega do Oligonucleotide Functionalization

São apresentados métodos para preparar e caracterizar as propriedades físico-químicas e a bioatividade de nanopartículas de siRNA com carga neutra e pH responsivo. Os critérios para nanomedicinas bem sucedidas de siRNA tais como o tamanho, a morfologia, a carga de superfície, o carregamento de siRNA, e o silenciamento do gene são discutidos.

Preparação de nanopartículas poliméricos neutralmente carregadas e responsivas ao pH para entrega de siRNA citosólica

Aqui, apresentamos um protocolo para a seleção in vitro de repressores transcricionais projetados (ETRs) com alta, longa duração, estável, eficiência de silenciamento no alvo e baixa atividade fora do alvo em todo o genoma. Esse fluxo de trabalho permite reduzir um repertório inicial e complexo de ETRs candidatos a uma lista curta, adequada para avaliação adicional em cenários terapeuticamente relevantes.

In vitro Seleção de Repressores Transcricionais Projetados para Silenciamento Epigenético Direcionado

Descubra como prever o silenciamento de genes usando copolímeros fotossensíveis e modelagem cinética. Este método permite o controle espaciotemporal da expressão proteica sem efeitos off-target, com aplicações em descoberta de medicamentos e medicina regenerativa.

Predicando silenciamento de genes através do controle Spatiotemporal da liberação de siRNA de Nanocarriers poliméricos com fotos (Vídeo) | JoVE Journal

Predicando silenciamento de genes através do controle Spatiotemporal da liberação de siRNA de Nanocarriers poliméricos com fotos

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