Predicando silenciamento de genes através do controle Spatiotemporal da liberação de siRNA de Nanocarriers poliméricos com fotos

O objetivo geral desses métodos é não permitir a previsão de pequenas eficiências de silenciamento de genes mediadas por RNA interferente e facilitar o controle sobre os níveis de expressão de proteínas resultantes, de maneira espaço-temporal. Este método pode elucidar estrutura, função, relações e estímulos responsivos a veículos de entrega. Obter melhor controle sobre a ligação versus liberação pode desbloquear plataformas traduzíveis e descoberta de medicamentos, bem como tecnologias de medicina regenerativa.

As principais vantagens desta técnica são que as mudanças na expressão gênica podem ser controladas e previstas na base como um simples, ensaios de liberação de siRNA e modelagem cinética. Embora esses métodos empreguem novos polímeros fotorresponsivos, esse conjunto de ensaios pode ser prontamente adaptado para testar a ampla variedade de outros sistemas responsivos a estímulos. Para começar, prepare uma solução de siRNA de 32 microgramas por mililitro, adicionando siRNA a uma solução HEPES de 20 micromolares em pH seis.

Em seguida, prepare uma solução de polímero adicionando polímeros poliAPN BMA em bloco mPEG dissolvidos a uma solução HEPES de 20 milimolares em pH seis. Para atingir uma concentração de 220 microgramas por mililitro, essa concentração resultará em uma proporção de N para P de quatro, o que significa que haverá quatro vezes mais grupos amina no polímero do que grupos fosfato no siRNA. Em seguida, adicione a solução de polímero gota a gota a um volume igual da solução de siRNA, enquanto mistura suavemente em uma máquina de vórtice.

Continue a vórtice por 30 segundos após a adição do polímero. Em seguida, incube as amostras no escuro à temperatura ambiente por 30 minutos. Adicione a solução STS a cada solução nanocarreadora gota a gota enquanto mistura suavemente em uma máquina de vórtice.

Continue a vórtice por 30 segundos após a edição do SDS. Centrifugar as amostras a 3 000 Gs durante cinco segundos e, em seguida, incubar as amostras no escuro à temperatura ambiente durante 30 minutos. Calibre e defina um laser UV com um filtro de 365 nanômetros para uma intensidade de 200 watts por metro quadrado.

Em seguida, faça um furo em uma junta de borracha, coloque a junta de borracha em uma lâmina de vidro lavada e seca. Pipetar a solução de SDS nanocarreadora na lâmina de vidro no interior do orifício da junta de borracha. Coloque um excesso de solução na lâmina de vidro, evitando o contato com a junta de borracha.

Coloque a segunda lâmina de vidro em cima da junta deslizante. Para evitar a formação de bolhas de ar, coloque uma extremidade do slide primeiro para baixo e, em seguida, abaixe lentamente a outra extremidade. Prenda os clipes de fichário em cada lado da câmara de vidro para mantê-la fechada.

Irradiar as amostras pelo período de tempo desejado, usando o laser UV com o filtro de 365 nanômetros a uma intensidade de 200 watts por metro quadrado. Remova os clipes de fichário e abra a câmara. Em seguida, pipete 25 microlitros das amostras de SDS nanocarreadoras irradiadas em tubos de microcentrífuga.

Incubar as soluções no escuro à temperatura ambiente durante 30 minutos. Adicione cinco microlitros da solução tampão de carga a 25 microlitros de cada amostra de SDS nanocarreadora. Incubar as amostras no escuro à temperatura ambiente durante 10 minutos.

Em seguida, carregue 30 microlitros de cada amostra de SDS nanocarreadora em um gel de agarose a 2%, pré-corado com brometo de etídio. Execute o gel no escuro a 100 volts por 30 minutos. Imagem do gel, usando um sistema de imagem de gel com filtros de brometo de etídio.

Salve os arquivos de imagem de gel e prossiga para a quantificação da intensidade de curvatura conforme descrito no protocolo de texto. Remova os pedaços de papel de um espaçador adesivo de dupla face para expor a superfície adesiva. Prenda o espaçador a uma lamínula de vidro.

Pipetar a solução de SDS nanocarreadora para a lamínula. Em seguida, coloque uma lâmina de vidro pré-lavada em cima da lamínula com o orifício do espaçador adesivo, centralizado ao redor da amostra. Empurre a corrediça de vidro para garantir que a corrediça de vidro e a lamínula estejam bem presas e formem uma vedação.

Use um microscópio confocal com uma objetiva apercromal imersiva em água 40 vezes, com uma abertura numérica de 1,2 para medições FCS. Use o canal de laser de excitação apropriado para coletar pelo menos 30 medições de 10 segundos cada, por amostra. Em seguida, insira os dados de liberação de siRNA do FCS em um modelo cinético para prever as respostas de silenciamento de genes, conforme detalhado no protocolo de texto.

Para preparar a entrega de siRNA in vitro, primeiro adicione dois mililitros de suspensão celular a cada poço da placa de seis poços. Deixe as células aderirem e se recuperarem por 24 horas na incubadora. Depois de lavar as células com solução salina tamponada com fosfato, prepare-as para a transvecção adicionando 1,5 mililitros de soro e meio de transvecção livre de antibióticos.

Em seguida, adicione 25 microlitros de solução nanocarreadora, contendo 30 picomoles de siRNA tp cada poço. Pipete suavemente o meio para cima e para baixo para misturar. Coloque as células na incubadora por três horas.

Remova o meio de transvecção e lave cada poço com PBS. Em seguida, adicione um mililitro de meio de crescimento suplementado e coloque as células na incubadora para se recuperar por 30 minutos. Para preparar as células para o tratamento com um fotoestímulo, remova o meio de crescimento suplementado.

Em seguida, adicione um mililitro de meio de transvecção a cada poço. Depois de calibrar o laser UV conforme descrito no protocolo de texto, coloque as células em uma placa quente ajustada para 37 graus Celsius. Remova a tampa da placa de seis poços.

Irradie as células de cima da placa pelo tempo desejado, usando o laser UV com um filtro de 365 nanômetros a uma intensidade de 200 watts por metro quadrado. Remova o meio de transvecção e adicione dois mililitros de meio de crescimento suplementado. Coloque as células na incubadora até uma análise mais aprofundada.

Para preparar uma máscara fotográfica que bloqueie completamente a luz de 365 nanômetros e minimize os reflexos, primeiro corte, perfure e/ou usine a forma desejada na máscara fotográfica. Cole a máscara fotográfica no fundo da placa de seis poços, com o padrão centralizado no poço que contém as células e o lado antirreflexo voltado para a placa. Monte dois suportes de anel a aproximadamente 25 metros de distância e destaque uma plataforma para cada suporte de anel, de modo que as plataformas tenham a mesma altura.

Suspenda a placa celular entre os dois suportes apoiando a placa no topo das plataformas. Irradie as células por baixo da amostra pelo tempo desejado, usando um laser UV com um filtro de 365 nanômetros, a uma intensidade de 200 watts por metro quadrado. Remova o meio de transvecção e adicione dois mililitros de meio de crescimento suplementado.

Em seguida, coloque as células na incubadora para se recuperar por pelo menos 24 horas. Visualize as células usando microscopia de fluorescência conforme descrito anteriormente. Mostrado aqui, é um exemplo de modelagem cinética simples da dinâmica de silenciamento de genes.

O modelo foi executado para prever as concentrações de mRNA, proteína e siRNA, em função do tempo após a liberação de siRNA fotoinduzida. As quantidades relativas de siRNA liberadas após diferentes dosagens de luz foram inseridas como a concentração inicial de siRNA no modelo cinético. As previsões do modelo resultante para os níveis de expressão da proteína foram uma concordância com os níveis de expressão determinados experimentalmente obtidos por western blotting.

Para visualização, as células que expressam GFP foram tratadas com GFP direcionada ao siRNA e uma máscara fotográfica anular foi colocada na placa antes da irradiação para gerar um padrão circular. As células que foram protegidas da luz exibiram intensidade de fluorescência indistinguível das amostras de controle não tratadas com siRNA e luz. No entanto, quase todas as células dentro do padrão circular não exibiram expressão de GFP, indicando liberação eficiente de siRNA e knockdown de genes.

Além disso, o uso da luz é um gatilho habilitado para a expressão gênica, a ser controlada em escalas de comprimento celular. Em resumo, este método permite a determinação rápida das condições de irradiação para controlar espaço-temporalmente a liberação de siRNA e prever o silenciamento gênico a priori. O emprego deste protocolo ajudará a elucidar as relações estrutura-função que governam a estabilidade e eficácia do nanocarreador.

Essa técnica pode permitir aplicações em medicina regenerativa que requerem controle espaço-temporal sobre a expressão gênica. Essas formulações também são adequadas para o tratamento de distúrbios localizados, como câncer de pele, bem como distúrbios dermatológicos.