Preparação em média Drosophila Extractos de embrião para experiências proteômicas

O objetivo geral deste experimento é fornecer uma abordagem direta e barata para coletar embriões de Drosofilia em escala média. E preparação de extratos de proteínas que podem ser usados em aplicações proteômicas a jusante, como espectrometria de massa de purificação de afinidade. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos da sinalização celular e da biologia do desenvolvimento.

Por exemplo, como proteínas específicas e interações proteicas realizam a comunicação celular durante o desenvolvimento do organismo. A principal vantagem desta técnica é que é um método fácil e barato para gerar um embrião de Drosophila Lysis. Que pode ser usado para aplicações a jusante, como purificação de afinidade de proteínas.

Tradicionalmente, os pesquisadores coletavam embriões de Drosophila em gaiolas populacionais muito grandes. Mas apresentamos um procedimento amigável para coletar embriões em gaiolas de tamanho médio que podem ser facilmente instaladas em qualquer laboratório. Depois de preparar recipientes de cinco litros e cortar quadrados de malha de náilon de 25 por 25 centímetros, de acordo com o protocolo de texto, coloque a tela sobre o recipiente e pressione com a tampa.

Certifique-se de que a malha esteja apertada e a tampa não esteja inclinada. A gaiola agora está pronta para ser povoada por moscas. Após a preparação de potes de plástico de um litro e quadrados de malha de náilon de 18 por 18 centímetros, coloque a malha sobre a borda superior do frasco e aperte a tampa para apertar.

Certifique-se de que a malha esteja apertada e a tampa não esteja inclinada. Amplificar as linhagens de moscas transgênicas carregam a proteína tipada de interesse. E transfira as garrafas a cada dois dias até que 25 a 30 garrafas sejam acumuladas para cada linha de mosca.

Amplifique uma ação de controle de maneira semelhante. Em seguida, aqueça os pratos de suco de maçã em temperatura ambiente. Em seguida, usando um dedo enluvado, espalhe um pouco de pasta de fermento úmida no centro das placas.

Fazendo um círculo de aproximadamente seis centímetros para uma placa de 15 centímetros. E um círculo de quatro centímetros para uma placa de 10 centímetros. Depois de anestesiar as moscas e transferi-las para as gaiolas preparadas com a malha voltada para baixo, cubra as gaiolas com pratos de suco de maçã.

Permita que as moscas acordem. Em seguida, vire as gaiolas e incube as moscas em temperatura ambiente por dois a três dias. Troque as placas duas vezes por dia, virando a gaiola de cabeça para baixo e, enquanto segura a placa na gaiola, retire a fita da placa.

Bata suavemente em toda a gaiola no banco e troque rapidamente a placa antiga por uma nova, tentando não permitir que as moscas escapem. Permita que as moscas coloquem embriões em pratos de suco de maçã fresco durante a noite ou por qualquer outro período de tempo desejado. Na manhã seguinte, marque e pese os recipientes de malha para coleta de embriões.

Um para cada linha de mosca usada. Prepare 1x tampão de lise em um tubo de 50 mililitros usando reagentes previamente feitos, adicionando 40 mililitros de água a 10 mililitros de tampão de lise concentrado 5x em um tubo de 50 mililitros. Adicione 50 microlitros de um molar DTT a uma concentração final de um mili molar.

Misture bem e divida a solução entre dois tubos de 50 mililitros. A um dos tubos, adicione um comprimido inibidor de protease. E coloque o tubo em um rotador a quatro graus Celsius por 30 minutos.

Enquanto o comprimido está se dissolvendo, comece a coletar os embriões marcando as placas de suco de maçã nas gaiolas, com os genótipos de linhagens de moscas usados. E troque os pratos por novos. Adicione água suficiente para cobrir cada prato de suco de maçã.

Em seguida, com um pincel macio, desaloje suavemente os embriões da placa. Despeje os embriões no recipiente de malha previamente pesado e marcado e escorra o excesso de água. Em seguida, seque brevemente a malha em toalhas de papel para remover o excesso de água.

Para descorionar os embriões, encha até a metade uma placa de Petri de seis centímetros com 50% de alvejante. Em seguida, prepare duas placas de Petri maiores com água. Mergulhe o recipiente de malha com embriões, em 50% de alvejante por 90 segundos.

Bata suavemente na malha durante a incubação algumas vezes, para suspender os embriões na solução de alvejante. No final da incubação, use água para lavar o recipiente de malha em cada um dos dois pratos, por cerca de 10 segundos. Em seguida, use 18,2 megaohm centímetro de água em uma garrafa de esguicho, para enxaguar bem o recipiente de malha, incluindo as laterais e a parte externa.

Nenhum cheiro de alvejante deve ser detectado após uma lavagem completa. Seque o recipiente de malha em toalhas de papel. Em seguida, pese o recipiente de malha, com os embriões e subtraia o peso do recipiente vazio.

Registre o peso resultante dos embriões. Para preparar o extrato de embrião, adicione um mililitro de tampão de lise com inibidores de protease a um homogeneizador de vidro Dounce e mantenha-o no gelo. Em seguida, transfira os embriões do recipiente de malha para o homogeneizador.

Use um mililitro de tampão de lise para lavar os embriões restantes na malha. E adicione os embriões e tampão ao material no homogeneizador. Em seguida, deixe os embriões assentarem no fundo do homogeneizador e aspire cuidadosamente o sobrenadante.

Em seguida, adicione o tampão de lise com inibidores de protease ao homogeneizador, visando cinco a seis mililitros de tampão de lise por grama de embriões. Em seguida, insira um pilão solto para homogeneizar os embriões com quatro a seis pinceladas. Durante os primeiros golpes, haverá mais resistência.

Tente mover o pilão em movimentos contínuos, para evitar respingos na solução. Em seguida, mude para um pilão bem ajustado. E homogeneizar os embriões com oito a 10 pinceladas.

Incube o homogeneídeo no gelo por 20 minutos. Em seguida, transfira o homogeneídeo para tubos de microcentrífuga. E centrifugue a 13.000 vezes G e quatro graus Celsius por 15 minutos.

Evitando os pellets na camada lipídica superior, transfira os sobrenadantes para tubos de microcentrífuga novos no gelo. Depois de repetir a centrificação, use uma ponta de um mililitro para coletar cuidadosamente os sobrenadantes. E transfira-os para seringas geladas de 10 mililitros, com filtros de 045 micrômetros conectados.

Empurre toda a solução para tubos de microcentrífuga de dois mililitros rotulados no gelo. Congele as amostras em nitrogênio líquido e armazene-as a 80 graus Celsius negativos. Ou use imediatamente para experimentos de purificação de proteínas.

Usando o protocolo descrito neste vídeo, os lisados foram preparados a partir de embriões de Drosophila expressando ubiquamente a proteína EGFP-ERK, sob controle do promotor braço-odilho. A expressão da proteína foi confirmada por Western Blotting para a proteína ERK total para detectar simultaneamente os níveis de EGFP-ERK endógeno e transgênico, migrando a 42 kilodaltons e 69 kilodaltons respectivamente. Uma única banda, correspondente a ERK endógena não marcada, foi detectada na linha de controle branca amarela, confirmando uma extração bem-sucedida de ERK e EGFP-ERK de embriões.

Para testar se o protocolo de extração é adequado para posterior purificação de proteína marcada, extratos das moscas amarela, branca e braço-EGFP-ERK, foram submetidos à purificação por afinidade, usando GFP Agarose Beads. A coloração de prata das amostras executadas em um gradiente SDS-PAGE, mostra a purificação bem-sucedida da proteína isca EGFP-ERK. Além do EGFP-ERK, a pista experimental continha bandas adicionais, não observadas na amostra controle, sugerindo que a purificação recuperou potenciais proteínas de interação com ERK.

Uma vez dominado, a coleta de embriões e as etapas de extração podem ser feitas em aproximadamente duas horas. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de executar as etapas de extração no gelo. E usar inibidores de protease para minimizar a degradação de proteínas.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como configurar gaiolas populacionais de Drosophila em média escala. E faça extratos de proteínas de células inteiras de embriões.