Métodos para a extração de endossimbiontes da mosca branca Bemisia tabaci

O objetivo geral deste experimento é extrair endossimbiontes de minúsculos insetos para novos experimentos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na visão entomologia e macrobiológica porque a maioria dos endossimbiontes não pode ser cultivada in vitro. O método mostra que isolar quantidades adequadas de bactérias para experimentos posteriores são muito importantes.

A principal vantagem desta técnica é que podemos isolar convenientemente os endossimbiontes bacterianos da mosca-branca. Isso também pode ser aplicado ao isolamento de endossimbiontes de outros insetos, como pulgões, funis e tripes. Para começar, colete uma mosca-branca adulta individual e homogeneize-a em 30 microlitros de tampão de lise.

Incubar o homogeneizado a 65 graus Celsius durante uma hora. Em seguida, 100 graus Celsius por 10 minutos. Usando DNA de mosca-branca e primers mitocondiais de citocromo oxidase 1, prepare reações de PCR de 25 microlitros usando os seguintes reagentes.

Em seguida, execute as reações de PCR usando o programa mostrado aqui. Em seguida, use um kit de extração de gel de DNA seguindo o protocolo recomendado para limpar o produto de PCR. Em seguida, execute a análise de sequência de acordo com o protocolo de texto.

Para amplificar genes específicos de cada endossimbionte dentro da mosca-branca, faça PCR no DNA da mosca-branca. De acordo com um protocolo publicado anteriormente, submeta a amostra amplificada à eletroforese e sequenciamento em gel de agarose para determinar as espécies bacterianas dentro da mosca-branca e identificar o gene específico de cada bactéria. Para dissecar e purificar o bacterioma da mosca-branca, adicione 100 microlitros de 1x solução PBS em uma lâmina de microscópio.

Em seguida, escolha ninfas de terceiro ou quarto ínstar de folhas de algodão. E mergulhe-os no PBS. Sob um microscópio, use agulhas entomológicas finas para retirar os bacteriomas do corpo da mosca-branca.

Tenha cuidado ao isolar o bacterioma, pois é pequeno e frágil. Faça um furo em um lado da ninfa e pressione levemente o outro lado para soltar os bacteriomas. Em seguida, monte um microcarregador de 20 microlitros em uma pipeta de 0,5 a 10 microlitros e extraia o bacterioma individual do PBS para o microcarregador.

Lave o bacterioma para eliminar a contaminação de outros tecidos da mosca-branca, canalizando o bacterioma para o PBS e extraindo-o. Repita a lavagem três vezes. Repetir a lavagem é altamente recomendado para eliminar o máximo de contaminação possível.

Pipetar imediatamente o bacterioma lavado para um tubo de centrífuga contendo 60 microlitros de PBS. Seringa filtre o bacterioma montado através de uma membrana de filtro de cinco micrômetros. Repita a filtração várias vezes para mover completamente o líquido misturado através da membrana.

Para amplificar o filtrado, prepare o tampão D2 para ser usado com o protocolo recomendado para amplificação de DNA genômico do sangue ou células com algumas modificações. Adicione diretamente 1,5 microlitros de filtrado a um tubo de centrífuga seguido por 1,5 microlitros de tampão D2. Misture bem e incube a amostra no gelo por 10 minutos. Em seguida, adicione 1,5 microlitros de solução de parada.

Adicione 15 microlitros do tampão de reação e um microlitro de DNA polimerase e misture suavemente. Incube a mistura a 30 graus Celsius por 16 horas, seguida de 65 graus Celsius por três minutos. Realizar PCR diretamente no filtrado amplificado utilizando primários específicos concebidos para bactérias para confirmar as espécies de bactérias.

Realize também PCR para confirmar se há contaminação do genoma do hospedeiro usando primers para os genes beta-actina e EF1 da mosca-branca de acordo com o método publicado anteriormente. Por fim, realizar o sequenciamento do metagenoma de acordo com o protocolo de texto. Nesta figura, são mostrados o algodão para a criação de moscas-brancas e vários estágios de desenvolvimento das moscas-brancas.

Incluindo um adulto e ninfas de primeiro, segundo e quarto ínstar. A análise FISH dos endossimbiontes Portiera e Hamiltonella dentro da ninfa do quarto ínstar de MEAM1 é mostrada aqui. A sobreposição das duas bactérias é observada e ambas estão confinadas aos bacteriócitos da mosca-branca.

Aqui estão as imagens de microscopia eletrônica de transmissão do endossimbionte Portiera da mosca-branca, indicando que Portiera pode perder sua parede celular. Após o sequenciamento e limpeza dos dados de contaminação para adaptadores e duplicações, o genoma completo do simbionte obrigatório Portiera foi adquirido. Resultando em um genoma circular de 358.232 pares de bases.

Além disso, foi obtido um rascunho do genoma de Hamiltonella que incluía 138 contigs que foram montados em 89 andaimes com base em relações de extremidade emparelhadas. Uma vez dominado, esta técnica pode ser feita em 20 horas se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter as amostras longe da contaminação das bactérias ambientais.

Após este procedimento, outras análises, como a sequência de RA e o bacterioma de massa, podem ser realizadas para responder a perguntas adicionais, como a expressão gênica e o metabolismo do endossimbionte. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para que os pesquisadores da área de entomologia e microbiologia explorassem a função dos endossimbiontes em insetos ou artrópodes. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como extrair simbiontes de bactérias de insetos.

Não se esqueça de que trabalhar com alguns dos reagentes pode ser perigoso e as precauções, como o uso de luvas, devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.