Microscopia fotoacústica de resolução acústica e óptica comutável para In Vivo Imagem de Vasculatura de Sangue de Pequeno Animal

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar um sistema de microscopia fotoacústica de resolução acústica e óptica comutável para imagens in vivo de vasculatura sanguínea de pequenos animais. A microscopia fotoacústica é uma modalidade de imagem in vivo de rápido crescimento que combina óptica e ultrassom, fornecendo profundidade de imagem além do caminho óptico com alta resolução. Este trabalho presente é um sistema microscópico fotoacústico de resolução óptica acústica comutável capaz de imagens de alta resolução em profundidade rasa, bem como imagens de tecidos profundos de baixa resolução da mesma amostra in vivo.

Demonstrando o procedimento estarão o Dr. Mohesh Moothanchery, pesquisador do meu laboratório, e Arunima Sharma, estudante de doutorado do meu laboratório. Primeiro, construa um sistema de laser sintonizável de nanossegundos a partir de um laser Nd:YAG de estado sólido bombeado por diodo e um laser ditunable com um alcance de 559 a 576 nanômetros. Defina o laser ditunable para 570 nan.

Monte em uma mesa óptica um tanque de acrílico com uma janela de imagem de polietileno de sete centímetros no chão do tanque. Fixe uma platina de imagem em um poste óptico abaixo da janela de imagem. Sobre o tanque, monte uma gaiola óptica contendo o sistema de imagem AR-OR-PAM em uma placa de comutação presa a um estágio de translação motorizado de três eixos controlado por computador.

Para configurar o sistema para AR-PAM, use um prisma de anjo direito montado em um estágio rotacional contínuo motorizado para direcionar o feixe através de um filtro de densidade neutra variável para um cabo de fibra multimodo com um acoplador de fibra de 25 NA. Conecte a saída de fibra a um estágio de tradução XY no sistema de imagem. Direcione o feixe através de uma lente plana convexa a 25 milímetros da saída e, em seguida, através de uma lente cônica para criar um feixe em forma de anel.

Focalize o feixe em forma de anel em um condensador óptico em torno de um transdutor ultrassônico de 50 megahertz com uma lente acústica montada na saída do transdutor. Em seguida, para configurar o sistema para OR-PAM, gire o primeiro prisma de ângulo reto em 90 graus para direcionar o feixe de laser através de uma íris, um filtro de densidade neutra variável, uma lente condensadora e um orifício definido a 75 milímetros da lente condensadora. Use um acoplador de fibra monomodo de 1 NA e uma fibra monomodo para enviar o feixe para o estágio de translação Z no sistema de imagem.

Direcione o feixe através de uma lente dupla acromática montada a 50 milímetros da saída da fibra. Desvie o feixe com um espelho cinemático, controlável e elíptico para uma segunda lente dupla acromática em um tubo de lente. Focalize o feixe em um prisma de ângulo reto separado por uma camada de óleo de silício de um prisma romboide, com uma lente acústica e um transdutor ultrassônico de 50 megahertz, que forma o cabeçote de varredura OR-PAM.

Antes de iniciar o alinhamento do sistema, encha os tanques de acrílico com água desgaseificada. Em seguida, use o estágio motorizado de três eixos para mover o conjunto de varredura sobre o tanque. Abaixe o conjunto até que as lentes acústicas de ambos os sistemas estejam submersas.

Ligue o laser. Conecte os transdutores de ultrassom a dois amplificadores de ganho fixo de 25 decibéis. Posicione o cabeçote de digitalização AR-PAM sobre a janela de imagem.

Coloque uma lâmina de vidro embrulhada em fita isolante preta no estágio de imagem e levante o palco para colocar o slide em contato com a janela de imagem. Ajuste a lente cônica até que a amplitude do sinal fotoacústico gerado a partir do slide atinja o máximo, indicando que as lentes ópticas e acústicas são confocais. Em seguida, mude manualmente para o sistema OR-PAM.

Ajuste a lente dupla acromática até que as lentes ópticas e acústicas estejam confocais, conforme indicado pela maximização da amplitude do sinal fotoacústico da lâmina coberta com fita. Para determinar a resolução lateral de cada sistema, primeiro coloque 1 mililitro de uma solução diluída de nanopartículas de ouro de 100 nanômetros em água em uma lamínula. Coloque a lâmina na platina de imagem.

e eleve o palco até que a solução de nanopartículas entre em contato com a janela de imagem. Mude o laser e o cabeçote de varredura para o sistema AR-PAM. Configure o software do instrumento para uma varredura AR-PAM e execute uma única varredura raster.

Repita esse processo para o sistema OR-PAM. Em seguida, remova a lâmina e limpe a janela de imagem com um cotonete embebido em álcool. Ajuste as funções de propagação de pontos determinadas a partir das imagens adquiridas a uma curva gaussiana.

A largura total na metade do máximo é a resolução lateral para o sistema de digitalização correspondente. Em seguida, para determinar a profundidade máxima de imagem no tecido, primeiro insira uma placa de metal afiada envolta em fita preta em uma pequena seção de tecido de frango em um ângulo raso. Coloque o lenço de papel no tanque de água sob a cabeça do scanner.

Obtenha uma única imagem de B-scan para cada sistema. Meça a profundidade abaixo da superfície do tecido na qual a fita preta não é mais claramente discernível. Antes da imagem, certifique-se de que a janela de imagem de polietileno e o estágio de imagem do animal estejam limpos.

Em seguida, obtenha um camundongo fêmea de 25 gramas e quatro semanas para o procedimento de imagem após anestesiar o camundongo. Remova os pelos da superfície da orelha com creme depilatório. Aplique pomada ocular estéril nos olhos do camundongo para evitar o ressecamento e bloquear os feixes de laser espalhados.

Coloque o mouse em um estágio de imagem com a placa para posicionar a orelha para mim fotografada. Monitore a condição fisiológica do mouse com um oxímetro de pulso preso à cauda ou perna do mouse. Aplique gel de ultrassom no ouvido a ser fotografado.

Levante lentamente o estágio de imagem para colocar suavemente o ouvido em contato com a janela de imagem de polietileno. Adquira varreduras raster AR-PAM e OR-PAM da orelha do camundongo, monitorando o estado fisiológico do camundongo por toda parte. Permita que o mouse se recupere totalmente após a geração de imagens.

O sistema de vasculatura sanguínea de um camundongo aqui foi fotografado in vivo com um sistema AR-OR-PAM comutável. Vasos sanguíneos com espessura superior a 45 micrômetros eram claramente visíveis na imagem AR-PAM. Capilares únicos de cerca de cinco micrômetros de largura foram resolvidos com imagens OR-PAM.

O sistema combinado AR-OR-PAM tem uma resolução lateral de aproximadamente quatro mícrons. E no ponto, imagens de quatro mm para o OR-PAM e uma resolução lateral de aproximadamente 45 micrômetros e imagens de 7,8 mm para o AR-PAM. O sistema combinado AR-OR-PAM comutável permite a geração de imagens sem mover a amostra entre diferentes sistemas de imagem.

O sistema desenvolvido pode ser usado para imagens pré-clínicas. As principais aplicações pré-clínicas incluem imagens de androgênese, microambientes tumorais, microcirculações, resposta a medicamentos, função cerebral, biomarcadores e atividades gênicas.