Fácil manipulação das arquiteturas em hidrogel à base de proteínas para aplicações de cultura de células

O objetivo geral desta metodologia é criar hidrogéis macroporosos com tamanhos de poros variados para aplicações de cultura de células. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da cultura de células 3D, como a viabilidade principal de um novo material de hidrogel para aplicações de cultura de células 3D. A principal vantagem dessa metodologia é que ela oferece uma variedade de técnicas para otimizar e ajustar um novo material às necessidades de diferentes tipos de células.

Para começar, dilua um miligrama do peptídeo RGD ou um peptídeo adesivo celular equivalente em 100 microlitros de água estéril para obter a solução de 10 miligramas por mililitro. Em seguida, remova o fundo de uma placa de 96 poços e substitua-a por filme plástico de remoção. Misture 100 microlitros de solução estoque BSA e 100 microlitros de solução estoque THPC na placa de 96 poços para obter 200 microlitros do hidrogel.

Misture os componentes pipetando para cima e para baixo pelo menos cinco vezes para garantir um hidrogel uniforme após a polimerização. Coloque a placa de 96 poços em temperatura ambiente por cerca de 10 minutos até que todos os hidrogéis estejam devidamente polimerizados. Após a polimerização, remova cuidadosa e lentamente o filme plástico do fundo da placa.

Pressione os hidrogéis para fora da placa de 96 poços usando uma pequena facada e transfira-os para tubos de 1,5 mililitro com PBS estéril pH 7,4. Armazene os hidrogéis em solução salina tamponada com fosfato a quatro graus Celsius por vários meses. Para liofilizar os hidrogéis, primeiro encha os tubos de 1,5 mililitro com 500 microlitros de água deionizada estéril e remova as tampas.

Transfira os hidrogéis para os tubos de reação de 1,5 mililitro usando uma pinça. Enrole os tubos de 1,5 mililitro firmemente com filme de parafina usando pelo menos três camadas para cada frasco. Use uma agulha para perfurar pequenos orifícios no filme para permitir a liberação de gás dos tubos.

Para garantir que a água e o hidrogel congelem completamente, transfira o frasco para injetáveis para uma solução de nitrogênio líquido por cinco minutos. Imediatamente após a remoção do nitrogênio líquido, transfira os frascos para o liofilizador para evitar que o material descongele. Como etapa alternativa de congelamento, mantenha os frascos a menos 20 graus Celsius durante a noite para congelar lentamente os hidrogéis.

Imediatamente após a remoção de menos 20 graus Celsius, transfira os frascos para o liofilizador para evitar que o material descongele. Após 24 horas e a evaporação completa da água dentro e ao redor do hidrogel, descongele o material removendo-o do liofilizador. Para lixiviação de partículas, misture os componentes do hidrogel como antes.

Após a mistura, adicione imediatamente cloreto de sódio até que ocorra a saturação. Adicione sal até que os cristais de sal possam ser vistos na solução como um precipitado branco. Os tamanhos dos poros podem ser alterados moendo os cristais de sal antes do uso.

Transfira a placa de 96 poços para um agitador e agite até que ocorra a polimerização. Após cerca de 10 minutos, remova os hidrogéis da placa como antes. Incubar os hidrogéis durante, pelo menos, 24 horas à temperatura ambiente em água estéril num rotador para eluir todo o sal do molde de hidrogel.

Armazene os hidrogéis a quatro graus Celsius em PBS por vários meses. Para uma formação suave, prepare hidrogéis conforme descrito. Em seguida, remova um hidrogel da solução usando uma pinça.

Retire o excesso de água com papel altamente absorvente e coloque-o em cima de um bloco de gelo seco. Congele o hidrogel por 30 segundos e remova-o cuidadosamente do bloco. Não danifique o hidrogel.

Use cuidadosamente uma espátula para raspá-lo do bloco. Transfira o hidrogel para um tubo de 1,5 mililitro e seque-o durante a noite a 37 graus Celsius. Prepare uma solução-mãe de rodamina B, bem como diluições em série, conforme descrito no protocolo de texto.

Remova o hidrogel da solução armazenada e transfira-o para um tubo de 1,5 mililitro com um mililitro de 0,01 miligrama por mililitro de solução de rodamina B. Manchar o hidrogel durante a noite em solução de rodamina B à temperatura ambiente. No dia seguinte, transfira o hidrogel que deve ser visualizado para 10 mililitros de PBS e lave por pelo menos três horas.

Corte pequenas fatias do hidrogel usando uma lâmina. Em seguida, transfira o hidrogel para uma lâmina microscópica de oito poços e cubra-o com PBS. Usando um microscópio confocal de varredura a laser, visualize o hidrogel em um comprimento de onda de 514 nanômetros.

Filtre estéril todas as soluções de estoque com um filtro de 0,45 mícron. Comece a preparação do hidrogel e inclua o peptídeo adesivo celular antes da polimerização do hidrogel. Depois de misturar os componentes, pipete imediatamente a mistura em uma lâmina microscópica de oito poços até que o fundo esteja completamente coberto.

Transfira as células para um meio de cultura de células DMEM estéril pré-aquecido suplementado com soro fetal bovino, estreptomicina de penicilina e solução de aminoácidos não essenciais. Depois de contar as células com uma câmara de contagem de Neubauer, pipete cuidadosamente 200 microlitros do número desejado de células na superfície do hidrogel. Cubra a lâmina microscópica de oito poços com uma tampa e transfira-a para uma incubadora.

Após pelo menos quatro horas de fixação celular, lave as células duas vezes com 200 microlitros de PBS de cultura de células estéreis. Em seguida, fixe as células com 200 microlitros de formaldeído a 3,7% por 10 minutos em temperatura ambiente e lave duas vezes com PBS. Permeabilize as células com 200 microlitros de 0,1% Triton X por cinco minutos antes de lavar mais duas vezes com PBS.

Manchar as células com Toluidina Rodamina misturando cinco microlitros de estoque metanólico com 195 microlitros de PBS e adicionando-o às células à temperatura ambiente. Pinte as células por 20 minutos no escuro antes de lavar duas vezes com PBS. Investigue as propriedades de adesão celular usando um microscópio confocal a 514 nanômetros.

Analise as propriedades do hidrogel conforme descrito no protocolo de texto. Como mostrado aqui, os hidrogéis polimerizados e corados não têm arquiteturas distintas. Após a liofilização dos hidrogéis em diferentes temperaturas, o tamanho médio dos poros dentro do hidrogel pode ser estendido até 60 mícrons.

A lixiviação de sal resulta em redes uniformes com tamanhos de poros de cerca de 10 mícrons. O tamanho pode ser ajustado ainda mais moendo cristais de sal antes do uso. O uso de uma abordagem de congelamento gradiente em um bloco de gelo seco leva à formação de canais com um diâmetro de cerca de 20 mícrons e um comprimento de várias centenas de mícrons.

Antes da funcionalização com a porção adesiva celular, as células não podem aderir à superfície do hidrogel e apresentam uma morfologia arredondada. Somente depois de fornecer o material com o peptídeo adesivo celular, as células encontram pontos de adesão focais que permitem uma adesão adequada da célula a um material. Isso é crucial para o uso de novos materiais em aplicações de cultura de células 3D.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como manipular a arquitetura de um hidrogel com métodos simples. Este método pode ser aplicado para a maioria dos novos sistemas de hidrogel para aprender sobre o uso em cultura de células e otimizar a arquitetura do hidrogel, dependendo do uso pretendido.