Patógeno de origem alimentar rastreio usando Nanosensor Magneto-fluorescente: Rápida detecção de Escherichia Coli O157: H7

O principal objetivo deste protocolo é projetar e sintetizar nanossensores bimodais capazes de detectar contaminantes bacterianos como E.coli O157:H7. Os nanossensores magnetofluorescentes são sintetizados pela funcionalização de nanopartículas de óxido de ferro por meio de um procedimento de duas etapas. Primeiro, os anticorpos direcionados são conjugados à superfície da nanopartícula.

Em seguida, o corante fluorescente é carregado em sua codificação. O emparelhamento dessas modalidades permite a detecção rápida e sensível de contaminantes bacterianos em soluções baixas e altamente concentradas. Na presença de uma pequena quantidade de bactérias, os nanossensores se aglomeram em torno das bactérias devido ao direcionamento dos anticorpos conjugados.

Esse enxame altera as interações do núcleo magnético dos nanossensores com os prótons de água circundantes, permitindo a detecção sensível de mudanças nos valores de relaxamento magnético. À medida que a concentração de contaminantes bacterianos nas soluções aumenta, o enxame diminui e a capacidade da modalidade magnética de quantificar a contaminação é reduzida. No entanto, à medida que a concentração bacteriana aumenta, também aumenta a submissão fluorescente dos bionanossensores.

É por esse motivo que o emparelhamento das modalidades magnética e fluorescente é importante. A combinação permitiu a detecção de apenas uma unidade formadora de colônias de E.coli O157: H7 em minutos. O primeiro passo na sítese de nanossensores magnetofluorescentes é a preparação de uma solução salina de ferro consistindo de cloreto feroso e férrico.

O ferro fornecerá aos nanossensores um núcleo magnético que permite sua adaptabilidade a plataformas de relaxamento magnético. Soluções adicionais necessárias são ácido poliacrílico e hidróxido de amônio. O ácido clorídrico é introduzido na solução de sal de ferro, que é então adicionada à solução de hidróxido de amônio durante o vórtice.

Finalmente, a solução de ácido poliacrílico é adicionada e a mistura resultante é vórtice por mais uma hora enquanto a reação continua. A solução resultante é centrifugada para precipitar as moléculas maiores e isolar nanopartículas menores que 100 nanômetros de tamanho. A solução é então dialisada durante a noite para purificação.

O próximo passo é a conjugação de anticorpos direcionados à codificação de ácido poliacrílico das nanopartículas de ácido de ferro recém-sintetizadas. Os materiais necessários incluem tampão MES, EDC, NHS e os anticorpos selecionados. O EDC é adicionado primeiro à solução de nanopartículas, seguido pelo NHS e, finalmente, pelo anticorpo.

A mistura é então colocada em uma batedeira de mesa por três horas enquanto a reação continua. A solução é purificada usando uma coluna magnética. A coluna magnetizada captura as nanopartículas, permitindo que apenas anticorpos flutuantes saiam.

Em seguida, a coluna é lavada com tampão PBS e os nanossensores conjugados são coletados. As nanopartículas estão então prontas para a adição de corante fluorescente, fornecendo a segunda modalidade chave usada para detecção. Uma das características mais importantes do nosso nanossensor é a combinação das modalidades magnética e fluorescente, o que é importante por vários motivos.

Em primeiro lugar, a combinação das modalidades permite que cada uma verifique a outra, o que reduz muito o risco de falsos positivos e falsos negativos, que é um dos maiores obstáculos enfrentados pelas diferentes plataformas de diagnóstico usadas atualmente. E em segundo lugar, a combinação das modalidades amplia muito a gama dentro da qual podemos não apenas detectar, mas também quantificar a contaminação bacteriana. A etapa final na preparação dos nanossensores é o encapsulamento do corante fluorescente na codificação da nanopartícula.

Isso é simplesmente conseguido adicionando corante à solução durante o vórtice e, em seguida, permitindo mais tempo para que o corante se difunda na codificação do nanossensor. Os nanossensores totalmente funcionalizados são então dialisados uma última vez para purificação. Para caracterizar os nanossensores, o tamanho e a submissão fluorescente são registrados usando um zetasizer e um leitor de placa de fluorescência.

Uma pequena amostra do nanossensor é adicionada a uma solução de água de cubeta e colocada no zetasizer para o registro do tamanho. Para a análise de fluorescência, uma amostra do nanossensor é colocada em uma placa de 96 poços e inserida no leitor de placas de fluorescência. Idealmente, os nanossensores terão cerca de 70 nanômetros de diâmetro e uma submissão fluorescente de 575 nanômetros.

Além da síntese dos nanossensores, a cultura de bactérias é necessária para fornecer os alvos bacterianos no laboratório. Um estoque de glicerol de bactérias é usado para preparar uma cultura em caldo nutritivo. Esta solução é então deixada incubar.

Após o período inicial de incubação, diluições seriadas são realizadas para atingir uma ampla gama de concentrações bacterianas. Cem microlitros de cada concentração são semeados em uma placa de trado de nutrientes e depois incubados por 24 horas. Após esta incubação, as colônias em cada placa são contadas para determinar a unidade formadora de colônias, ou contagem de UFC por mil de cada estoque diluído.

Agora que as soluções de estoque bacteriano foram preparadas, elas podem ser usadas em conjunto com os nanossensores preparados. E um aspecto importante desse sorotipo específico da bactéria que o distingue de outros sorotipos é supor que, se você for infectado com os outros sorotipos, precisará ter muitas unidades formadoras de colônias para obter uma infecção. Mas nesta E.coli em particular, 10 a 100 UFCs ou unidades formadoras de colônias são boas o suficiente para causar uma infecção.

Nossa tecnologia é estabelecida de tal forma que você não perde nem mesmo uma única contaminação bacteriana de colônia lá. Para preparar soluções para leitura no relaxômetro magnético, 300 microlitros de PBS são primeiro pipetados em um tubo Eppendorf. Em seguida, uma amostra de estoque bacteriano é adicionada, seguida pela adição de nanossensores.

A solução é então transferida para um tubo de vidro e um pedaço de parafilme é colocado em cima para evitar a evaporação. O tubo de vidro é então colocado dentro de um tubo de RMN maior e inserido no relaxômetro magnético. Uma solução de linha de base não contendo bactérias e apenas nanossensor e PBS é usada para obter uma leitura de T2 de linha de base, conforme mostrado.

Em seguida, soluções contendo várias concentrações de bactérias são inseridas no relaxômetro magnético para análise, e as mudanças nos valores de T2 são causadas pela ligação entre os nanossensores e as bactérias. Como mostrado, a presença de apenas uma UFC bacteriana pode ser detectada em minutos usando essa modalidade. No entanto, à medida que a concentração bacteriana aumenta, a leitura de RM é menos quantificável, razão pela qual o uso de dados de submissão fluorescente também equivale a uma quantificação bacteriana precisa.

Antes de se poderem recolher dados de fluorescência, a amostra deve primeiro ser centrifugada. A solução é transferida do tubo de vidro para um tubo Eppendorf e depois centrifugada. Isso separa as bactérias e os nanossensores ligados a ela dos nanossensores flutuantes livres em solução.

O sobrenadante é descartado e o pellet bacteriano é ressuspenso em PBS. Finalmente, a amostra pode ser analisada por submissão fluorescente. A força da emissão será relativa à quantidade de nanossensores restantes na solução e, portanto, também à quantidade de bactérias presentes.

Como pode ser visto, a submissão fluorescente se fortalece à medida que a concentração bacteriana aumenta e também se torna mais sensível. É por isso que o emparelhamento das modalidades magnética e fluorescente permite a detecção e quantificação da contaminação bacteriana nos estágios iniciais e finais do desenvolvimento. Além da detecção de bactérias em soluções simples como o PBS, esses nanossensores também possuem a capacidade de funcionar em meios mais complexos, como água de lago ou leite.

Além disso, esses nanossensores foram testados quanto à especificidade na presença de bactérias não-alvo e bactérias-alvo inativadas pelo calor. Como mostrado, os nanossensores magnetofluorescentes têm pouca ou nenhuma reação com bactérias não direcionadas ou não vivas devido à especificidade dos anticorpos conjugados. Isso demonstra sua eficácia para a detecção de bactérias específicas na presença de outras espécies.

Finalmente, também é importante notar que esses nanossensores podem ser facilmente personalizados para a detecção de outros patógenos também. Você pode sintetizar ou formular esses nanossensores que fizemos em nosso laboratório dentro de um mês. Você pode fazer isso dentro de um mês, e esse mês de produto pode lhe dar cerca de 10 anos de aplicação.