Modulação Reversível Mediada por Luz do Caminho Protein Quinaso Ativado por Mitogênio durante a Diferenciação Celular e Xenopus Desenvolvimento embrionário

O objetivo geral deste experimento é usar a luz para controlar a via de sinalização da proteína quinase ativada por mitógeno em células intactas e em embriões de Xenopus. Este método pode ajudar a responder a questões-chave em biologia celular e do desenvolvimento, como a forma como as modulações temporais da atividade da quinase regulam a autodeterminação durante a diferenciação celular e o desenvolvimento embrionário. A principal vantagem dessa técnica é que a atividade da proteína quinase ativada por mitógeno pode ser controlada reversivelmente em células intactas e em organismos multicelulares, como embriões em desenvolvimento.

Este método pode fornecer informações sobre a cinética de sinalização durante o desenvolvimento embrionário de Xenopus. Também pode ser aplicado a outros sistemas modelo, como socotra, peixe-zebra ou mouse. Hoje, um estudante de pós-graduação do meu laboratório, Vishnu Krishnamurthy, demonstrará o procedimento.

E Aurora Turgeon, uma pós-estrela em meu laboratório, demonstrará todos os procedimentos envolvidos em embriões de Xenopus. Primeiro, monte o dispositivo de cultura de células colocando uma câmara PDMS estéril autoclavada em uma lamínula revestida com PLL estéril em uma placa de Petri de 60 mm. Em seguida, use 0,5 mL de tripsina a 0,25% para separar as células pHK21 de um poço de uma placa de cultura de tecidos de 6 poços.

Após a contagem da densidade celular com o hemocitômetro, semeie a câmara com 20.000 células em 200 microlitros de meio de cultura celular. 24 horas após o plaqueamento celular, transfecte as células com 50 a 100 nanogramas de CRY2-mCherry-Raf1 2A2CIBMG de plasmídeo PCaA X conforme protocolo do fabricante. Três horas após a transfecção, troque o meio para 200 microlitros de meio de cultura fresco e permita que as células se recuperem durante a noite Incubando a cultura em uma incubadora de 37 graus Celsius e cinco por cento de dióxido de carbono.

No dia seguinte, comece a indução optogenética e a imagem substituindo primeiro o meio de cultura de células por 200 microlitros de meio independente de dióxido de carbono. Em seguida, configure o protocolo de aquisição de dados. Selecione o canal FITC de excitação de 488 nonômetros para estimulação optogenética e o canal CRITC de excitação de 561 nanômetros para rastrear a localização celular da proteína marcada com mCherry.

Meça a potência da luz azul colocando um medidor de energia próximo à janela da objetiva. Uma potência total de dois microwatts é suficiente para induzir a associação CIBN CRY2-PHR. Configure uma aquisição de carimbo de data/hora com o intervalo de cinco segundos.

E o tempo total de aquisição de dois minutos. Aplique o material de correspondência de índice apropriado na janela do objetivo. Coloque a câmara celular no microscópio stage e use o modo de campo claro para focar as células na superfície da lamínula usando as oculares.

Em seguida, mova o estágio do microscópio para localizar uma célula transfectada sob luz verde. Grave uma série de imagens com carimbo de data/hora nos canais FITC e CITC. A imagem básica da amostra mostra CIBNGPCAAX localizada na membrana plasmática.

Este é um instantâneo do CRY2 mCherry raf1 antes da simulação de luz azul, enquanto esta imagem mostra um instantâneo do CRY2 mCherry raf um após dez pulsos de estimulação de luz azul. Faça a matriz de LEDs inserindo LEDs azuis tonais em duas placas de ensaio e conectando-se com resistores limitadores de corrente. Coloque as tábuas de ensaio em uma caixa de alumínio.

Insira dois fios de metal para conectar as placas à fonte de alimentação. Certifique-se de que o comprimento do fio seja suficiente quando a caixa de luz for colocada dentro de uma incubadora de dióxido de carbono. Em seguida, coloque um difusor de luz transparente para atuar como tampa da caixa de luz.

Por fim, calibre a saída de energia de cada LED em uma faixa de voltage entradas. Use uma potência de zero vírgula dois miliwatts por centímetro quadrado para o ensaio de diferenciação de células PC12 de 24 horas. Coloque a matriz de LED em uma incubadora de 37 graus Celsius suplementada com cinco por cento de dióxido de carbono.

Conecte-o à fonte de alimentação usando os fios de metal e defina a potência do LED para zero vírgula dois miliwatts por centímetro quadrado. Coloque a placa de 12 poços contendo células PC12 transfectadas na janela da matriz de LED. Alinhe a placa para que todos os poços fiquem totalmente iluminados.

Aplique iluminação de luz contínua por 24 horas. Para criar imagens das células diferenciadas, configure a aquisição de dados de instantâneo único. Use 200 milissegundos para os canais GFP e TexasRed.

Capture imagens das células transfectadas nos canais GFP e TexasRed e salve os arquivos para análise de dados. Comece este procedimento fabricando agulhas para microinjeção de RNA puxando capilares de vidro com um extrator capilar. Remova a camada gelatinosa dos embriões tratando-os com cisteína a três por cento diluída em 0,2 XMMR por 15 minutos.

Transfira os embriões para três por cento de polissacarose E zero vírgula cinco solução XMMR para microinjeção. Injete com precisão 500 picogramas em um nanograma de RNA CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX em cada embrião. Em seguida, cultive os embriões microinjetados na solução de microinjeção à temperatura ambiente.

Quando os embriões atingirem o estágio de gástrula média, transfira-os para a solução MMR 0,2x e continue a cultivar até o estágio desejado de desenvolvimento. Em seguida, coloque a placa de 12 poços na matriz de LED construída em casa para tratamento de luz azul. Coloque um espelho em cima da placa de 12 poços para garantir a iluminação total da luz azul dos embriões.

Colha os embriões para análise histológica, western blot ou de expressão gênica após a exposição à luz azul pelo tempo desejado. Esta imagem mostra instantâneos multicanais de células PC12 transfectadas com CRY2-2A-2CIBN após 24 horas de estimulação de luz azul no ponto zero de dois miliwatts por centímetro quadrado. Os repórteres do GFP e do mCherry são vistos.

Os círculos marcam células diferenciadas e os quadrados marcam células indiferenciadas. Aqui, as células foram tratadas da mesma forma que as da imagem anterior, exceto que nenhuma estimulação de luz azul foi usada. Nenhuma diferenciação é vista.

Essas células mostram resultados representativos após a transfecção com raf1 GFPCaaX, um raf1 constitutivamente ativo. Os círculos e retângulos marcam células diferenciadas e indiferenciadas, respectivamente. Este histograma mostra as taxas de diferenciação de células PC12 transfectadas com CA-Raf1, Co-transfectadas com CRY2 mCherry raf1 e CIBN GFP Caax e transfectadas isoladamente com CRY2A 2CIBN.

Apenas as células expostas à luz azul mostraram diferenciação significativa. Esta imagem mostra a morfologia de embriões normais de Xenopus sem injeção de MRNA e sem tratamentos de luz. Esta imagem mostra embriões injetados com MRNA CRY2 2A2CIBN e submetidos à estimulação de luz azul.

A ativação de raf1 pelo tratamento de embriões injetados com CRY2 2A2CIBN com luz azul induz estruturas ectópicas semelhantes a caudas na região da cabeça. Após este procedimento, pode-se responder a perguntas adicionais, como como a ativação específica do estágio da via da proteína quinase ativada pelo mitógeno regula a expressão gênica. Este método optogenético pode ser generalizado para controlar outras vias de sinalização com mecanismos de ativação semelhantes.