Name: Modulação Reversível Mediada por Luz do Caminho Protein Quinaso Ativado por Mitogênio durante a Diferenciação Celular e Xenopus Desenvolvimento embrionário (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Aprenda a modular a atividade da MAPK usando optogenética reversível em células intactas e embriões de Xenopus. Este método oferece alta resolução espacial e temporal para estudar biologia celular e do desenvolvimento.

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Este trabalho foi apoiado pela Universidade de Illinois em Urbana-Champaign (UIUC) e os Institutos Nacionais de Saúde (NIGMS R01GM111816).

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Ao construir a caixa de luz, a potência dos LEDs individuais deve ser medida. Com base na experiência anterior, a potência pode variar entre LEDs individuais devido a variação de fabricação. Selecione um conjunto de LEDs que tenham uma saída de energia dentro de 10% uns dos outros. O número de LEDs, o resistor de limitação de corrente e a entrada de energia podem ser modificados para diferentes tipos de recipientes de cultura celular ( por exemplo, uma placa de 6 poços ou de 24 poços). Uma iluminação de 24 h de...

Os fatores de crescimento estão envolvidos em um amplo espectro de funções celulares, incluindo proliferação, diferenciação, migração e apoptose, e desempenham papéis fundamentais em muitos eventos biológicos, incluindo desenvolvimento embrionário, envelhecimento e regulação do estado mental 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Muitos fatores de crescimento indicam através de cascatas de sinalização intracelular complexas. Esses eventos de sinalização são freqüentemente operados por fosforilação protéica reversível de forma regulada com precisão 6 , 7 . Assim, uma compreensão dos resultados de sinalização das proteínas quinases, que são responsáveis ​​pela fosforilação de proteínas, é fundamentalmente importante. Diferentes fatores de crescimento agem através de uma rede de sinalização intracelular bastante comum, embora estimulem distInct celular respostas 8 , 9 . Os mediadores intracelulares comuns das tirosina cinases receptoras incluem Ras, Raf, cinase regulada por sinal extracelular (ERK), proteína quinase activada por mitogeno (MAPK) / ERK quinase (MEK), phosphoinositide 3-kinase (PI3K), Akt e fosfolipase C gama (PLCγ) 10 , 11 . A evidência de acumulação sugere que a diversidade e a especificidade da sinalização dependem da regulação espacial e temporal da atividade de sinalização 12 . Por exemplo, em células de feocromocitoma de ratos (PC12), a estimulação do fator de crescimento epidérmico (EGF), que resulta na proliferação celular, ativa a via ERK 9 transitória. Por outro lado, a estimulação com o fator de crescimento nervoso (NGF), que leva à diferenciação celular, ativa a via ERK de forma sustentada 9 , 13 . Em culturaNos neurônios do hipocampo, a sinalização transitória por fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) promove a proliferação primária dos neurites, enquanto a sinalização sustentada leva ao aumento da ramificação dos neurites 14 . Durante o desenvolvimento embrionário precoce, a atividade ERK fosforilada é temporariamente dinâmica e está disseminada em todo o embrião 6 . Uma tela genética recente durante a embriogênese precoce de Xenopus mostrou que as cascatas de sinalização de ERK e Akt, duas vias do factor de crescimento primário a jusante, exibiam os perfis de ativação específicos do estágio 7 . Assim, uma compreensão dos resultados da sinalização da quinase requer ferramentas que possam investigar as características espaciais e temporais da atividade quinasa com resolução suficiente. As abordagens experimentais convencionais para investigar a natureza dinâmica da transdução de sinal durante o desenvolvimento não possuem a resolução espacial e temporal desejável. Por exemplo, as abordagens farmacológicas utilizamMoléculas histológicas ou biológicas para estimular ou suprimir a transdução de sinal em células e tecidos. A natureza difusiva dessas moléculas pequenas torna desafiador restringir sua ação a uma região específica de interesse 15 . As abordagens genéticas ( por exemplo, transgênese, sistema Cre-Lox ou mutagênese) geralmente levam à ativação ou à repressão irreversível da expressão do gene alvo ou da atividade protéica 16 , 17 , 18 . O sistema Tet-On / Tet-Off 19 oferece um controle temporal melhorado da transcrição genética, mas não possui controle espacial rigoroso porque depende da difusão da tetraciclina. Desenvolvimentos recentes na dimerização de proteína induzida quimicamente 20 ou foto-uncaging 21 , 22 , 23 , 24 aumentaram bastanteO controle temporal das redes de sinalização. O controle espacial, no entanto, continua desafiando devido à natureza difusiva dos produtos químicos enjaulados. As recentes abordagens optogenéticas emergentes, que aproveitam o poder da luz para controlar as interações proteína-proteína, permitem a modulação de caminhos de sinalização com alta precisão espaciotemporal e reversibilidade. Pouco depois do seu sucesso inicial no controle do disparo neuronal 25 , 26 , 27 , a optogenética foi estendida para controlar outros processos celulares, como transcrição de genes, tradução, migração celular, diferenciação e apoptose 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 . Uma estratégia usando a pO pino proteico de hotoactividade da proteína Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) e o domínio N-terminal da hélice-laço-hélice básica (CIBN) que interage criptocromo foi recentemente desenvolvido para controlar a atividade da quinase Raf1 em células de mamíferos e embriões Xenopus 35 . CRY2 liga-se a CIBN após a estimulação de luz azul e o complexo de proteína CRY2 / CIBN dissocia espontaneamente no escuro 34 . A luz azul excita o cofactor CRY2, o dinucleótido de flavina adenina (FAD), o que leva a uma mudança conformacional em CRY2 e sua subsequente ligação à CIBN. Os mutantes de CRY2 deficientes em flavina (D387A) podem ser produzidos através de mutações no bolso de ligação ao FAD: o mutante CRY2 W374A liga-se a CIBN independentemente da luz, enquanto que o mutante CRY2 D387A não se liga à CIBN sob o azul Estimulação luminosa 36 , 37 . O sistema optogenético descrito iN este protocolo usa CRY2 e CIBN de tipo selvagem para induzir ativação Raf1 mediada por translocação de proteínas em células vivas. Sabe-se que o recrutamento de membranas de Raf1 aumenta sua atividade 38 . Neste sistema, um módulo CIBN em tandem é ancorado na membrana plasmática e CRY2-mCherry é fundido com o N-terminal de Raf1 35 . Na ausência de luz azul, CRY2-mCherry-Raf1 permanece no citoplasma e Raf1 está inativo. A estimulação de luz azul induz a ligação CRY2-CIBN e recruta Raf1 para a membrana plasmática, onde Raf1 é ativado. A ativação do Raf estimula uma cascata de sinalização Raf / MEK / ERK. As proteínas de fusão CRY2 e CIBN são codificadas em um sistema genético bicistrônico. Essa estratégia pode ser generalizada para controlar outras quinases, como Akt, cujo estado de ativação também pode ser ativado pela translocação de proteínas nas células 39 . Este trabalho apresenta protocolos detalhados para implementar esta estratégia optogenética em cultu de células de mamíferosRes e organismos multicelulares.

<table><tbody><tr><td>Lamínula de vidro&nbsp;</td><td>VWR</td><td>48393 230</td><td>Substrato para imagem de células vivas</td></tr><tr><td>Porta-lamínulas&nbsp;</td><td>Newcomer Supply</td><td>6817B</td><td>Suporte para lamínulas</td></tr><tr><td>Detergente&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>16 000 104</td><td>Para limpeza de lamínulas</td></tr><tr><td>Ácido bórico&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768-500G</td><td>Para fazer tampão PLL</td></tr><tr><td>Tetraborato dissódico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71996-250G</td><td>Para fazer&nbsp; Copo de plástico Nalgene</td></tr><tr><td></td><td></td><td>1201-1000</td><td>Para limpeza de lamínulas</td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465-2.5KG</td><td>Para ajustar o pH</td></tr><tr><td>Bromidrato de hidrossina de poli-L-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1274-500MG</td><td>Para revestimento de lamínula</td></tr><tr><td>Água tratada com dietilpirocarbonato (DEPC)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>750024</td><td>Para preparação de DNA</td></tr><tr><td>Pinça de vidro de cobertura Ted</td><td>Pella</td><td>5645</td><td>Manuseio de vidro de cobertura</td></tr><tr><td>Prato de cutlure de tecido</td><td>Thermofisher</td><td>12565321</td><td>Placa de cultura de células</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga estéreis</td><td>ThermoFisher</td><td>12-565-271</td><td>Armazenamento de tampão</td></tr><tr><td>Reagente de transfecção</td><td>ThermoFisher</td><td>R0534</td><td>Meio de transfecção</td></tr><tr><td>CO2-independente</td><td>ThermoFisher</td><td>18045088</td><td>Para imagens de células vivas</td></tr><tr><td>Polidimetilsiloxano (PDMS)</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td>Forma de fazer câmara celular</td></tr><tr><td>Plasmídeo Maxiprep kit</td><td>Qiagen</td><td>12965</td><td>Preparação de plasmídeo</td></tr><tr><td>Meio DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>11965-084</td><td>Componente médio de cultura celular</td></tr><tr><td>F12K</td><td>ThermoFisher</td><td>21127022</td><td>Componente médio de cultura celular</td></tr><tr><td>Soro de cavalo</td><td>ThermoFisher</td><td>16050122</td><td>Componente médio de cultura celular</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Signa-Aldrich</td><td>12303C-500 mL</td><td>Componente médio de cultura</td></tr> celular <tr><td>Penicilina-Estreptomicina-Glutamina</td><td>ThermoFisher</td><td>10378016</td><td>Componente médio de cultura</td></tr><tr><td>celular Tripsina (0,25%), vermelho de fenol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15050065&nbsp;</td><td>Para dissociação de células de mamíferos</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1356-100</td><td>Para preparação de DNA</td></tr><tr><td>Ficoll PM400</td><td>GE Heathcare Life Sciences</td><td>17-5442-02</td><td>Para tampão embrionário</td></tr><tr><td>Cloridrato de L-cisteína monohidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.02839.0025</td><td>Preparação de oócitos</td></tr><tr><td>ApaI</td><td>ThermoFisher</td><td>FD1414</td><td>Para linearização de plasmídeos</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2222</td><td>Para remover o molde de DNA no ensaio de transcrição in vitro</td></tr><tr><td>Materiais de correspondência de índice (óleo de imersão)</td><td>Thorlabs</td><td>MOIL-20LN</td><td>Para combinar o índice entre o substrato da amostra e a objetiva</td></tr><tr><td>LED azul</td><td>Adafruit</td><td>301</td><td>Fonte de luz para estimulação optogenética</td></tr><tr><td>Kit de resistores</td><td>Resistor limitador de corrente</td> <td>Amazon</td><td>EPC-103</td></tr><tr><td>Caixas de alumínio</td><td>BUD Industries</td><td>AC-401</td><td>caixa de luz&nbsp;</td></tr><tr><td>BreadBoard</td><td>Jekewin</td><td>837654333686</td><td>Para fazer Fio de Conexão de Matriz de LED</td></tr><tr><td></td><td>Electronix Express</td><td>27WK22SLD25</td><td>Para Fazer Matriz de LED</td></tr><tr><td>Módulo de Relé</td><td>Jbtek</td><td>SRD-05VDC-SL-C</td><td>Para controle de luz intermitente</td></tr><tr><td>Fonte de Alimentação DC&nbsp;</td><td>TMS</td><td>DCPowerSupply-LW-(PS-305D)</td><td>Fonte de alimentação para LED</td></tr><tr><td>Silicon&nbsp; Potência Cabeça</td><td>Thorlabs</td><td>S121C</td><td>Para medição de intensidade de luz</td></tr><tr><td>Medidor de potência</td><td>Thorlabs</td><td>PM100D&nbsp;</td><td>Para medição de intensidade de luz</td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Leica Biosystems</td><td>DMI8</td><td>Para imagem de células vivas</td></tr><tr><td>Gabinete de Biossegurança</td><td>ThermoFisher</td><td>1300 Série A2</td><td>Para manuseio de células de mamíferos</td></tr><tr><td>Incubadora de CO2</td><td>ThermoFisher</td><td>Isotemp</td><td>Para cultura de células de mamíferos</td></tr><tr><td>Microscópio estéreo</td><td>Leica</td><td>M60</td><td>Para micromanipulação de embriões</td></tr><tr><td>Microinjetor</td><td>Narishige</td><td>IM300</td><td>Para microinjeção de embriões</td></tr><tr><td>Extrator de micropipetas</td><td>Sutter Instruments</td><td>P87</td><td>Extrator de agulhas</td></tr><tr><td>in vitro kit de transcrição</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1340</td><td>Para transcrição in vitro. O kit inclui água livre de nuclease, RNA SP6&nbsp; Polimerase, mistura de ribonucleotídeos, análogo de tampa, solução de precipitação de coreto de lítio e coluna de rotação &nbsp;</td></tr><tr><td>Kit de purificação de RNA</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>Coluna de spin de membrana de sílica para purificação de RNA sintetizado&nbsp;</td></tr><tr><td>Forno de convecção</td><td>MTI corporation</td><td> EQ-DHG-9015</td><td>Cura PDMS</td></tr><tr><td>Misturador centrífugo e recipiente de teflon</td><td>THINKY</td><td>AR310</td><td>Para misturar wafer de silício PDMS</td></tr><tr><td></td><td>UniversityWafer</td><td>452</td><td>Base para fazer dispositivos PDMS</td></tr><tr><td>Lâmina</td><td>Techni Edge</td><td>01-801</td><td>Para cortar PDMS</td></tr><tr><td>Vidro capilar</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF100-58-10</td><td>Para fabricação de agulhas de injeção.& nbsp;</td></tr></tbody></table>

modulação reversível mediada por luz do caminho protein quinaso ativado por mitogênio durante a diferenciação celular e<em&gt; xenopus</em&gt; desenvolvimento embrionário

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

A atividade da cinase é crucial para uma infinidade de funções celulares, incluindo proliferação celular, diferenciação, migração e apoptose. Durante o desenvolvimento embrionário precoce, a atividade quinasa é altamente dinâmica e generalizada em todo o embrião. As abordagens farmacológicas e genéticas são comumente usadas para sondar atividades de quinase. Infelizmente, é desafiador alcançar uma resolução espacial e temporal superior usando essas estratégias. Além disso, não é viável controlar a atividade quinasa de forma reversível em células vivas e organismos multicelulares. Essa limitação continua a ser um gargalo para alcançar uma compreensão quantitativa da atividade quinasa durante o desenvolvimento e a diferenciação. Este trabalho apresenta uma estratégia optogenética que tira proveito de um sistema bicistrônico contendo proteínas fotoativáveis Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) e o domínio N-terminal da híbrida-hélice-hélice básica interativa criptocromo (CIBN). ReversiA ativação da ativação da via de sinalização da proteína quinase ativada por mitogeno (MAPK) é conseguida através da translocação da proteína mediada por luz em células vivas. Esta abordagem pode ser aplicada a culturas de células de mamíferos e embriões de vertebrados vivos. Este sistema bicistrônico pode ser generalizado para controlar a atividade de outras quinases com mecanismos de ativação semelhantes e pode ser aplicado a outros sistemas modelo.

Expressão raatiométrica de pares de proteínas fotoativáveis: a Figura 1A mostra o projeto de uma construção optogenética bicistrônica, CRY2-mCherry-Raf1-P2A-CIBN-CIBN-GFP-CaaX (referido como CRY2-2A-2CIBN), com base no teschovirum porcino- 1 péptido 2A (P2A), que mostra a maior eficiência de picos de ribossoma entre as linhas celulares de mamíferos 42 . No trabalho anterior, determinou-se que a razão ideal para CIBN-GFP-CaaX: CRY2-mCh...

Este protocolo descreve uma estratégia optogenética para modular a atividade da proteína quinase ativada por mitógenos (MAPK) durante a diferenciação celular e o desenvolvimento embrionário de Xenopus . Este método permite a ativação reversível da via de sinalização MAPK na cultura de células de mamíferos e em organismos vivos multicelulares, como embriões Xenopus , com alta resolução espacial e temporal.

Modulação Reversível Mediada por Luz do Caminho Protein Quinaso Ativado por Mitogênio durante a Diferenciação Celular e<em&gt; Xenopus</em&gt; Desenvolvimento embrionário

Kinase activity is crucial for a plethora of cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration, and apoptosis. During early ...

O objetivo geral deste experimento é utilizar a luz para controlar a via de sinalização da quinase ativada por mitógeno em células intactas e em embriões de Xenopus. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais em biologia celular e do desenvolvimento, como a forma como modulações temporais da atividade da quinase regulam a autodeterminação durante a diferenciação celular e o desenvolvimento embrionário. A principal vantagem desta técnica é que a atividade da quinase ativada por mitógeno pode ser controlada de maneira reversível em células intactas e em organismos multicelulares, como embriões em desenvolvimento.Este método pode fornecer informações sobre a cinética de sinalização durante o desenvolvimento embrionário de Xenopus. Também pode ser aplicado a outros sistemas modelo, como socotra, peixe-zebra ou camundongo. Hoje, um estudante de pós-graduação do meu laboratório, Vishnu Krishnamurthy, demonstrará o procedimento.E Aurora Turgeon, uma pós-doutoranda do meu laboratório, demonstrará todos os procedimentos envolvidos com embriões de Xenopus. Primeiro, monte o dispositivo de cultivo celular colocando uma câmara estéril de PDMS autoclavada sobre uma lamínula estéril revestida com PLL em uma placa de Petri de 60 mm. Em seguida, use 0,5 mL de tripsina a 0,25% para destacar as células pHK21 de uma poça de uma placa de cultivo celular de 6 poços.Após contar a densidade celular com o hemocitômetro, semeie a câmara com 20.000 células em 200 microlitros de meio de cultura celular. 24 horas após o plaqueamento celular, transfecte as células com 50 a 100 nanogramas de CRY2-mCherry-Raf1 2A2CIBMG do plasmídeo PCaA X conforme o protocolo do fabricante. Três horas após a transfeção, troque o meio por 200 microlitros de meio de cultura fresco e deixe as células recuperarem durante a noite incubando o cultivo em um incubador a 37 graus Celsius e 5 por cento de dióxido de carbono.No dia seguinte, inicie a indução optogenética e a aquisição de imagens substituindo primeiro o meio de cultura celular por 200 microlitros de meio independente de dióxido de carbono. Em seguida, configure o protocolo de aquisição de dados. Selecione o canal FITC com excitação de 488 nanômetros para estimulação optogenética e o canal CRITC com excitação de 561 nanômetros para acompanhar a localização celular da proteína marcada com mCherry.Meça a potência da luz azul colocando um medidor de potência próximo à janela do objetivo. Uma potência total de dois microwatts é suficiente para induzir a associação CIBN CRY2-PHR. Configure uma aquisição com carimbo de tempo com intervalo de cinco segundos.E o tempo total de aquisição de dois minutos. Aplique o material apropriado de casamento de índice na janela da objetiva. Coloque a câmara de células na platina do microscópio e use o modo de campo claro para focar nas células na superfície do lamínula utilizando as oculares.Em seguida, mova a platina do microscópio para localizar uma célula transfectada sob luz verde. Grave uma série de imagens com carimbo de tempo em ambos os canais FITC e CITC. A imagem básica mostra CIBNGPCAAX localizada na membrana plasmática.Esta é uma imagem de CRY2 mCherry raf1 antes da estimulação com luz azul, enquanto esta imagem mostra um registro de CRY2 mCherry raf1 após dez pulsos de estimulação com luz azul. Monte o arranjo de LED inserindo LEDs azuis tonais em duas matrizes de protótipos e conectando-os com resistores limitadores de corrente. Posicione as matrizes de protótipos dentro de uma caixa de alumínio.Insira dois fios metálicos para conectar as placas à fonte de alimentação. Certifique-se de que o comprimento do fio seja suficiente quando a caixa de luz for colocada dentro de uma incubadora de dióxido de carbono. Em seguida, coloque um difusor de luz transparente para atuar como tampa da caixa de luz.Por fim, calibre a saída de potência de cada LED em uma faixa de entradas de voltagem. Utilize uma potência de zero vírgula dois miliwatts por centímetro quadrado para o ensaio de diferenciação de células PC12 de 24 horas. Coloque o arranjo de LEDs em um incubador a 37 graus Celsius suplementado com cinco por cento de dióxido de carbono.Conecte-o à fonte de alimentação utilizando os fios metálicos e ajuste a potência do LED para zero vírgula dois miliwatts por centímetro quadrado. Coloque a placa de 12 poços contendo células PC12 transfectadas sobre a janela do arranjo de LED. Alinhe a placa de modo que cada poço seja totalmente iluminado.Aplique iluminação contínua por 24 horas. Para imagens das células diferenciadas, configure a aquisição de dados em um único instantâneo. Utilize 200 milissegundos para os canais GFP e TexasRed.Capture imagens das células transfectadas nos canais GFP e TexasRed e salve os arquivos para análise de dados. Inicie este procedimento fabricando agulhas para microinjeção de RNA, puxando capilares de vidro com um puxador de capilares. Remova a camada de gelatina dos embriões tratando-os com cisteína a três por cento diluída em 0.2 XMMR durante 15 minutos.Transfira os embriões para uma solução de polissacarose a três por cento e 0,5 XMMR para microinjeção. Injete com precisão de 500 picogramas a um nanograma de RNA CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX em cada embrião. Em seguida, cultive os embriões microinjetados na solução de microinjeção à temperatura ambiente.Quando os embriões atingirem o estágio de gástrula média, transfira-os para solução MMR 0,2x e continue o cultivo até o estágio desejado de desenvolvimento. Em seguida, coloque a placa de 12 poços sobre a matriz de LED caseira para o tratamento com luz azul. Coloque um espelho sobre a placa de 12 poços para garantir a iluminação completa dos embriões com luz azul.Colete os embriões para análise histológica, de western blot ou de expressão gênica após exposição à luz azul pelo tempo desejado. Esta imagem mostra imagens multicanal de células PC12 transfectadas com CRY2-2A-2CIBN após 24 horas de estimulação com luz azul a zero vírgula dois miliwatts por centímetro quadrado. Os repórteres GFP e mCherry são observados.Os círculos indicam células diferenciadas e os quadrados indicam células indiferenciadas. Aqui, as células foram tratadas da mesma forma que as da imagem anterior, exceto pelo fato de não ter sido usada estimulação com luz azul. Nenhuma diferenciação é observada.Essas células mostram resultados representativos após transfeção com raf1 GFPCaaX, um raf1 constitutivamente ativo. Os círculos e retângulos marcam células diferenciadas e indiferenciadas, respectivamente. Este histograma mostra as proporções de diferenciação de células PC12 transfectadas com CA-Raf1, co-transfectadas com CRY2 mCherry raf1 e CIBN GFP Caax, e transfectadas individualmente com CRY2A 2CIBN.Apenas as células expostas à luz azul apresentaram diferenciação significativa. Esta imagem mostra a morfologia de embriões normais de Xenopus sem injeção de RNAm e sem tratamentos com luz. Esta imagem mostra embriões injetados com RNAm de CRY2 2A2CIBN e submetidos à estimulação com luz azul.A ativação de raf1 mediante tratamento de embriões injetados com CRY2 2A2CIBN com luz azul induz estruturas ectópicas semelhantes a caudas na região da cabeça. Após este procedimento, pode-se responder a perguntas adicionais, como como a ativação específica por estágio da via de sinalização da proteína quinase ativada por mitógeno regula a expressão gênica. Este método optogenético pode ser generalizado para controlar outras vias de sinalização com mecanismos de ativação semelhantes.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

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Aprenda a modular a atividade da MAPK usando optogenética reversível em células intactas e embriões de Xenopus. Este método oferece alta resolução espacial e temporal para estudar biologia celular e do desenvolvimento.

Modulação Reversível Mediada por Luz do Caminho Protein Quinaso Ativado por Mitogênio durante a Diferenciação Celular e Xenopus Desenvolvimento embrionário (Vídeo) | JoVE Journal

Modulação Reversível Mediada por Luz do Caminho Protein Quinaso Ativado por Mitogênio durante a Diferenciação Celular e

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