Name: Um quadro metodológico unificado para pesquisa de Schwannoma vestibular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Aprenda a processar amostras de schwannoma vestibular humano para cultura primária de células e análise de secreções tumorais. Este método minimamente manipulativo preserva a viabilidade celular e permite testar candidatos terapêuticos diretamente.

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Este trabalho foi apoiado pelo RIEDC015824 (KMS) e T32DC00038 (apoiando JES e SD), o Departamento de Defesa concede W81XWH-14-1-0091 (KMS), a Fundação Bertarelli (KMS) , A Fundação Nancy Sayles Day (KMS), o Centro de Pesquisa Lauer Tinnitus (KMS) e a Fundação Barnes (KMS).

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<li>Gal, T. J., Shinn, J., Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+epidemiology+and+management+trends+in+acoustic+neuroma%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Current epidemiology and management trends in acoustic neuroma.</a> Otolaryngol Head Neck Surg. 142 (5), 677-681 (2010).</li>
<li>Propp, J. M., McCarthy, B. J., Davis, F. G., Preston-Martin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Descriptive+epidemiology+of+vestibular+schwannomas%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Descriptive epidemiology of vestibular schwannomas.</a> Neuro Oncol. 8 (1), 1-11 (2006).</li>
<li>Stangerup, S. E., Tos, M., Thomsen, J., Caye-Thomasen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((True+incidence+of+vestibular+schwannoma%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">True incidence of vestibular schwannoma?</a> Neurosurgery. 67 (5), 1335-1340 (2010).</li>
<li>Tos, M., Stangerup, S. E., Caye-Thomasen, P., Tos, T., Thomsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+real+incidence+of+vestibular+schwannoma%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">What is the real incidence of vestibular schwannoma?</a> Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 130 (2), 216-220 (2004).</li>
<li>Stangerup, S. E., Caye-Thomasen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+and+natural+history+of+vestibular+schwannomas%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngol+Clin+North+Am%22%5BJournal%5D)">Epidemiology and natural history of vestibular schwannomas.</a> Otolaryngol Clin North Am. 45 (2), 257-268 (2012).</li>
<li>Mahaley, M. S., Mettlin, C., Natarajan, N., Laws, E. R., Peace, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+patterns+of+care+of+brain+tumor+patients+in+the+United+States%3A+a+study+of+the+Brain+Tumor+Section+of+the+AANS+and+the+CNS+and+the+Commission+on+Cancer+of+the+ACS%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Analysis of patterns of care of brain tumor patients in the United States: a study of the Brain Tumor Section of the AANS and the CNS and the Commission on Cancer of the ACS.</a> Clin Neurosurg. 36, 347-352 (1990).</li>
<li>Carlson, M. L., Link, M. J., Wanna, G. B., Driscoll, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+sporadic+vestibular+schwannoma%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngol+Clin+North+Am%22%5BJournal%5D)">Management of sporadic vestibular schwannoma.</a> Otolaryngol Clin North Am. 48 (3), 407-422 (2015).</li>
<li>Dilwali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporadic+vestibular+schwannomas+associated+with+good+hearing+secrete+higher+levels+of+fibroblast+growth+factor+2+than+those+associated+with+poor+hearing+irrespective+of+tumor+size%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">Sporadic vestibular schwannomas associated with good hearing secrete higher levels of fibroblast growth factor 2 than those associated with poor hearing irrespective of tumor size.</a> Otol Neurotol. 34 (4), 748-754 (2013).</li>
<li>Caye-Thomasen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+and+VEGF+receptor-1+concentration+in+vestibular+schwannoma+homogenates+correlates+to+tumor+growth+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">VEGF and VEGF receptor-1 concentration in vestibular schwannoma homogenates correlates to tumor growth rate.</a> Otol Neurotol. 26 (1), 98-101 (2005).</li>
<li>Koutsimpelas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+VEGF%2FVEGF-R+axis+in+sporadic+vestibular+schwannomas+correlates+with+irradiation+and+disease+recurrence%5BTitle%5D)+AND+%22ORL+J+Otorhinolaryngol+Relat+Spec%22%5BJournal%5D)">The VEGF/VEGF-R axis in sporadic vestibular schwannomas correlates with irradiation and disease recurrence.</a> ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec. 74 (6), 330-338 (2012).</li>
<li>Dilwali, S., Roberts, D., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+VEGF-A+and+cMET+signaling+in+human+vestibular+schwannomas+and+schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">Interplay between VEGF-A and cMET signaling in human vestibular schwannomas and schwann cells.</a> Cancer Biol Ther. 16 (1), 170-175 (2015).</li>
<li>Dilwali, S., Kao, S. Y., Fujita, T., Landegger, L. D., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonsteroidal+anti-inflammatory+medications+are+cytostatic+against+human+vestibular+schwannomas%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Nonsteroidal anti-inflammatory medications are cytostatic against human vestibular schwannomas.</a> Transl Res. 166 (1), 1-11 (2015).</li>
<li>Dilwali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+validation+of+anti-nuclear+factor-kappa+B+therapy+to+inhibit+human+vestibular+schwannoma+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Preclinical validation of anti-nuclear factor-kappa B therapy to inhibit human vestibular schwannoma growth.</a> Mol Oncol. 9 (7), 1359-1370 (2015).</li>
<li>Dilwali, S., Landegger, L. D., Soares, V. Y., Deschler, D. G., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secreted+Factors+from+Human+Vestibular+Schwannomas+Can+Cause+Cochlear+Damage%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Secreted Factors from Human Vestibular Schwannomas Can Cause Cochlear Damage.</a> Sci Rep. 5, 18599(2015).</li>
<li>Blakeley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+drug+treatments+for+neurofibromatosis+type+2-associated+vestibular+schwannoma%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Development of drug treatments for neurofibromatosis type 2-associated vestibular schwannoma.</a> Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 20 (5), 372-379 (2012).</li>
<li>Schroeder, R. D., Angelo, L. S., Kurzrock, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF2%2Fmerlin+in+hereditary+neurofibromatosis+2+versus+cancer%3A+biologic+mechanisms+and+clinical+associations%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">NF2/merlin in hereditary neurofibromatosis 2 versus cancer: biologic mechanisms and clinical associations.</a> Oncotarget. 5 (1), 67-77 (2014).</li>
<li>Schularick, N. M., Clark, J. J., Hansen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+human+vestibular+schwannomas%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Primary culture of human vestibular schwannomas.</a> J Vis Exp. (89), (2014).</li>
<li>Dilwali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+human+Schwann+and+schwannoma+cells%3A+improved+and+simplified+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Primary culture of human Schwann and schwannoma cells: improved and simplified protocol.</a> Hear Res. , 25-33 (2014).</li>
<li>Brown, C. M., Ahmad, Z. K., Ryan, A. F., Doherty, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+receptor+expression+in+sporadic+vestibular+schwannomas%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">Estrogen receptor expression in sporadic vestibular schwannomas.</a> Otol Neurotol. 32 (1), 158-162 (2011).</li>
<li>Cioffi, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-21+overexpression+contributes+to+vestibular+schwannoma+cell+proliferation+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-21 overexpression contributes to vestibular schwannoma cell proliferation and survival.</a> Otol Neurotol. 31 (9), 1455-1462 (2010).</li>
<li>Doherty, J. K., Ongkeko, W., Crawley, B., Andalibi, A., Ryan, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ErbB+and+Nrg%3A+potential+molecular+targets+for+vestibular+schwannoma+pharmacotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">ErbB and Nrg: potential molecular targets for vestibular schwannoma pharmacotherapy.</a> Otol Neurotol. 29 (1), 50-57 (2008).</li>
<li>Aguiar, P. H., Tatagiba, M., Samii, M., Dankoweit-Timpe, E., Ostertag, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comparison+between+the+growth+fraction+of+bilateral+vestibular+schwannomas+in+neurofibromatosis+2+%28NF2%29+and+unilateral+vestibular+schwannomas+using+the+monoclonal+antibody+MIB+1%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurochir+%28Wien%29%22%5BJournal%5D)">The comparison between the growth fraction of bilateral vestibular schwannomas in neurofibromatosis 2 (NF2) and unilateral vestibular schwannomas using the monoclonal antibody MIB 1.</a> Acta Neurochir (Wien). 134 (1-2), 40-45 (1995).</li>
<li>Cattoretti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+against+recombinant+parts+of+the+Ki-67+antigen+%28MIB+1+and+MIB+3%29+detect+proliferating+cells+in+microwave-processed+formalin-fixed+paraffin+sections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies against recombinant parts of the Ki-67 antigen (MIB 1 and MIB 3) detect proliferating cells in microwave-processed formalin-fixed paraffin sections.</a> J Pathol. 168 (4), 357-363 (1992).</li>
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<li>Landegger, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+AAV+vector+enables+safe+and+efficient+gene+transfer+to+the+mammalian+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear.</a> Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).</li>
<li>Zinn, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Silico+Reconstruction+of+the+Viral+Evolutionary+Lineage+Yields+a+Potent+Gene+Therapy+Vector%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector.</a> Cell Rep. 12 (6), 1056-1068 (2015).</li>
<li>Kim, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulforaphane%2C+a+natural+component+of+broccoli%2C+inhibits+vestibular+schwannoma+growth+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Sulforaphane, a natural component of broccoli, inhibits vestibular schwannoma growth in vitro and in vivo.</a> Sci Rep. 6, 36215(2016).</li>
<li>Soares, V. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+derived+from+human+vestibular+schwannomas+associated+with+poor+hearing+damage+cochlear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles derived from human vestibular schwannomas associated with poor hearing damage cochlear cells.</a> Neuro Oncol. 18 (11), 1498-1507 (2016).</li>
<li>Lysaght, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+of+human+perilymph%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Proteome of human perilymph.</a> J Proteome Res. 10 (9), 3845-3851 (2011).</li>
<li>Caye-Thomasen, P., Borup, R., Stangerup, S. E., Thomsen, J., Nielsen, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deregulated+genes+in+sporadic+vestibular+schwannomas%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">Deregulated genes in sporadic vestibular schwannomas.</a> Otol Neurotol. 31 (2), 256-266 (2010).</li>
<li>Schulz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+nerve+microenvironment+for+schwannoma+development%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">The importance of nerve microenvironment for schwannoma development.</a> Acta Neuropathol. 132 (2), 289-307 (2016).</li>
<li>Torres-Martin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+profiling+in+vestibular+schwannomas+shows+critical+deregulation+of+microRNAs+and+upregulation+in+those+included+in+chromosomal+region+14q32%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Global profiling in vestibular schwannomas shows critical deregulation of microRNAs and upregulation in those included in chromosomal region 14q32.</a> PLoS One. 8 (6), e65868(2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este manuscrito descreve um quadro metodológico unificado para pesquisas VS, descrevendo o processamento simultâneo de espécimes humanos VS e GAN para aplicações de pesquisa a jusante. À medida que a pesquisa VS entra na idade da medicina de precisão, preparar a mesma amostra em formas capazes de responder a inúmeras questões de pesquisa possibilitará a descoberta de informações moleculares, celulares, genéticas e proteômicas específicas para pacientes individuais. A pureza das células human...

Os schwannomas vestibulares (VSs) são as neoplasias mais comuns do ângulo cerebelopontino, diagnosticadas em 1 em cada 100.000 indivíduos. Embora não metastáticos, esses tumores afetam gravemente a qualidade de vida de um paciente 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Indivíduos afetados geralmente vivem com perda auditiva, zumbido e um sentimento de plenitude auditiva. Os sintomas tornam-se cada vez mais debilitantes à medida que o tumor cresce, causando problemas de equilíbrio, paralisia facial e comprometimento de outras funções do nervo craniano. Complicações potencialmente fatais devido à compressão do tronco encefálico também podem ocorrer 7 . As opções de gerenciamento de VS são essencialmente limitadas à espera atenta de tumores estáticos e terapia de radiação estereotáxica ou ressecção cirúrgica para tumores em crescimento <sUp class = &quot;xref&quot;&gt; 8. A remoção cirúrgica destes tumores em hospitais afiliados à pesquisa apresenta a oportunidade de adquirir e analisar o tecido tumoral fresco coletado durante as cirurgias do paciente. Uma abordagem cirúrgica específica para VS, a ressecção translaberina, pode mesmo oferecer acesso a um epitélio sensorial humano valioso da orelha interna e perilimia. Como os VS provêm de um nervo sensorial periférico ( ou seja, o nervo vestibular), é importante comparar as observações associadas ao VS com as derivadas de um nervo de controle apropriado, como o grande nervo auricular humano (GAN). GANs saudáveis ​​são regularmente sacrificados durante a parotidectomia ou dissecção do pescoço e podem ser usados ​​como modelos robustos para a fisiologia das células de Schwann saudáveis 9 . Como não há medicamentos aprovados pela FDA para o tratamento ou prevenção de VS esporádicos, é imperativo que os pesquisadores elucidem o mecanismo molecular subjacenteNismos da doença para identificar alvos terapêuticos. As proteínas que demonstraram desempenhar um papel na patogênese VS incluem merlin, fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), ciclooxigenase 2 (COX-2), fator nuclear kappa B (NF-kB), fator de necrose tumoral alfa (TNF-alfa) , Receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) e moléculas de sinalização relacionadas 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . Avanços recentes expandiram e melhoraram os protocolos para a coleta, processamento, cultura e investigação a jusante de schwannomas vestibulares humanos primários e tecidos nervosos saudáveis 18 , 19 . No entanto, a maioria dos protocolos existentes são projetados para acomodar a preparaçãoDe tais tecidos para um único pedido de pesquisa a jusante ( isto é, cultura celular sozinho). Este artigo apresenta um quadro metodológico unificado para o processamento simultâneo de uma única amostra humana primária VS ou GAN para múltiplas aplicações a jusante: cultura específica do tipo celular, extração de proteínas, preservação de ARN, coleta de secreção de tumor e fixação de tecido. Este trabalho também detalha a coleta e processamento cirúrgico do líquido cefalorraquidiano (CSF) humano e perilymph durante a ressecção VS translabyrintin, uma vez que estes tecidos intimamente relacionados podem servir como fontes importantes de biomarcadores para VS. Finalmente, este protocolo apresenta etapas para a transdução viral de células VS humanas primárias em cultura como uma nova aplicação deste tecido para uso na terapia de genes.

<table><tbody><tr><td>BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin 12 mm #1 Lamínula de Vidro Alemã</td><td>Corning</td><td>354087</td><td>Ou prepare lamínulas com Corning Laminin (CB-40232) e Cultrex Poly-L-Lysine (3438-100-01)</td></tr><tr><td>Tubos de Centrífuga CELLSTAR 15 mL, fundo cônico, Graduação, Greiner Estéril</td><td>Bio-One</td><td>188161</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de Centrífuga CELLSTAR 50 mL, fundo cônico, Graduação, Greiner Estéril</td><td>Bio-One</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Cultura de Células CELLSTAR, 60 mm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase de Clostridium histolyticum, Sigma-Aldrich</td><td></td><td>C1639</td><td></td></tr><tr><td>Costar 24 Placas de Poços Múltiplos Tratadas com TC Bem Transparente, Corning</td><td></td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dicloridrato)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, glicose alta, piruvato, sem glutamina, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10313-039</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #3 Fórceps, Dumoxel</td><td>Fine Science Tools</td><td>11231-30</td><td>Autoclave antes do uso</td></tr><tr><td>Dumont #5 Fórceps, ponta padrão, Inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td>Autoclave antes do uso</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino, qualificado, regiões aprovadas pelo USDA, 500 mL</td><td>Alíquota Thermo Fisher Scientific</td><td>10437-028</td><td>em tubos de 50 mL e armazenar em -20&deg; C freezer</td></tr><tr><td>Hialuronidase de Testículos Bovinos, Tipo I-S, Pó Liofilizado</td> Unidade de Filtro de Seringa <td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GP, 0.22 &micro; m, polietersulfona, 33 mm,</td><td>EMD Millipore</td><td>estéril SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído, Grau de Reagente, Cristalino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Antes de usar: Estabeleça Procedimentos Operacionais Padrão com base em protocolos disponíveis online</td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023</td><td>Autoclave antes de usar</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL), 100 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Comprimidos Inibidores de Fosfatase PhosSTOP</td><td>Comprimidos Inibidores</td> de Protease <td>Roche 04906845001</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Pipetas</td> e pontas de pipeta <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88666</td><td></td></tr>, <tr><td>5/10/25 mL</td><td>Pilão</td><td></td> de Homogeneização Plástica Variável <td></td></tr><tr><td>para Microtubos de 1,5/2,0 mL</td><td>E& K Scientific</td><td>EK-10539</td><td></td></tr><tr><td>Agulhas PrecisionGlide, 27 G x 1 1/2 in</td><td>BD</td><td>301629</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Buffer</td><td>Boston BioProducts</td><td>BP-115</td><td></td></tr><tr><td>RNAlater (solução de estabilização de RNA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM7021</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de Microcentrífuga Safe-Lock, Polipropileno, 0.5 mL</td><td>Autoclave 022363719 Eppendorf</td><td></td><td>antes do uso</td></tr><tr><td>Tubos de Microcentrífuga Safe-Lock, Polipropileno, 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022363204</td><td>Autoclave antes do uso</td></tr><tr><td>Solução salina - Injeção de cloreto de sódio a 0.9%, bacteriostático, 20 mL</td> Lâminas de bisturi <td>Hospira</td><td>0409-1966-05</td><td></td></tr><tr><td>- #15</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>10015-00</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de Sucção Schuknecht 24 gauge</td><td>Bausch + Lomb</td><td>N1698 42</td><td>Útil para a abordagem cirúrgica (além de instrumentos cirúrgicos otológicos comuns) e e.g. um marcador cirúrgico azul</td></tr><tr><td>Recipiente de Amostras, OU estéril, 4OZ</td><td>Medline</td><td>DYND30331H</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Estéreo Stemi 2000-C</td><td>Zeiss</td><td>000000-1106-133</td><td></td></tr><tr><td>Combinação de Seringa/Agulha, Ponta Luer-Lok, 5 mL, 22 G x 1 pol.</td><td>BD</td><td>309630</td><td></td></tr><tr><td>Somente seringa de tuberculina, ponta deslizante, 1 mL</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>seringa tuberculínica apenas, ponta deslizante, 3 mL</td><td>BD</td><td>309656</td><td></td></tr><tr><td>homogeneizador ultrassônico, série 4710, sonda CV18</td><td>Cole-Parmer</td><td>CP25013</td><td></td></tr></tbody></table>

um quadro metodológico unificado para pesquisa de schwannoma vestibular

A Unified Methodological Framework for Vestibular Schwannoma Research

Os schwannomas vestibulares são as neoplasias mais comuns do ângulo cerebelopontino, constituindo 6-8% de todos os crescimentos intracranianos. Embora esses tumores causem perda auditiva neurossensorial em até 95% dos indivíduos afetados, os mecanismos moleculares subjacentes a essa perda auditiva permanecem indescritíveis. Este artigo descreve as etapas estabelecidas em nosso laboratório para facilitar a coleta e processamento de várias amostras primárias de tecido humano para aplicações de pesquisa a jusante integrantes ao estudo de schwannomas vestibulares. Especificamente, este trabalho descreve um quadro metodológico unificado para a coleta, processamento e cultura de células de Schwann e Schwannoma a partir de amostras cirúrgicas. Isso é integrado a etapas de processamento paralelo, agora consideradas essenciais para a pesquisa atual: a coleta de secreções tumorais e nervosas, a preservação do RNA e a extração de proteínas dos tecidos coletados, a fixação do tecido para a preparação de seções, umaD a exposição de células humanas primárias a vírus adeno-associados para aplicação na terapia genética. Além disso, este trabalho destaca a abordagem cirúrgica translocrítica para colecionar este tumor como uma oportunidade única para obter o epitélio sensorial humano da orelha interna e perilimia. São fornecidas dicas para melhorar a qualidade experimental e destacadas armadilhas comuns.

As células VS humanas primárias em cultura, conforme estabelecido na seção 5, podem ser tratadas como modelos informativos para processos associados a doenças em muitos aplicativos de pesquisa a jusante ( Figura 1 ). As células saudáveis ​​de Schwann cultivadas na seção 6 fornecem um ponto de comparação direto e instrutivo. Conforme descrito abaixo, dados extensivos de VSs e GANs processados ​​de acordo com este quadro metodológico unificado estão disponívei...

O objetivo deste protocolo é descrever a coleta e processamento de amostras cirúrgicas humanas para múltiplas aplicações a jusante no schwannoma vestibular e na pesquisa de células de Schwann.

Um quadro metodológico unificado para pesquisa de Schwannoma vestibular

Vestibular schwannomas are the most common neoplasms of the cerebellopontine angle, making up 6-8% percent of all intracranial growths. Though these ...

O objetivo geral deste procedimento é processar uma amostra humana de schwannoma vestibular recebida do centro cirúrgico para cultura primária de células e coleta de secreções tumorais. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de pesquisa de schwannoma vestibular, como a melhor forma de receber, armazenar e processar uma amostra tumoral primária humana destinada ao uso em diversos ensaios biomoleculares. A principal vantagem desta técnica é que utiliza um método de cultura minimamente manipulativo para propagar células primárias humanas de schwannoma vestibular.As implicações dessa técnica estendem-se à terapia para schwannoma vestibular, pois candidatos terapêuticos promissores podem ser testados diretamente em células cultivadas. Comece transferindo o recipiente com a amostra recém-coletada de schwannoma vestibular ou do nervo auricular maior do gelo utilizado para transporte da sala cirúrgica para uma cabine de fluxo laminar no laboratório. Utilize pinças estéreis para transferir cuidadosamente a amostra para o primeiro de três tubos de 1,5 mililitro contendo 1,4 mililitro de PBS externo.Feche cada tubo assim que ele conter o espécime e agite suavemente para lavar. Coloque a amostra em uma placa de Petri seca de 60 milímetros e use pinça para remover todos os tecidos mortos em áreas com vasos sanguíneos proeminentes. Use pinça ou lâmina de bisturi para dividir a amostra em pedaços separados para preservação de RNA, extração de proteínas, coleta de secreções, fixação e cultivo celular.Transfira o fragmento da amostra designado para cultivo celular para uma nova placa de cultura de 60 milímetros contendo de cinco a oito mililitros de meio DMEM F12 suplementado frio. Coloque o fragmento de schwannoma vestibular ou do nervo auricular maior designado para a coleta de secreções em um tubo vazio de 1,5 mililitro. Comece pipetando 500 microlitros de DMEM não suplementado com FBS em dois tubos de 1,5 mililitro.O primeiro tubo será usado para coletar as secreções tumorais e o segundo tubo servirá como controle pareado. Coloque um dos tubos contendo DMEM sobre uma balança digital calibrada. Zere a balança, coloque o fragmento de espécime designado para a coleta de secreções dentro do tubo e pese-o.Observe o resultado, que representará o peso do tecido isolado. Sob uma capela de fluxo laminar, ajuste o volume de DMEM no tubo para 100 microlitros por 10 miligramas da amostra. Coloque o tubo contendo a amostra de tecido e seu controle pareado no incubador.Incube por pelo menos 72 horas, para coletar quantidades biologicamente úteis de secreções tumorais ou nervosas. Após a incubação por 72 horas, utilize uma pipeta de um mililitro para remover o meio contendo a secreção do espécime. Para evitar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento, alíquotas o meio em novos tubos de acordo com a análise posterior planejada.Armazene o fragmento original do tecido, as secreções e o DMEM controle em um congelador a menos 80 graus Celsius até que os procedimentos subsequentes sejam iniciados. Inicie o procedimento de cultura utilizando um par de pinças em cada mão para separar o tecido do schwannoma vestibular em fragmentos de aproximadamente um milímetro cúbico. Em seguida, aspire o meio e os fragmentos tumorais com uma pipeta serológica de 10 milímetros e transfira todo o conteúdo para um tubo cônico de 15 mililitros.Centrifugue por três minutos a 1000G a 25 graus Celsius. Durante a centrifugação, prepare o meio de desintegração combinando 4,7 mililitros de meio DMEM F12 suplementado com 250 microlitros de colagenase e 50 microlitros de hialuronidase em uma placa de cultura de 60 milímetros. Após a centrifugação, os fragmentos tumorais formarão um pellet no fundo do tubo cônico.Aspire cuidadosamente e descarte o sobrenadante. Em seguida, adicione dois mililitros de meio de desintegração contendo enzima recém-preparado ao palato tumoral. Pipete para cima e para baixo várias vezes para mobilizar o tecido e, então, transfira-o para a placa de cultura de 60 milímetros.Coloque a placa de cultura no incubador por 18 horas. No dia seguinte, aqueça o meio DMEM F12 suplementado com 10% de FBS e 1% de penicilina-estreptomicina em banho-maria a 37 graus Celsius. Remova a placa contendo a cultura de schwannoma vestibular do incubador e transfira para a cabine de fluxo laminar. Usando uma agulha de 22 gauge acoplada a uma seringa de seis mililitros, aspire o meio contendo a cultura e transfira para um novo tubo cônico de 15 mililitros.Centrifugue por cinco minutos a 1000G a 37 graus Celsius. Enquanto isso, use pin&ccedil;as est&eacute;reis para colocar o n&uacute;mero necess&aacute;rio de lam&iacute;nulas de vidro revestidas com polidilicina e laminina em uma placa de cultura de 24 po&ccedil;os. De um tumor c&uacute;bico de um cent&iacute;metro, podem ser cultivados de 24 a 32 po&ccedil;os; portanto, para a maioria dos tumores menores, planejar de oito a 16 po&ccedil;os de c&eacute;lulas em cultura &eacute; apropriado.Após a centrifugação, descarte o sobrenadante e re-suspenda o sedimento celular no meio pré-aquecido, de modo a obter um mililitro de suspensão celular por poço planejado. Utilize uma pipeta serológica de cinco mililitros para aspirar dois mililitros de suspensão celular e depositar um mililitro em um poço da placa de 24 poços. Continue aspirando e depositando o meio contendo células tumorais, aspirando de dois em dois mililitros, dos quais um mililitro é depositado em cada poço planejado, até que a suspensão de células tumorais seja igualmente dividida entre todos os poços preparados.Coloque a placa de 24 poços no incubador a 37 graus Celsius durante a noite. Verifique a placa no dia seguinte; se for observado detrito significativo no fundo dos poços, troque cuidadosamente o meio em cada poço por meio de cultura DMEM F12 suplementado novo, tomando cuidado para não desalojar as células aderentes. Se não houver detritos, retorne a placa ao incubador e troque o meio pela primeira vez no quinto dia e a cada três dias subsequentemente.Esta imagem de campo claro ilustra o padrão organizacional típico de células de schwannoma vestibular em cultura. Essas imagens de imunofluorescência de uma cultura primária de schwannoma vestibular humano foram obtidas após 48 horas de exposição ao ink 80 que expressa GFP, mostrado em verde. A fluorescência vermelha provém da imunomarcação com faloídimina F-actina, que marca o citoesqueleto, e a fluorescência azul é o DAPI, que marca o núcleo.O recorte é uma imagem com maior aumento de uma região da imagem de baixo aumento. Ao realizar este procedimento, é importante registrar os horários em que a amostra de secreção e a amostra de cultura foram colocadas na incubadora, para garantir que as etapas subsequentes sejam realizadas após os períodos de incubação corretos. Após este procedimento, outros métodos, como transdução viral, fixação, imunofluorescência, tratamento com fármacos e extração de RNA, podem ser realizados para responder a questões adicionais, como a forma como diferentes vírus são expressos nas células ou como a expressão gênica muda após o tratamento com fármacos.Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de pesquisa de schwannoma vestibular explorarem a maneira como células humanas primárias respondem a diferentes medicamentos em pacientes vivos que se submeteram a cirurgia.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Um método é descrito para medir tridimensionais reflexos oculares vestíbulo (3D VOR) em seres humanos, utilizando um prazo de seis graus de liberdade (6DF) simulador de movimento. O ganho e o desalinhamento da VOR angular 3D fornecer uma medida directa da qualidade da função vestibular. Os dados representativos em indivíduos saudáveis ​​são...

Tridimensional Vestibular Ocular Teste Reflex Usando um Six Degrees of Platform Movimento Liberdade

Schwannomas vestibulares (VSS) são tumores não-malignos de células de Schwann (SC), origem associados com mutações no gene supressor de tumores de NF2. Apresentamos um protocolo reprodutível e eficiente para humano primário VS cultura celular que permite a manipulação experimental celular e molecular e análise e recapitula a heterogeneidade da doença humana.

Cultura primária de Vestibular Humano Schwanomas

Para avaliar as alterações morfológicas dos nervos cranianos, tais como perda de neural estruturas ou inchaço dos nervos cranianos em doenças da doença (MD) ou em pessoas saudáveis na vivo, um protocolo de avaliação foi desenvolvido usando a ressonância magnética (MRI) . Realizou-se a confirmação adicional baseada em MRI do MD.

Na Vivo Análise morfométrica de humano nervos cranianos, utilizando imagens de ressonância magnética da doença doença ouvidos e orelhas de audição Normal

Um novo método de reabilitação é apresentado para reequilibrar o sistema vestibular em pacientes com respostas assimétricas, que consiste em rotações unidirecionais em direção ao lado mais fraco. Ao modificar diretamente a via vestibular em vez de melhorar os aspectos multissensoriais da compensação, a assimetria pode ser normalizada dentro de 1-2 sessões e mostrar efeitos duradouros.

Uso de rotações unidirecionais para melhorar a assimetria do sistema vestibular em pacientes com disfunção vestibular

A percepção da gravidade é comumente determinada pelo visual subjetivo vertical na posição vertical da cabeça vertical. A avaliação adicional nas inclinações da cabeça de ± 15° e ± 30° no plano de rolo garante maior teor de informação para a detecção de percepção graviceptiva prejudicada.

Avaliação da Percepção Graviceptiva Estática no Plano de Rolagem usando o Paradigma Vertical Visual Subjetivo

Neste artigo, descrevemos a configuração, o material e os procedimentos experimentais para avaliar os movimentos oculares reflexivos, a percepção de movimento e as tarefas cognitivas sob estimulação vestibular magnética, bem como a orientação anatômica dos órgãos vestibulares, em um tomógrafo de ressonância magnética de 7 Tesla (7T-MRT).

Mensuração da influência da estimulação vestibular magnética no nistagmo, autopercepção de movimento e desempenho cognitivo em um MRT 7T

Aqui, descrevemos uma técnica para a coleta de órgãos-alvo vestibulares humanos sob condições fisiológicas durante a labirintectomia e sua análise usando imunocoloração.

Colheita de órgãos-alvo vestibulares sob condições fisiológicas durante a labirintectomia

A metodologia explorou as contribuições visuais e vestibulares para a estabilização do olhar durante as rotações optocinéticas e de corpo inteiro. As estimulações foram realizadas por meio de ensaios visuais, vestibulares e visuovestibulares. O ganho de movimento torcional dos olhos e as frequências do nistagmo serviram como indicadores para a retransmissão subcortical de informações de movimento sensoriais específicas em direção à resposta reflexiva do tronco encefálico para cada tentativa.

Usando o rastreamento ocular para avaliar a importância relativa da entrada visual e vestibular para o processamento de movimento subcortical no plano de rolagem

O manejo do câncer de pulmão recorrente isolado em um campo previamente irradiado é desafiador. Aqui, descrevemos uma injeção de cisplatina guiada por ultrassom endobrônquico (EBUS) para o tratamento de pacientes com recorrência localizada de câncer de pulmão em um campo previamente irradiado.

Endobrônquica ultra-som-guiada injeção intratumoral de cisplatina para o tratamento de Isolated mediastino recorrência de câncer de pulmão

Camundongos portadores do carcinoma do cólon-26 (C26) representam um modelo clássico de caquexia do câncer. A perda progressiva de massa muscular ocorre em associação com o crescimento do tumor, superexpressão de ubiquitina ligases específicas do músculo e reduções na área da seção transversal do músculo. A perda de gordura também é observada. A caquexia é estudada de maneira dependente do tempo, com gravidade crescente da emagrecimento.

O Colon-26 Carcinoma Tumor-rolamento Mouse como um modelo para o estudo do câncer caquexia

Aprenda a processar amostras de schwannoma vestibular humano para cultura primária de células e análise de secreções tumorais. Este método minimamente manipulativo preserva a viabilidade celular e permite testar candidatos terapêuticos diretamente.

Um quadro metodológico unificado para pesquisa de Schwannoma vestibular

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