Um quadro metodológico unificado para pesquisa de Schwannoma vestibular

O objetivo geral deste procedimento é processar uma amostra humana de schwannoma vestibular recebida do centro cirúrgico para cultura primária de células e coleta de secreções tumorais. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de pesquisa de schwannoma vestibular, como a melhor forma de receber, armazenar e processar uma amostra tumoral primária humana destinada ao uso em diversos ensaios biomoleculares. A principal vantagem desta técnica é que utiliza um método de cultura minimamente manipulativo para propagar células primárias humanas de schwannoma vestibular.

As implicações dessa técnica estendem-se à terapia para schwannoma vestibular, pois candidatos terapêuticos promissores podem ser testados diretamente em células cultivadas. Comece transferindo o recipiente com a amostra recém-coletada de schwannoma vestibular ou do nervo auricular maior do gelo utilizado para transporte da sala cirúrgica para uma cabine de fluxo laminar no laboratório. Utilize pinças estéreis para transferir cuidadosamente a amostra para o primeiro de três tubos de 1,5 mililitro contendo 1,4 mililitro de PBS externo.

Feche cada tubo assim que ele conter o espécime e agite suavemente para lavar. Coloque a amostra em uma placa de Petri seca de 60 milímetros e use pinça para remover todos os tecidos mortos em áreas com vasos sanguíneos proeminentes. Use pinça ou lâmina de bisturi para dividir a amostra em pedaços separados para preservação de RNA, extração de proteínas, coleta de secreções, fixação e cultivo celular.

Transfira o fragmento da amostra designado para cultivo celular para uma nova placa de cultura de 60 milímetros contendo de cinco a oito mililitros de meio DMEM F12 suplementado frio. Coloque o fragmento de schwannoma vestibular ou do nervo auricular maior designado para a coleta de secreções em um tubo vazio de 1,5 mililitro. Comece pipetando 500 microlitros de DMEM não suplementado com FBS em dois tubos de 1,5 mililitro.

O primeiro tubo será usado para coletar as secreções tumorais e o segundo tubo servirá como controle pareado. Coloque um dos tubos contendo DMEM sobre uma balança digital calibrada. Zere a balança, coloque o fragmento de espécime designado para a coleta de secreções dentro do tubo e pese-o.

Observe o resultado, que representará o peso do tecido isolado. Sob uma capela de fluxo laminar, ajuste o volume de DMEM no tubo para 100 microlitros por 10 miligramas da amostra. Coloque o tubo contendo a amostra de tecido e seu controle pareado no incubador.

Incube por pelo menos 72 horas, para coletar quantidades biologicamente úteis de secreções tumorais ou nervosas. Após a incubação por 72 horas, utilize uma pipeta de um mililitro para remover o meio contendo a secreção do espécime. Para evitar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento, alíquotas o meio em novos tubos de acordo com a análise posterior planejada.

Armazene o fragmento original do tecido, as secreções e o DMEM controle em um congelador a menos 80 graus Celsius até que os procedimentos subsequentes sejam iniciados. Inicie o procedimento de cultura utilizando um par de pinças em cada mão para separar o tecido do schwannoma vestibular em fragmentos de aproximadamente um milímetro cúbico. Em seguida, aspire o meio e os fragmentos tumorais com uma pipeta serológica de 10 milímetros e transfira todo o conteúdo para um tubo cônico de 15 mililitros.

Centrifugue por três minutos a 1000G a 25 graus Celsius. Durante a centrifugação, prepare o meio de desintegração combinando 4,7 mililitros de meio DMEM F12 suplementado com 250 microlitros de colagenase e 50 microlitros de hialuronidase em uma placa de cultura de 60 milímetros. Após a centrifugação, os fragmentos tumorais formarão um pellet no fundo do tubo cônico.

Aspire cuidadosamente e descarte o sobrenadante. Em seguida, adicione dois mililitros de meio de desintegração contendo enzima recém-preparado ao palato tumoral. Pipete para cima e para baixo várias vezes para mobilizar o tecido e, então, transfira-o para a placa de cultura de 60 milímetros.

Coloque a placa de cultura no incubador por 18 horas. No dia seguinte, aqueça o meio DMEM F12 suplementado com 10% de FBS e 1% de penicilina-estreptomicina em banho-maria a 37 graus Celsius. Remova a placa contendo a cultura de schwannoma vestibular do incubador e transfira para a cabine de fluxo laminar. Usando uma agulha de 22 gauge acoplada a uma seringa de seis mililitros, aspire o meio contendo a cultura e transfira para um novo tubo cônico de 15 mililitros.

Centrifugue por cinco minutos a 1000G a 37 graus Celsius. Enquanto isso, use pinças estéreis para colocar o número necessário de lamínulas de vidro revestidas com polidilicina e laminina em uma placa de cultura de 24 poços. De um tumor cúbico de um centímetro, podem ser cultivados de 24 a 32 poços; portanto, para a maioria dos tumores menores, planejar de oito a 16 poços de células em cultura é apropriado.

Após a centrifugação, descarte o sobrenadante e re-suspenda o sedimento celular no meio pré-aquecido, de modo a obter um mililitro de suspensão celular por poço planejado. Utilize uma pipeta serológica de cinco mililitros para aspirar dois mililitros de suspensão celular e depositar um mililitro em um poço da placa de 24 poços. Continue aspirando e depositando o meio contendo células tumorais, aspirando de dois em dois mililitros, dos quais um mililitro é depositado em cada poço planejado, até que a suspensão de células tumorais seja igualmente dividida entre todos os poços preparados.

Coloque a placa de 24 poços no incubador a 37 graus Celsius durante a noite. Verifique a placa no dia seguinte; se for observado detrito significativo no fundo dos poços, troque cuidadosamente o meio em cada poço por meio de cultura DMEM F12 suplementado novo, tomando cuidado para não desalojar as células aderentes. Se não houver detritos, retorne a placa ao incubador e troque o meio pela primeira vez no quinto dia e a cada três dias subsequentemente.

Esta imagem de campo claro ilustra o padrão organizacional típico de células de schwannoma vestibular em cultura. Essas imagens de imunofluorescência de uma cultura primária de schwannoma vestibular humano foram obtidas após 48 horas de exposição ao ink 80 que expressa GFP, mostrado em verde. A fluorescência vermelha provém da imunomarcação com faloídimina F-actina, que marca o citoesqueleto, e a fluorescência azul é o DAPI, que marca o núcleo.

O recorte é uma imagem com maior aumento de uma região da imagem de baixo aumento. Ao realizar este procedimento, é importante registrar os horários em que a amostra de secreção e a amostra de cultura foram colocadas na incubadora, para garantir que as etapas subsequentes sejam realizadas após os períodos de incubação corretos. Após este procedimento, outros métodos, como transdução viral, fixação, imunofluorescência, tratamento com fármacos e extração de RNA, podem ser realizados para responder a questões adicionais, como a forma como diferentes vírus são expressos nas células ou como a expressão gênica muda após o tratamento com fármacos.

Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de pesquisa de schwannoma vestibular explorarem a maneira como células humanas primárias respondem a diferentes medicamentos em pacientes vivos que se submeteram a cirurgia.