Name: In Vitro Polimerização de F-Actina no início endossomos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: Aprenda a reconstituir a polimerização de F-actina em endossomos iniciais usando células HeLa. Este ensaio in vitro permite manipulações bioquímicas e estudos de dinâmica do citoesqueleto em tráfego de membranas.

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Apoio recebido dos Swiss National Science Foundation; o programa Sinergia suíço; os polonês-Swiss investigação programa (PSPB-094/2010); o NCCR em biologia química; e LipidX da iniciativa Suíça SystemsX.ch, avaliada pela Swiss National Science Foundation (a G.). O. M. foi apoiado por uma comunhão de longo prazo EMBO (ALTF-516-2012).

1. soluções e preparações Nota: todos os buffers e soluções devem ser preparadas em bidestilada (dd) H 2 O. Porque varia o estado de hidratação de sacarose, a concentração final de todas as soluções de sacarose deve ser determinada usando um refratômetro.
<ol><li>Preparar fosfato salino sem cátions divalentes (PBS-): 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH 2 PO 4 e 6,5 mM Na 2 HPO 4. Ajuste o pH para 7,4. Esterilizar em autoclave (1 ciclo a 121 ° C por 15 min) e armazenar à temperatura ambiente.</li>
	<li>Prepare uma solução stock de imidazol 300mm: 0,204 g de imidazol em 10 mL de DDQ 2 O.Adjust o pH para 7,4 a 4 ° C, utilizando HCl. filtro-esterilizar usando um 0,22 μm filtro de tamanho de poros e armazene a 4 ° C.</li>
	Buffer de <li>preparar homogeneização (HB; preparar cerca de 100 mL): sacarose de 250 mM em imidazole de 3 mM. Ajuste o pH para 7,4 a 4 ° C, usando um medidor de pH. Filtro-esterilizar usando um filtro de tamanho de poros de 0,22 μm e armazene a 4 ° C. complemento a HB imediatamente antes da utilização, com um coquetel de inibidores de protease em concentrações finais correspondentes a leupeptin de 10 mM, 1 mM pepstatin A e 10 ng/mL aprotinina.</li>
	<li>Para os gradientes de flutuação de passo, prepare-se 62%, 39% e 35% de sacarose soluções em imidazole de 3 mM, pH 7,4, conforme descrito abaixo. Determinar precisamente a concentração final de todas as soluções de sacarose, usando um refratômetro.
	<ol><li>Preparar 100 mL de solução de sacarose de 62% no imidazole de 3 mM, pH 7,4. Dissolver agitando 80,4 g de sacarose em ddH 2 O pré aquecido a 35 ° C. adicionar 1 mL de solução estoque de imidazol 300mm e fill para 100 mL com DDQ 2 O. ajustar o pH para 7,4 em 4 ° C. Filter-esterilizar usando um 0,22 μm filtro de tamanho de poro e loja a 4 ° C.</li>
		<li>Preparar 100 mL de solução de sacarose de 35% no imidazole de 3 mM, pH 7,4. Dissolver agitando 40,6 g de sacarose em ddH 2 O. adicionar 1 mL de solução-mãe de imidazol 300mm e preencher a 100 mL com DDQ 2 O. ajustar o pH para 7,4 em 4 ° C. Filter-esterilizar usando um 0,22 μm filtro de tamanho de poros e armazene a 4 ° C.</li>
		<li>Preparar 50 mL de 39% de sacarose em imidazole de 3 mM, pH 7,4. Dilua a solução de sacarose de 62% com a solução de sacarose de 35%. Loja a 4 ° C.</li>
	</ol></li> <li>Dissolver 3 g de paraformaldeído (PFA) por agitação em 100 mL de PBS-pré-warmed a 60 ° C, enquanto a adição de 1 M de NaOH gota a gota; ajustar o pH final a 7,4 usando NaOH. Filtro-esterilizar usando um filtro de tamanho de poros de 0,22 μm e armazenar a -20 ° C. 
	Atenção: 3% PFA é um reagente tóxico.</li>
	<li>Solução preparar 1 M KCl. Dissolver 3,73 g de KCl por agitação em 50 mL de DDQ 2 O. Filter-esterilizar usando um filtro de tamanho de poros de 0,22 μm e armazenar à temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparar 50 X concentrado de solução contendo 0,625 M Hepes pH 7.0 e 75 mm MgOAc 2 em ddH 2 O. alíquota e loja em -20 ° C.</li>
	<li>Preparar o meio de montagem. Misture mexendo 2,4 g de poly(vinyl alcohol) M w ~ 31.000 (PVA) com 6 g de glicerol. Adicionar 6 mL de DDQ 2 O e deixe pelo menos 2 h à temperatura ambiente. Adicionar 12 mL de 0.2 M Tris-Cl (pH 8,5) e calor para aproximadamente 53 ° C, com ocasionais, mexendo até dissolver o PVA.</li>
	<li>Esclarecer a solução por centrifugação a 5.000 x g por 20 min em temperatura ambiente. Recolher o sobrenadante e adicionar 2,5% (p/v) 1,4 - diazabiciclo-[2.2.2] octano (DABCO) para evitar o fotobranqueamento durante a detecção de fluorescência. Vórtice por cerca de 30 s para dissolver. Alíquota em tubos plásticos de 1,5 mL e loja em -20 ° C.</li>
</ol> 2. Cultura de células <ol><li>células HeLa cultura Dulbecco &#39; s Modified Eagle suplementado com soro fetal bezerro de 10%, 10% não aminoácidos essenciais, 10% L-glutamina e 1% penicilina-estreptomicina. Mantê-los a 37 ° C numa incubadora 5% CO 2.</li>
	<li>Transfect as células 24 h antes do experimento com GFP-RAB5 10, usando o reagente de transfeccao comercial de acordo com o fabricante &#39; instruções de s.</li>
	<li>Quando necessário, preparar CDDP fracções e citoplasma de células empobrecido de uma proteína de interesse (ou seja, usando o RNAi ou CRISPR/Cas9) e/ou superexpressão forma sua ou mutante da proteína de interesse.</li>
</ol> 3. Preparação de fração CDDP Nota: Este protocolo descreve a preparação simples de frações subcelulares contendo endossomos e outras membranas de luz. Se necessário, purificada endossomo frações também podem ser usados 11. Prepare 2 placas de Petri (10 cm diâmetro exterior; 57 cm 2) de confluentes expressando GFP-RAB5 como material de partida. O número total de células de HeLa confluentes em 2 pratos de Petri corresponde aproximadamente 2,5 x 10 7 células. Quando necessário, os endossomos pode também ser preparados de células empobrecidas de uma proteína de interesse (ou seja, usando o RNAi ou CRISPR/Cas9) e/ou superexpressão forma sua ou mutante da proteína de interesse, sempre expressando GFP-RAB5.
 atenção: todas as etapas do protocolo de fracionamento devem ser executadas no gelo
<ol><li>Coloque os pratos de Petri em uma placa de metal molhado em um balde de gelo plano e lave imediatamente as células duas vezes com 5 mL de PBS gelado....</li>
	<li>Retire todos os PBS - a última lavagem e adicionar 3 mL de PBS gelado-por prato. Células não devem secar durante a manipulação: se necessário, coloque o balde de gelo sobre uma plataforma oscilante para cobrir adequadamente as células com fluido.</li>
	<li>Remover mecanicamente as células em PBS desde os pratos de Petri usando um policial de borracha flexível (ou seja, raspador de celular caseiro). Raspe as células fora os pratos primeiro em um rápido movimento circular do lado de fora do prato, seguido de um movimento para baixo no meio do prato. Raspe suavemente para obter &#34; folhas &#34; de células anexadas. Delicadamente, transferir as células usando uma pipeta Pasteur plástica com uma grande abertura para um tubo polipropileno cônico de 15 mL no gelo</li>
	<li>Centrifugue por 5 min a x 175 g e 4 ° C.</li>
	<li>Gentilmente remover o sobrenadante (SN) e adicionar 1-3 mL de HB ao pellet. Usando uma pipeta Pasteur plástica com uma abertura larga, suavemente Pipetar acima e para baixo uma vez para Ressuspender as células.</li>
	<li>Centrífuga para 7-10 min a 1.355 x g e 4 ° C. delicadamente remova o SN.</li>
	<li>Executar homogeneização célula. 
	Nota: Condições devem ser suaves para que as membranas de plasma das células estão quebradas mas os endossomos permanecem intactos.
	<ol><li>Adicionar um volume conhecido de HB com inibidores de protease para cada centrifugado (aproximadamente 100 μL por centrifugado). Suavemente utilizando uma micropipeta de 1.000 µ l, pipete acima e para baixo até que as células são resuspended. Não introduzir bolhas de ar.</li>
		<li>Preparar uma seringa de tuberculina 1 mL com agulha 22g previamente enxaguada com HB e livre de ar ou bolhas.</li>
		<li>Encha a seringa com a suspensão de células relativamente lentamente (para evitar a criação de bolhas de ar), coloque a ponta chanfrada da agulha contra a parede do tubo e expulsar a suspensão de células rapidamente ao cisalhamento fora das membranas de plasma das células anexadas.</li>
		<li>Tomar uma pequena alíquota do homogeneizado (aproximadamente 3 µ l) e diluir em 50 µ l de HB sobre uma lâmina de vidro. Mix e cobrir com uma lamela de vidro. Inspecionar o homogenate sob um microscópio de contraste de fase, equipado com um X de 20 ou 40 objetivo X. 
		Nota: Sob condições ideais, a maioria das células são quebradas, mas não são núcleos que aparecem como cinza escuro e redonda estruturas, ( Figura 1).</li>
		Repita o passo 3.7.3 e 3.7.4 até a maioria das células de <li>está quebrados; geralmente, 3-6 traços ascendentes e descendentes através da agulha são necessários. Manter uma pequena alíquota (10-30 µ l) do homogeneizado para determinação de proteína.</li>
	</ol></li> <li>Centrífuga homogeneizado por 7 min em 1.355 x g e 4 ° C. 
	Nota: após a centrifugação, a pelota (definida como a pelota nuclear; NP) contém os núcleos e o sobrenadante (definido como o sobrenadante pós-nucleares; PNS) contém o citoplasma e as organelas, liberadas após homogeneização e em suspensão livre.</li>
	<li>Recolher cuidadosamente o PNS. Manter pequenas alíquotas (10-30 µ l) do PNS e NP para determinação de proteína e descartar o NP.</li>
	<li>Ajustar o PNS para 40,6% de sacarose, diluindo a solução de sacarose de 62% com PNS usando uma relação de 1:1.1 de PNS:62% de sacarose. Misture delicadamente mas completamente, sem criar bolhas de ar. Verificar a concentração de sacarose usando o refratômetro.</li>
	<li>Lugar o PNS em 40,6% sacarose no fundo de um tubo de ultracentrifugação. Cuidadosamente com 2,5 mL de solução de sacarose a 35% de sobreposição e encher o tubo de centrífuga com HB. 
	Nota: As soluções de sacarose devem ser em camadas para que interfaces são claramente visíveis.</li>
	<li>Se os gradientes por 1h no ̴165, 000 x g e 4 ° C.</li>
	<li>Remova com cuidado a camada branca de lipídios no topo do gradiente. Em seguida, recolher a interface contendo endossomos, entre o HB e 35% de sacarose, utilizando uma micropipeta 200 μL com uma ponta de corte. 
	Nota: As frações CDDP pode ser usadas diretamente no ensaio de polimerização de actina em vitro ou pode ser aliquotadas no gelo, congelado em nitrogênio líquido e armazenado a -80 ° C.</li>
	<li>Determinar a concentração de proteína das frações PNS e CDDP. 
	Nota: Esta concentração deve ser de pelo menos 100 µ g/mL. Aproximadamente 2,5 x 10 7 células cultivadas em 2 placas de Petri são necessárias para obter um PNS pelo menos 100 µ g/mL (ver observação acima).</li>
</ol> 4. Preparação do citosol Nota: preparar 2 placas de Petri (10 cm de diâmetro; 57 cm 2) de células de HeLa confluentes como material de partida. Quando necessário, o citosol também pode ser preparado de células empobrecidas de uma proteína de interesse (ou seja, usando o RNAi ou CRISPR/Cas9) e/ou superexpressão uma sua ou forma mutante da proteína de interesse. Quanto ao protocolo de fraccionamento do endossomo, todas as etapas devem ser executadas no gelo
<ol><li>Repita os passos 3.1-3.8.</li>
	<li>Colocar o PNS num tubo de centrífuga e se por 45 min em ̴250, 000 x g e 4 ° C.</li>
	<li>Cuidadosamente remover a camada branca por cima e coletar o SN (fração do citosol) sem perturbar o sedimento do microsome. Manter uma alíquota da fração citosol para determinação de proteína. 
	Nota: O citosol pode ser usado diretamente no ensaio de polimerização de actina em vitro ou pode ser aliquotadas no gelo, congelado em nitrogênio líquido e armazenado a -80 ° C.</li>
	<li>Determinar a concentração de proteínas do citosol. 
	Nota: Deve ser pelo menos de 3 mg/mL.</li>
</ol> 5. Ensaio de medição de polimerização de actina endossomo-dependente In Vitro Nota: polimerização de actina endossomo-dependente pode ser realizada usando duas abordagens alternativas. Na primeira abordagem, os materiais são misturados em um tubo de ensaio, fixo e transferidos para uma lamela e analisados. Na segunda abordagem, descrita aqui, o ensaio pode ser realizado diretamente na câmara de imagem e pode ser fixo e analisado sem perturbação mecânica ( Figura 2). Nesta segunda abordagem, a mistura de ensaio não é transferida de um tubo de ensaio para uma lamela e assim permanece imperturbável, diminuindo o perigo das redes de F-Actina fisicamente ser perturbado durante a transferência. Além disso, esta segunda abordagem é compatível com uma análise de lapso de tempo de polimerização de F-Actina. Note-se que não há diferença na análise da polimerização de F-Actina foi observada com qualquer abordagem. 
Nota: Uso corte dicas em todo o protocolo.
<ol><li>Em um tubo de ensaio <ol><li>delicadamente mistura gelada purificada GFP-RAB5 endossomos (etapa 3) com o citosol (passo 4) em uma proporção de 01:10 (concentração de proteína) em um tubo de ensaio cónico 1,5 mL gelado. 
		Nota: Um experimento típico é realizado com aproximadamente 40-50 µ l.</li>
		<li>Ajustar a mistura de reação gelada para concentrações finais de KCl (usando a solução KCl 1 M) de 125 mM, 12,5 mM Hepes e 1,5 mM MgOAc 2 (usando o 50 x solução estoque). Em seguida, ajuste a mistura com inibidores de protease para concentrações finais de 10 mM leupeptin, pepstatin de 1 mM A e 10 ng/mL aprotinina. Misture suavemente todos os componentes.</li>
		<li>Coloque o tubo de ensaio contendo a mistura de reação a 37 ° C, sem agitação e incubar durante o tempo desejado. 
		Nota: Normalmente, vai demorar cerca de 3 min para detectar a polimerização de actina no endossomos e 30 min. para a formação de uma extensa rede.</li>
		<li>Ao tempo desejado (i.e., 3 min ou 30 min), parar a reação, colocando o tubo de ensaio no gelo e adicione 1/10 (vol: Vol) da solução pré-resfriada 3% PFA.</li>
		<li>Adicionar 0.3:10 (vol: Vol) de 200 unidades/mL (~6.6 μM) faloidina conjugada com corante vermelho-alaranjado para manchar a actina polimerizada.</li>
		<li>Lugar 12 μL da mistura para 12 μL de meio de montagem de PVA em um slide de vidro micro. Colocar um tampo de coverslipon de vidro 18 x 18 mm 2.</li>
		<li>Analisar a amostra com microscopia confocal.</li>
	</ol></li> <li>Na câmara de imagens <ol><li>para fazer câmaras de imagens microscópicas, utilize plasma limpa por 1 min para limpar uma lamela rodada 18-mm de diâmetro e um diâmetro de 35mm redondo equipado com um fundo de vidro de 20 mm placa de Petri (0.16-0,19 mm).</li>
		<li>Incubar as superfícies limpas com 1% de β-caseína por 20 min minimizar o emperramento da proteína para o vidro. Lave duas vezes com imidazol de 3 mM.</li>
		<li>Add endossomo e citoplasma, no mesmo ensaio mistura como em etapas 5.1.1 e 5.1.2, para um tubo de ensaio pré-resfriado 1,5 mL e complementar a mistura de ensaio com 0,1 μg/μL rodamina-actin.</li>
		<li>Ajustar o índice de refração final da mistura para 1.375 (26,5% de sacarose) usando a solução de sacarose de 39%. 
		Nota: Normalmente, o mesmo volume é adicionado; no entanto, isso tem que ser re-ajustada empiricamente dependendo da concentração de sacarose da fração coletada, determinada usando um refractomer, uma vez que a concentração de sacarose pode alterar um pouco de experimento para experimento.</li>
		<li>Coloque a mistura sobre o prato de 35mm pré-tratamento (etapa 5.2.1) e cubra-o com a lamela de 18mm pré-tratamento (etapa 5.2.1).</li>
		<li>Coloque a câmara a 37 ° C, sem agitação.</li>
		<li>Analisar a amostra usando microscopia de fluorescência confocal.</li>
	</ol></li></ol> 6. Imagem Acquisition e análise de redes de actina <ol><li>aquisição de imagem <ol><li>adquirir as imagens em um microscópio confocal invertido. 
		Nota: Definições de aquisição de imagem foram otimizadas para um invertido microscópio confocal com um objectivo de óleo at 63 X 1,25. Ajustar a potência do laser (geralmente em torno de 50%) para alcançar uma boa relação sinal-ruído.</li>
	</ol></li> <li>Quantificação da rede actina <ol><li>analisar as micrografias fluorescentes. Use o software opensource CellProfiler (2.1.1) 12 para medir a quantidade de actina por endossomo (alternativa de software pode ser usada).
		<ol><li>Em primeiro lugar, identificar endossomos como objeto primário usando o sinal de GFP-RAB5. Em seguida, quantificar a F-Actina associada com endossomos individuais usando a propagação do sinal de actina (corante vermelho-laranja conjugados faloidina) como um objeto secundário.</li>
			<li>Média e normalizar o número de material associado para cada objeto à condição controle.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Actina desempenha um papel crucial na endossomo membrana dinâmica4,14. Informamos anteriormente que a polimerização e a nucleação de actina ocorrem em endossomos iniciais, formando pequenas manchas de F-Actina ou redes. Estas redes de F-Actina são absolutamente necessários para o transporte de membrana além endossomos iniciais ao longo da via de degradação. Interferir em qualquer etapa deste processo de nucleação e polimerização impede endossomo maturação e, port...

Em células eucarióticas superiores, proteínas e lipídios são internalizados em endossomos iniciais onde ocorre a classificação. Algumas proteínas e lipídios, que são destinados a ser reaproveitado, são incorporados em regiões tubulares dos endossomos iniciais e então transportados para a membrana plasmática ou para o trans-Golgi network (TGN)1,2. Em contraste, outras proteínas e lipídios são seletivamente empacotados em regiões dos endossomos iniciais que exibem uma aparência multivesiculares. Estas regiões expandir e, após descolamento de membranas de CDDP cedo, eventualmente maduro em vesículas de transportadora CDDP livre ou corpos multivesiculares (ECV/MVBs), que são responsáveis para o transporte de carga para tarde endossomos1, 2.
Actina desempenha um papel crucial no processo de remodelação de membrana associado com capacidade de classificação CDDP e biogênese endossomo. Proteína ao longo dos caminhos de reciclagem para a membrana plasmática ou para o TGN depende o retromer complexo e as proteínas associadas. Esta classificação máquinas parecem ser atrelado à formação de reciclagem túbulos através de interações do complexo, o retromer com a vespa e cicatriz homólogo (lavagem) ramificado e complexo actina3,4,5 . Em contraste, as moléculas destinados a degradação, particularmente ativado receptores de sinalização, são classificadas em vesículas intraluminal (ILVs) pelo CDDP classificação complexos necessários para transporte (ESCRT)2,6, 7. Enquanto o possível papel de actina no processo de classificação de ESCRT-dependente não é conhecido, F-Actina desempenha um papel importante na biogênese de ECV/MVBs e no transporte, além de endossomos iniciais. Em particular, encontramos que anexina A2 vincula colesterol enriquecido regiões do endossomo precoce e juntamente com spire1, nucleates polimerização F-Actina. A formação da rede ramificada actina observada no endossomos requer a atividade de ramificação da proteína actina-relacionados (ARP) 2/3 complexo, bem como a moesin de proteína ERM e o emperramento do actínio proteína ciclina8,9.
Aqui, descrevemos um ensaio baseado em microscopia em vitro que reconstitui a nucleação e polimerização de F-Actina nas membranas de CDDP precoce em tubos de ensaio. Este ensaio tem sido usado anteriormente para investigar o papel da anexina A2 na nucleação de F-Actina e da moesin e ciclina na formação da CDDP actina redes8,9. Com este protocolo em vitro , a complexa série de reações que ocorrem na endossomos durante a polimerização de actina tornam-se receptivos à análise bioquímica e molecular das etapas sequenciais do processo, incluindo a nucleação de actina, linear polimerização, ramificação e reticulação.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71380</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Acros Organics</td><td>196770010</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>AppliChem</td><td>A1042</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Acros Organics</td><td>424370025</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>AppliChem</td><td>A3724</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de magnesiun tetrahidratado</td><td>Fluka</td><td>63047</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td> <td>AppliChem</td><td>A2948</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10125</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fluka</td><td>71690</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Merck Millipore</td><td>107687</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptina</td><td>Roche</td><td>11017101001</td><td></td></tr><tr><td>Pestatina</td><td>Roche</td><td>10253286001</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Roche</td><td>10236624001</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehide</td><td>Polysciences. Inc</td><td>380</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 phalloidin</td><td>Sondas Moleculares</td><td>A34055</td><td></td></tr><tr><td>Actina rodamina</td><td>Citoesqueleto. Inc</td><td>APHR-A</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381</td><td>poli(álcool vinílico), Mw ~31 000</td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-2522</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>AppliChem</td><td>A1086</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-caseína</td><td>Filtro Sigma-Aldrich</td><td>C6905</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &mu; m</td><td>Millex</td><td>SL6V033RS</td><td></td></tr><tr><td>Pratos redondos de 10 cm para cultura de células</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150350</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de plástico Pasteur</td><td>Assistent</td><td>569/3 40569003</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de polipropileno de 15 mL</td><td>TPP</td><td>91015</td><td></td></tr><tr><td>Agulha hipodérmica 22G Preto 30mm</td><td>BD Microlance</td><td>300900</td><td></td></tr><tr><td>Seringas estéreis Luer-slip 1mL sem agulha</td><td>BD Plastipak</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>Micro lâminas de vidro</td><td>Assistent</td><td>2406</td><td></td></tr><tr><td>18 x 18 mm lamínula de vidro</td><td>Assistent</td><td>1000/1818</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga SW60</td><td>Relha</td><td>Beckman 344062</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga TLS-55</td><td>Relha</td><td>Beckman 343778</td><td></td></tr><tr><td>200-&mu; L ponta amarela</td><td>Starlab</td><td>S1111-0706</td><td></td></tr><tr><td>1.000-&mu; L Blue Ponta Graduada</td><td>Starlab</td><td>S1111-6801</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de ensaio de 1,5 mL</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C 311-04-051</td><td></td></tr><tr><td>Lamínula redonda de 18 mm de diâmetro</td><td>Assistent</td><td>1001/18</td><td></td></tr><tr><td>Prato redondo de 35 mm de diâmetro com fundo de vidro de 20 mm (0,16 - 0,19 mm)</td><td>Refratômetro científico in vitro</td><td>D35-20-1.5-N</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Carl Zeiss</td><td>79729</td><td></td></tr><tr><td>Limpador de plasma</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall WX80 Ultracentrífuga</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46900</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrífuga de mesa</td><td>relha Beckman relha</td><td>TL-100</td><td></td></tr><tr><td>rotor SW60</td><td>relha Beckman</td><td>335649</td><td></td></tr><tr><td>rotor TLS-55</td><td>relha Beckman relha</td><td>346936</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia confocal</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM-780</td><td></td></tr><tr><td>Fugene HD reagente de transfecção</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de ensaio de proteína A</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0113</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de ensaio de proteína B</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0114</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de ensaio de proteína S</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0115</td><td></td></tr><tr><td>Raspador de células</td><td>caseiro</td><td></td><td>Peça de borracha de silicone de cerca de 2 cm, cortada em um ângulo muito agudo e presa a uma barra de metal ou presa com pinça</td></tr><tr><td>Refratômetro</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium Eagle (MEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0643</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>MEM Aminoácidos Não Essenciais (NEAA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Medidor de pH 691</td><td>Metrohm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td></td><td></td><td>NIH, Bethesda MD</td></tr></tbody></table>

in vitro polimerização de f-actina no início endossomos

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

Muitas funções endossomo precoce, particularmente carga proteína classificação e membrana deformação, dependem de patches de curto F-Actina filamentos nucleated na membrana da CDDP. Nós estabelecemos um ensaio baseado em microscopia em vitro que reconstitui a nucleação e polimerização de F-Actina nas membranas de CDDP precoce em tubos de ensaio, tornando assim esta complexa série de reações passíveis de genética e bioquímica manipulações. CDDP frações são preparadas pela flutuação em gradientes de sacarose de celulas que expressam a início CDDP proteína GFP-RAB5. Citosólica frações são preparadas a partir de lotes separados das células. Tanto CDDP e citosólica frações podem ser armazenadas congelados em nitrogênio líquido, se necessário. No ensaio, o CDDP e frações citosólica são misturadas, e a mistura é incubada a 37 ° C, sob condições adequadas (por exemplo, força iônica, reduzindo o ambiente). No momento desejado, a mistura de reação é fixo, e a F-Actina é revelado com faloidina. Polimerização e nucleação de actina são então analisados por microscopia de fluorescência. Aqui, nós relatamos que este ensaio pode ser usado para investigar o papel dos fatores que estão envolvidos na nucleação de actina na membrana, ou no subsequente alongamento, ramificação ou reticulação de filamentos de actina-F.

Para obter insights sobre a formação de manchas de F-Actina nas membranas de endossomo precoce, seguimos o protocolo descrito na Figura 2. Resumidamente, as células foram transfectadas com GFP-RAB5 e então endossomos iniciais foram preparados pelo fraccionamento subcelular. Estes purificada endossomos iniciais foram incubados com o citosol a fim de proporcionar a actina, em si, bem como outros fatores possivelmente envolvidos na reação. No final do período de...

Funções de endossomo precoce dependem de polimerização de F-Actina. Aqui, descrevemos um ensaio baseado em microscopia em vitro que reconstitui a nucleação e polimerização de F-Actina nas membranas de CDDP precoce em tubos de ensaio, tornando assim esta complexa série de reações passíveis de bioquímicos e genéticos manipulações.

In Vitro Polimerização de F-Actina no início endossomos

Many early endosome functions, particularly cargo protein sorting and membrane deformation, depend on patches of short F-actin filaments nucleated onto ...

O objetivo geral deste ensaio in vitro baseado em microscopia é estudar a polimerização da actina a partir de endossomos in vitro. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas de tráfego de membranas e actina, como o papel da actina na via ácida. A principal vantagem dessa técnica é a capacidade de reconstituir a nucleação e polimerização da F-actina em membranas endossomais precoces no tubo de ensaio.Isso torna esta complexa série de reações passível de minhas manipulações químicas. O procedimento será demonstrado por Jorge Larios e Olivia Muriel do laboratório. Comece colocando placas de células HeLa sobre uma placa metálica úmida em um balde de gelo plano.E lave as células duas vezes com cinco mililitros de PBS gelado. Após remover o PBS da última lavagem, adicione três mililitros de PBS gelado por placa. Em seguida, use um espátula de borracha flexível para desprender as células das placas com um movimento circular rápido ao redor da borda externa da placa.Em seguida, realize um movimento descendente no centro da placa. Raspe suavemente para obter lâminas de células aderidas. A seguir, utilize uma pipeta de Pasteur de plástico com abertura ampla para tra

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Descrevemos como micro e photomanipulation técnicas tais como o FRAP e photoactivation permitem a determinação de parâmetros de motilidade e a spatiotemporal dinâmica de proteínas dentro de migração de células. Leituras experimentais incluem subcellular dinâmica e volume de negócios de reguladores da motilidade ou o citoesqueleto de actina subjacente.

Técnicas de micromanipulação, permitindo a análise da dinâmica morfogenética e rotatividade dos reguladores do citoesqueleto

Relatamos um ensaio simples, eficiente e de alta produtividade baseado em espectroscopia de fluorescência para a quantificação de filamentos de actina em amostras biológicas ex vivo de tecidos cerebrais de roedores e seres humanos.

Um ensaio baseado em espectroscopia de fluorescência com eficiência temporal para avaliar o status de polimerização de actina em roedores e tecidos cerebrais humanos

Apresentamos protocolos para ensaios microfluidos de filamento de actina simples, em combinação com microscopia de fluorescência, que permitem monitorar com precisão filamentos de actina individuais em tempo real, expondo-os sequencialmente a diferentes soluções proteicas.

Usando Microfluidos e Microscopia de Fluorescência para Estudar a Dinâmica de Montagem de Filamentos e Pacotes de Actin Único

Este protocolo descreve a formação de bicamadas lipídicas suportadas e a adição de filamentos citoesqueléticos e proteínas motoras para estudar a dinâmica de redes citoesqueléticas reconstituídas e ligadas à membrana usando microscopia de fluorescência.

Reconstituição de Córtices de Actina Mínima Amarrados à Membrana em Bicamadas Lipídicas Suportadas

Neste manuscrito, demonstramos as técnicas experimentais para encapsular o citoesqueleto F-actin em vesículas lipídicas unilamellar gigantes (também chamadas lipossomos), e o método para formar uma camada de F-actin de córtex biomimicing no folheto interno da membrana lipossosome.

In vitro Reconstituição do Actin Cytoskeleton Dentro de Vesículos Gigantes Unilamellar

Este protocolo é um guia para visualizar actina dinâmica e microtúbulos usando um ensaio de microscopia de fluorescência interna total in vitro (TIRF).

Visualizando a dinâmica de acoplamento de actina e microtúbula in vitro por microscopia de fluorescência interna total (TIRF)

Este trabalho apresenta protocolos para engenharia e caracterização de redes compostas tridimensionais sintonizáveis de filamentos de actina co-emaranhados e microtúbulos. Os compósitos sofrem reestruturação ativa e movimento balístico, impulsionados pelos motores de miosina II e cinesina, e são sintonizados pelas concentrações relativas de actina, microtúbulos, proteínas motoras e reticulantes passivos.

Reconstituindo e caracterizando compósitos de actina-microtúbulo com dinâmica e mecânica sintonizáveis acionadas por motor

Este protocolo descreve como produzir cometas de actina nas superfícies de contas usando ingredientes proteicos comercialmente disponíveis. Tais sistemas imitam as estruturas protuberantes encontradas nas células e podem ser usados para examinar mecanismos fisiológicos de produção de força de forma simplificada.

Reconstituição da Motilidade à Base de Actina com Proteínas Comercialmente Disponíveis

Aqui, apresentamos métodos para preparar conjuntos de actina emaranhados, reticulados e de cristal líquido quase bidimensionais (2D) a partir de proteínas purificadas.

Ajustando os modos de contratilidade e deformação de conjuntos ativos baseados em actina in vitro: de redes ativas bidimensionais a gotas de cristal líquido

Este estudo descreve técnicas biofísicas, bioquímicos e moleculares que caracterizam a actividade acompanhante de Escherichia coli HdeB sob condições de pH ácido. Estes métodos têm sido aplicados com sucesso para outras chaperonas ácido-protectores, tais como HdeA e pode ser modificado para funcionar com os outros acompanhantes e condições de stress.

Detecção da actividade de dependente do pH<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; e<em&gt; In Vivo</em

Aprenda a reconstituir a polimerização de F-actina em endossomos iniciais usando células HeLa. Este ensaio in vitro permite manipulações bioquímicas e estudos de dinâmica do citoesqueleto em tráfego de membranas.

In Vitro Polimerização de F-Actina no início endossomos

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