Viver-pilha medição de odorante Receptor de ativação usando um ensaio de campo em tempo real

O objetivo geral deste ensaio de AMP cíclico de alto rendimento em tempo real é rastrear odores contra receptores de odorantes e vice-versa. Uma vez que os camundongos são úteis para investigar o funcionamento do receptor de odor, pois permitem triagens em maior escala de receptores de odor e ligantes, bem como cartelizações farmacológicas de pares de interesse receptor-ligante. A principal vantagem dessa técnica é que podemos avaliar a ativação do odorante para o receptor de forma eficiente e confiável.

Sistema heterólogo de expressão odorante-receptor usando células vivas. Comece observando as células Hana3A sob um microscópio de contraste de fase para garantir a viabilidade celular e estimar a confluência. Em seguida, aspire todo o meio da placa de cultura de células.

E lave as células adicionando 10 mililitros de solução salina tamponada com fosfato na placa, girando o prato e aspirando o PBS. Em seguida, adicione os três mililitros de 0,5% de tripsina-EDTA no prato. Deixe a tripsina nas células por um minuto ou até que todas as células estejam flutuando.

Inative a tripsina adicionando 5 mililitros de MEM com 10% de FBS e pipetando para cima e para baixo para quebrar pedaços de massa celular. Depois de realizar uma contagem de células, transfira 2x10 para as 6ª células por placa de 96 poços para serem transfectadas em um tubo de 15 mililitros. É importante que você calcule o número correto de células a serem preparadas em uma placa de 96 poços para evitar o crescimento excessivo ou insuficiente das células antes da estimulação.

Centrifugue os tubos a 200 vezes G por cinco minutos. E então aspire o sobrenadante sem perturbar o palete de células. Adicione seis mililitros de meio sem antibióticos para cada placa de 96 poços e pipete para cima e para baixo sem criar bolhas de ar para quebrar pedaços da massa celular.

Transfira as células suspensas para um reservatório. Usando uma pipeta multicanal, pipete 50 microlitros de células em cada poço das placas de 96 poços. Incube durante a noite a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.

Antes da transfecção, observe as células plaqueadas sob um microscópio de contraste de fase para garantir uma confluência adequada de aproximadamente 30 a 50% por poço e, em seguida, retorne à incubadora. Siga a linha marcada com a construção odorante para receptor, as construções do fator acessório e a construção da variante do biossensor AMP cíclico. Em seguida, prepare uma mistura de transfecção de plasma em 500 microlitros de MEM para cada placa de 96 poços.

Em seguida, prepare uma mistura de transfecção contendo 18 microlitros de reagente de transfecção mediada por lipídios em 500 microlitros de MEM. Misture a mistura de transfecção com a mistura de plasma pipetando para cima e para baixo. Em seguida, incube em temperatura ambiente por 15 minutos.

Após a incubação, interrompa a reação adicionando 5 mililitros de MEM com 10% de FBS à mistura de transfecção. Em seguida, espalhe uma espessa camada de toalhas de papel estéreis na capa de cultura de células. Pegue uma placa de 96 poços com células da incubadora.

Delicada e repetidamente, bata o prato de cabeça para baixo na pilha de toalhas de papel para que o meio seja completamente absorvido pela toalha de papel. Transfira 50 microlitros da mistura de transfecção combinada para cada poço da placa de 96 poços e incube durante a noite por 18 a 24 horas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Você pode gerenciar a transfecção e o cronograma de estimulação deve persistir no instrumento, pois mais de uma placa de 96 poços é testada em um experimento para que todas as placas sejam espelhadas após a mesma transfecção e intervalo de exposição dos destiladores.

Antes da estimulação, observe as células transfectadas sob um microscópio de contraste de fase para garantir uma confluência adequada de 50 a 80% por poço antes de retornar à incubadora. Em seguida, prepare o meio de estimulação adicionando 10 pilhas milimolares e cinco glicose milimolar à solução salina balanceada de Hanks. Descongele aloquatos de 55 microlitros de aloquatos de substrato de ensaio de AMP cíclico em tempo real no gelo.

Prepare a solução de abrasão igual a 2% misturando 55 microlitros do reagente do substrato e 2.750 microlitros de meio de estimulação. Depois de espalhar uma espessa camada de toalhas de papel na bancada, bata suave e repetidamente o prato de cabeça para baixo nas toalhas de papel para que o meio de transfecção seja absorvido pelas toalhas de papel. Lave as células pipetando 50 microlitros de meio de estimulação para cada poço.

Bata suave e repetidamente no meio de estimulação da placa de 96 poços. Pipete 25 microlitros de solução de 2% de equibilidade em cada poço e incube em temperatura ambiente no escuro por duas horas. Antes do final do tempo de incubação, dilua as soluções de estoque de odorante descongeladas para concentração de trabalho e meio de estimulação.

Antes da adição de odor, use um leitor de placa de quimioluminescência para medir o nível de luminescência basal da placa. Remova rapidamente a placa do leitor de placas e adicione 25 microlitros das diluições de odor a cada poço. Em seguida, inicie imediatamente a medição contínua da luminescência de todos os poços por 20 ciclos em 30 minutos.

379 receptores de odor humanos únicos foram rastreados contra 30 muscone micromolares usando o ensaio AMP cíclico em tempo real. Blocos coloridos ao longo do eixo X indicam diferentes famílias de receptores de odor humano. O eixo Y representa a luminescência normalizada 30 minutos após a adição do odorante, quando a resposta atingiu o máximo para o controle positivo.

A resposta de OR5AN1 é indicada. Esta figura mostra medições em tempo real da ativação de OR5AN1 por diferentes concentrações de muscone e o resultado de um controle negativo sem odor. A seta indica o ponto de tempo da adição externa.

Aqui, uma curva de resposta de concentração de OR5AN1 contra muscone 30 minutos após a adição de oderant é mostrada. A técnica descrita aqui leva um total de três dias, começando com um prato de estoque de camadas de cultura no primeiro dia. Uma vez dominado, o processo no último dia pode ser concluído em três horas para cada placa de 96 poços, se for executado corretamente.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerenciar a ativação de receptores oderant usando um ensaio de AMP cíclico para aproveitar os resultados.