Name: Viver-pilha medição de odorante Receptor de ativação usando um ensaio de campo em tempo real (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Aprenda a medir a ativação de receptores de odorantes em tempo real usando ensaio de AMP cíclico em células Hana3A. Este método permite triagem eficiente de odorantes para estudos farmacológicos em neurociência.

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O trabalho foi apoiado pelo chinês National Science Foundation (31070972), ciência e tecnologia Comissão de Xangai município (16ZR1418300), o programa para a inovadora pesquisa equipe de Shanghai Municipal Comissão de educação, o Shanghai Oriental Programa acadêmico (J50201) e o programa nacional de pesquisa básica da China (2012CB910401).

1. Culturing e manutenção de células Hana3A <ol><li>manter as células em 10 mL de meio essencial mínimo (MEM) com 10% soro bovino fetal (FBS), 100 µ g/mL penicilina-estreptomicina e 1,25 µ g/mL anfotericina B em um 100-mm placa de cultura de células em uma incubadora de cultura de célula de 37 ° C com 5% de CO 2. Com cada outra passagem, adicionar 1 puromicina µ g/mL para manter estável transfection de plasmídeos (ver introdução). 
	Nota: Executar todas as etapas que envolvem a cultura de células em uma classe de segurança biológica II para garantir ambiente esterilizado.</li>
	<li>Subcultura na proporção de 10-20% em 100mm pratos cada 2-3 dias.</li>
</ol> 2. Chapeamento de células para transfeccao <ol><li>observar as Hana3A células sob um microscópio de contraste de fase para garantir a viabilidade celular e estimar a confluência.</li>
	<li>Aspirar todos os meio do prato de cultura celular.</li>
	<li>Lavar as células adicionando 10 mL de tampão fosfato salino (PBS) na chapa, rodando o prato, e aspirando a PBS.</li>
	<li>Adicionar 3 mL de 0.05% tripsina-ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) na chapa. Mistura por 1 min ou até que todas as células estão à tona. 
	Nota: Observar o progresso de células desanexação da parte inferior da placa sob o microscópio como necessário.</li>
	<li>Inativar tripsina pela adição de 5 mL de MEM com 10% FBS e pipeta de cima e para baixo para quebrar pedaços de célula Mass. 
	Nota: Para o chapeamento antes de transfeccao, o meio utilizado não deve conter antibióticos. Adição de antibióticos pode diminuir a eficiência do transfection.</li>
	<li>Transferir uma quantidade adequada de células para um tubo de 15-mLl dependendo do número de placas a transfected. Para cada placa de 96 poços, placa de 2 x 10 6 células ou aproximadamente 1/5 de um prato de 100mm confluente de 100%, dando uma contagem de células de 2 x 10 4 células por poço ou uma densidade de aproximadamente 15-30% confluência por bem. Centrifugar tubos a 200 x g por 5 min e aspirar o sobrenadante sem perturbar o centrifugado. 
	Nota: Calcular a quantidade correta de células a ser chapeado em placas de 96 poços para evitar sobrecrescimento ou células antes da estimulação de undergrowing.</li>
	<li>Adicionar uma quantidade adequada de MEM com 10% FBS na 15 mL do tubo e pipetar para cima e para baixo para quebrar pedaços da célula em massa. Para cada placa de 96 poços, Ressuspender as células com 6 mL de MEM com 10% FBS. 
	Nota: Tenha cuidado para não gerar bolhas de ar no tubo.</li>
	<li>Adicionar as células suspensas em um reservatório. Usando uma pipeta multicanal, pipete 50 µ l de células em cada poço de uma placa de 96 poços. Incubar durante uma noite a 37 ° C com 5% de CO 2.</li>
</ol> 3. Transfection de plasmídeos <ol><li>antes de transfeccao, observar as células chapeadas para assegurar uma adequada confluência de aproximadamente 30-50% por alvéolo sob um microscópio de contraste de fase e voltar para a incubadora.</li>
	<li>Preparar antecipadamente o Rho-tag OR construção 11 , 21 , 22 , 28, o fator acessório constrói (RTP1S 22 , 36 e M3R 23), e a variante de biosensor construir 29 , 30 de miniprep. Quantificar a concentração de DNA por um espectrofotômetro e ajustar as concentrações de DNA do plasmídeo (por exemplo, a 100 ng / µ l) com água destilada, conforme necessário.</li>
	Preparação de misturas a transfeccao de <ol><li>de <li>prepara uma mistura de transfeccao Plasmideo em 500 µ l de MEM para cada placa de 96 poços, de acordo com a tabela 1. 
		Nota: Quando diferentes RUP é testados sobre a mesma placa de 96 poços, o volume da mistura de transfeccao e a quantidade de Plasmideo DNA adicionado deve ser adaptado em função do número de poços transfectados com um determinado OR.</li>
		<li>Prepare uma mistura de transfeccao num tubo com 18 µ l de reagente de transfeccao mediada por lipídios em 500 µ l de Madame</li>
	</ol></li> <li>Misturar a mistura com a mistura de transfeccao Plasmideo pipetando para cima e para baixo. Incubar a temperatura ambiente por 15 min.</li>
	<li>Pare a reação adicionando 5 mL de MEM com 10% FBS.</li>
	<li>Espalhar uma camada espessa de toalhas de papel estéril do capuz de cultura de células. Pegue uma placa de 96 poços com células da incubadora. Suavemente e repetidamente toque placa de cabeça para baixo sobre a pilha de papel toalha para que o meio é completamente absorvido pela toalha de papel. 
	Nota: Não à força ou abruptamente tocar a placa como um poderia perder células.</li>
	<li>Transferir 50 µ l da mistura de transfeccao combinada a cada poço da placa de 96 poços e incubar durante uma noite por 18-24h a 37 ° C com 5% de CO 2. 
	Nota: Uma agenda de transfecção e estimulação tempo gerenciado deve preceder a medição quando mais de uma placa de 96 poços são testados em um experimento para ter todas as placas medidas após o mesmo tempo de transfecção e tempo de exposição de estímulo.</li>
</ol> 4. Estimulação e a medição ou a atividade usando o ensaio de campo em tempo real <ol><li>observar as células transfectadas sob um microscópio de contraste de fase para garantir uma adequada confluência de 50-80% por poço e voltar para a incubadora.</li>
	<li>Prepare o suporte de estimulação adicionando o ácido de piperazineethanesulfonic de hidroxietil (HEPES) 10 mM e 5 mM de glicose para Hank &#39; s solução sal equilibrado (HBSS).</li>
	<li>Descongelar as alíquotas de reagente de substrato de ensaio de campo em tempo real no gelo. Armazenar reagente substrato a-80 ° C a 55 µ l pelo tubo em cadeia da polimerase. Use 1 tubo por placa.</li>
	<li>Preparar 2% solução de equilibração misturando 55 µ l de reagente substrato e solução de glicose/HBSS/HEPES 2750 µ l.</li>
	<li>Espalhar uma camada espessa de toalhas de papel no banco. Suavemente e repetidamente toque placa de cabeça para baixo sobre a toalha de papel para que a transfeccao é completamente absorvido pela toalha de papel.</li>
	<li>Lavar as células por pipetagem 50 µ l de solução HBSS/HEPES/glicose em cada Pocito.</li>
	<li>Suavemente e repetidamente toque a solução HBSS/HEPES/glicose da placa de 96 poços.</li>
	<li>Pipetar 25 µ l de solução de equilíbrio de 2% a cada bem e incubar a temperatura ambiente no escuro por 2 h.</li>
	<li>Preparar antecipadamente 1m odorant Soluções conservadas em estoque em DMSO e loja a-20 ° C até usado.</li>
	<li>Antes do final do tempo de incubação, diluir as soluções estoque de odorante de concentrações de trabalho no meio de estimulação HBSS/HEPES/glicose. 
	Nota: As concentrações de odorante diluições preparadas nesta etapa devem ser duplicadas para render as concentrações finais corretas em cada poço.</li>
	<li>Usando uma quimioluminescência placa leitor e antes da adição de odorante, medir o nível basal de luminescência da placa por 2 vezes consecutivas a uma taxa de 1000 ms por bem 34.</li>
	<li>Rapidamente, retire a placa do leitor de placa e adicionar as diluições de odorante 25 µ l de cada poço e começar imediatamente a medição contínua da luminescência de todos os poços para 20 ciclos dentro de 30 min. 
	Nota: Pipeta com cuidado para não poluir os vizinhos poços quando usando diferentes odores e/ou concentrações diferentes de odorantes a mesma no mesmo prato.</li>
</ol> 5. Análise de dados <ol><li>exportar os dados a partir do software de leitor de placa de quimioluminescência.</li>
	<li>Calcular normalizado resposta OR para cada ponto de tempo, usando a fórmula de 
	(luminescência N &#8211; luminescência basal) / (luminescência maior &#8211; luminescência basal) onde N = valor de luminescência de um certo bem; basal = valor médio da luminescência dos dois basais valores de luminescência; maior = maior valor de luminescência de uma placa ou um conjunto de placas de. 
	Nota: Dependendo da finalidade do experimento, representações gráficas alternativas podem ser adoptadas. Por exemplo, para a seleção de ensaios (ver Figura 1) e para a geração de curvas concentração-resposta, o valor de luminescência de um determinado bem em um ponto de tempo desejado durante a medição cinético, tais como o valor máximo ou o valor final, podem ser usados.</li>
</ol>

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<li>Block, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implausibility+of+the+vibrational+theory+of+olfaction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Implausibility of the vibrational theory of olfaction.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (21), E2766-E2774 (2015).</li>
<li>Sato-Akuhara, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand+Specificity+and+Evolution+of+Mammalian+Musk+Odor+Receptors%3A+Effect+of+Single+Receptor+Deletion+on+Odor+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ligand Specificity and Evolution of Mammalian Musk Odor Receptors: Effect of Single Receptor Deletion on Odor Detection.</a> J Neurosci. 36 (16), 4482-4491 (2016).</li>
<li>Gane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+vibration-sensing+component+in+human+olfaction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Molecular vibration-sensing component in human olfaction.</a> PLoS One. 8 (1), e55780(2013).</li>
<li>Young, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+evolutionary+processes+shaped+the+mouse+and+human+olfactory+receptor+gene+families%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Different evolutionary processes shaped the mouse and human olfactory receptor gene families.</a> Hum Mol Genet. 11 (5), 535-546 (2002).</li>
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Os autores não têm nada para divulgar.

Medir com precisão a ativação de um Bo após exposição a um determinado odorant é o primeiro passo para decifrar a codificação da informação olfactiva. Os experimentos mostrado neste estudo representam que um exemplo de como um pode identificar, usando um em vitro sistema de expressão OR, RUP ágil entre o repertório OR humano para o produto químico odoríferos de interesse e posteriormente, caracterizando o receptor Farmacologia, utilizando diferentes concentrações do produto químico. Nossos resultados confirmam O...

O sentido do olfato desempenha um papel importante na sobrevivência dos animais, como eles dependem de suas habilidades olfativas para obter alimentos, evitar predadores e perigo, distinguir a espécie e selecione companheiro1,2. A realização dessas funções depende os receptors odorant (SRO), que individualmente são expressos na superfície ciliar dos neurônios sensoriais olfativos (OSNs) localizada no epitélio olfativo (OE). RUP constituem a maior família da superfamília de receptores (GPCR) G-proteína juntamente com aproximadamente 400 e 1200 diversas OR genes em humanos e rato, respectivamente3,4,5. SRO ativado por odorantes leva ao aumento dos níveis intracelular de cAMP através da ativação sequencial de olfativa G-proteína (Golf) e digite adenilato ciclase III (ACIII). O resultante aumento do nível de cAMP intracelular pode funcionar como um segundo mensageiro, que abre o canal do nucleotide-gated na superfície das células, provocando o influxo de cátions incluindo Ca2 + e potenciais de ação e, finalmente, iniciar neuro-potencial transmissão e percepção olfativa. O processo de detectar e discriminar um grande número de odores pelo RUP é considerado como o primeiro passo de percepção olfativa6,7.
Desde que Buck e Axel8 primeiro com êxito clonado odorant receptores e elucidado o mecanismo da percepção olfativa, iniciada pelo RUP, deorphanization da família OR tornou-se um dos hotspots neste campo. Vários métodos in vivo, ex vivo e in vitro , para medir a ativação OR foram relatados9,10,11,12. Um método tradicional usado Ca2 + imagem seguida de célula única RT-PCR na OSNs permitiu a identificação de diferentes RUP para alifáticos odorantes13,14,15. Mais recentemente, o advento das análises em larga escala transcriptome promoveu o desenvolvimento de métodos de alta produtividade na vivo mais. O ensaio de Kentucky identificou ORs eugenol e muscona-responsivo do mouse com o uso do S100a5-tauGFP repórter rato estirpe e microarray análise9. Baseia a diminuição nos níveis de RNAm OR após exposição odorante, a tecnologia de sonho empregou uma abordagem transcriptomic para determinar perfis de ativação OR em ambas as espécies de vertebrados e non-vertebrado16. Da mesma forma, dada a fosforilação de S6 em ativações neuronais, o Matsunami grupo sequenciados mRNAs de moleculas de Ribossoma fosforilada para identificar responsivo ORs12. Finalmente, o grupo de Feinstein relatou ratos super cheirador que poderiam servir como uma plataforma para estudar o odor de codificação na vivo, conhecido como o de tecnologia de MouSensor17.
No Reino em vitro , o desafio de cultivo OSNs faz um sistema de expressão heteróloga que imita OR expressão funcional na vivo uma solução ideal para realizar a triagem em larga escala de produtos químicos odoríferos para RUP. No entanto, desde linhas de células cultivadas de origens não-olfactory diferem OSNs nativas ou proteínas são retidas no retículo endoplasmático e incapaz de tráfego para a membrana plasmática, resultando em OR degradação e perda da função de receptor18 , 19. para resolver este problema, foram feitas obras extensas para replicar a expressão funcional de OR na membrana celular em linhagens celulares heteróloga. Krautwurst et al primeiro anexados os 20 primeiros aminoácidos da rodopsina (Rho-marca) do N-terminal da proteína OR e isto promoveu a expressão da pilha-superfície de alguns ORs em células de rim humano embrionário (HEK)20. Realizando uma análise serial de análise de biblioteca de expressão (SAGE) gene do único OSNs, Saito et al. primeiro clonado do receptor-transportando proteínas (RTP) os membros da família, RTP1 e RTP2 e a proteína de potenciador de expressão do receptor 1 (REEP1) que facilitou OR tráfico para a membrana celular e aprimorado mediada por odorant respostas das RUP em células HEK293T 21. com base nesses resultados, o grupo Matsunami estabelecida com êxito a linha de celular Hana3A, estàvel transfected com RTP1, RTP2, REEP1 e Gαolf em HEK293T e transitoriamente transfected com RUP Rho-tag, para eficiente ou funcional expressão. Posteriores estudos revelaram 1) um formulário mais curto da RTP1, RTP1S, que poderia promover mais robustamente ou função do que o original proteína RTP1 e 2) o receptor de acetilcolina muscarínicos tipo 3 (M3R) que pode aumentar a atividade de OR através da inibição da β-arrestin-2 recrutamento, ambos os quais foram introduzidos no sistema de expressão heteróloga para otimizar experimental de saída22,23.
Vários métodos de deteção têm sido utilizados para quantificar a ativação do receptor em sistemas heterólogos. O ensaio da fosfatase alcalina placentária secretado (SEAP) trabalha com uma enzima reveladora transcriptionally regulamentada por elementos de resposta acampamento (CREs), tornando-se uma opção atraente para avaliar a ativação OR. A fluorescência é facilmente detectada em uma amostra de meio de cultura após a incubação com SEAP deteção reagente24. Usando este método, as funções das regiões ultraperiféricas, bem como uma classe secundária dos receptores chemosensory, expressado no OE, o rastreamento associado da amina receptores (TAARs) tem sido caracterizam25,26,27. Um outro método comum, o ensaio de luciferase, usa um gene de repórter de luciferase de vaga-lume sob o controle do elemento de resposta acampamento (CRE). Medição da luminescência gerada pela produção de luciferase oferece um meio eficiente e robusto de quantificar OR ativação10,11,28.
Ensaios de campo em tempo real também têm sido amplamente utilizados na monitoração dinamicamente a função de GPCRs heterólogos ou endógenas. Um exemplo desses ensaios avançados aproveita-se de uma variante geneticamente codificado biosensor, que possui um domínio de ligação de acampamento fundido a uma forma mutante de luciferase. Quando vincula de acampamento, a mudança conformacional leva à ativação de luciferase, luminescência, que então pode ser medida com um leitor de quimioluminescência29,30. A tecnologia de campo em tempo real tem sido relatada apropriado para o de orfandade de odorante humana receptores nas células de 108CC15 HEK293 e NxGbunda = "xref" > 31,32,33, como bem como o Hana3A HEK293T-derivado de células34,35. O grupo de Krautwurst também descrito em detalhes a tecnologia de campo em tempo real para ser apropriado para abordagens em grande escala ou triagem de bi-direcional de32,33.
Aqui descrevemos um protocolo para medir a ativação OR usando um ensaio de campo em tempo real em células Hana3A. Neste protocolo, a luminescência de células vivas pre-equilibradas cineticamente é medida por 30 min após o tratamento com compostos voláteis específicos, o que representa uma análise mais eficiente e precisa de ativação OR que são menos suscetíveis a artefatos que ocorrem no ambiente celular com tempo prolongado e toxicidades celular induzida pelo odor. Esta medição em tempo real permite uma triagem em larga escala do RUP e ligantes, bem como a caracterização de pares específicos de OR-ligante de interesse. Usando esse método, com sucesso identificamos OR5AN1 como receptor para a muscona composto de almíscar executando um rastreio contra 379 ORs humanos e posteriormente confirmando o resultado da seleção positiva.

<table><tbody><tr><td>Anfotericina B</td><td>Sigma</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10099-141</td><td></td></tr><tr><td>GloSensor reagente cAMP Promega</td><td></td><td>E1290</td><td></td></tr><tr><td>pGloSensor-20F plasmídeo cAMP</td><td>Promega</td><td>E1171</td><td></td></tr><tr><td>Células</td><td></td><td></td> Hana3A <td>disponíveis nos autores mediante solicitação</td></tr><tr><td>HBSS, sem cálcio ou magnésio</td><td>GIBCO</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Hyclone</td><td>SH30237</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Plasmídeo</td><td></td><td></td> M3R <td>clonado em um vetor de expressão de mamíferos, como pCI</td></tr><tr><td>MEM, com EBSS e L-glutamina</td><td>Hyclone</td><td>SH30024</td><td></td></tr><tr><td>Muscone</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-200528</td><td></td></tr><tr><td>Musk tibetene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S359165</td><td></td></tr><tr><td>OU plasmídeos clonados</td><td>com uma etiqueta Rho em um vetor de expressão de mamíferos</td><td></td><td></td> como pCI</tr><tr><td>PBS, sem cálcio ou magnésio</td><td>Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid miniprep kit</td><td>Tiangen</td><td>DP103-03</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>Sigma</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>Plasmídeo</td><td></td><td></td> RTP1S <td>clonado em um vetor de expressão de mamíferos, como pCI</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Hyclone</td><td>SH30236</td><td></td></tr><tr><td>tubo de PCR de 0,2 mL</td><td>Axygen</td><td>PCR-02-C</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Tubo Eppendorf Eppendorf</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL 17 mm x 120 mm tubo cônico</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>pipetman multicanal de 8 poços e/ou 12 poços</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de células brancas de fundo plano de 96 poços</td><td>Greiner</td><td>655098</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultura de células de 100 mm x 20 mm</td><td>BD Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Classe II com fluxo</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>laminarIncubadora de cultura de células, com 5% de CO2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga, com rotor de balde oscilante para tubos</td><td></td><td></td><td></td>cônicos de 15 ml</tr><tr><td>Leitor de placas Infinite F200</td><td>Microscópio</td> de contraste de fase Tecan <td></td><td></td></tr><tr><td>com objetivas</td><td></td><td></td><td></td>x10 e x20</tr><tr><td>Espectrofotômetro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reservatórios de reagentes estéreis para distribuição</td><td></td><td></td><td></td>multicanal</tr><tr><td>Papel toalha</td><td></td><td></td><td></td> estéril</tr></tbody></table>

viver-pilha medição de odorante receptor de ativação usando um ensaio de campo em tempo real

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

Os tamanhos enormes das famílias do receptor (OR) odorant mamíferos apresentam dificuldades para encontrar seus cognatos ligantes entre numerosos produtos químicos voláteis. Para eficiência e precisão deorphanize ORs, podemos combinar o uso de uma linha de celular heteróloga para expressar ORs mamíferos e um plasmídeo geneticamente modificado biosensor para medir a produção de acampamento a jusante de ativação OR em tempo real. Este ensaio pode ser usado para tela odorantes contra ORs e vice-versa. Interações de odorante-receptor positivo das telas podem ser posteriormente confirmadas por teste em relação a várias concentrações de odor, gerando curvas concentração-resposta. Aqui nós usamos este método para executar um rastreio do elevado-throughput de um composto odoríferos contra uma biblioteca de OR humano expressos nas células Hana3A e confirmou que o receptor está respondendo positivamente é o receptor cognato para o composto de interesse. Encontramos este método de deteção de alta produtividade para ser eficiente e confiável na avaliação da ativação OR e nossos dados fornecem um exemplo de seu uso potencial em estudos funcionais de OR.

Muscona é o principal componente aromático de almíscar natural. Recentes estudos de OR5AN1 identificado como um receptor humano para muscona e outros compostos de almíscar macrociclos com base na homologia com o mouse ou, MOR215-1, clonado de glomérulos muscona-responsivos em comportar-se de ratos37,38. Selecionando o repertório OR humano, nosso grupo e o grupo de Touhara também identificado OR5AN1 como um grande receptor para doi...

Caracterizando a função dos receptores de odorante serve uma parte indispensável do processo de deorphanization. Nós descrevemos um método para medir a ativação dos receptores odorant em tempo real, usando um ensaio de campo.

Viver-pilha medição de odorante Receptor de ativação usando um ensaio de campo em tempo real

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

O objetivo geral deste ensaio de AMP cíclico em tempo real e alto rendimento é triar odorantes contra receptores de odorantes e vice-versa. Como os camundongos são úteis para investigar o funcionamento dos receptores de odorantes, isso permite triagens em maior escala tanto de receptores de odorantes quanto de seus ligantes, além de caracterizações farmacológicas de pares receptor-ligante de interesse. A principal vantagem desta técnica é que podemos avaliar a ativação de odorante para receptor de forma eficiente e confiável.Sistema heterólogo de expressão de odorante para receptor utilizando células vivas. Comece observando as células Hana3A em um microscópio de contraste de fase para garantir a viabilidade celular e estimar a confluência. Em seguida, aspire todo o meio do recipiente de cultura celular.E lave as células adicionando 10 mililitros de solução salina tamponada com fosfato na placa, agitando o recipiente e aspirando o PBS. Em seguida, adicione três mililitros de tripsina-EDTA a 0,5% na placa. Deixe a tripsina atuar sobre as células por um minuto ou até que todas as células estejam em suspensão.Inative a tripsina adicionando 5 mililitros de MEM com 10% de FBS e pipetando para cima e para baixo para dissociar agregados de massa celular. Após realizar a contagem celular, transfira 2x10⁶ células por placa de 96 poços, a serem transfectadas, para um tubo de 15 mililitros. É importante que você calcule o número correto de células a serem preparadas na placa de 96 poços para evitar crescimento excessivo ou insuficiente das células antes da estimulação.Centrifugue os tubos a 200 vezes G durante cinco minutos. Em seguida, aspire o sobrenadante sem perturbar o pellet celular. Adicione seis mililitros de meio sem antibióticos para cada placa de 96 poços e pipeteie para cima e para baixo sem criar bolhas de ar, a fim de desagregar os agregados da massa celular.Transfira as células suspensas para um reservatório. Usando uma pipeta multicanal, pipete 50 microlitros de células para cada poço das placas de 96 poços. Incube durante a noite a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.Antes da transfeção, observe as células cultivadas sob microscópio de contraste de fase para garantir uma confluência adequada de aproximadamente 30 a 50% por poço e, em seguida, retorne-as ao incubador. Siga a linha identificada com o construto do receptor para odorante, os construtos dos fatores acessórios e o construto da variante do biossensor de AMP cíclico. Em seguida, prepare uma mistura de transfeção plasmidial em 500 microlitros de MEM para cada placa de 96 poços.Em seguida, prepare uma mistura de transfeção contendo 18 microlitros de reagente de transfeção mediado por lipídeo em 500 microlitros de MEM. Misture a mistura de transfeção com a mistura plasmidial por pipetagem para cima e para baixo. Incube então à temperatura ambiente por 15 minutos.Após a incubação, interrompa a reação adicionando 5 mililitros de MEM com 10% de FBS à mistura de transfeção. Em seguida, espalhe uma camada espessa de toalhas de papel estéreis na capela de cultura celular. Retire uma placa de 96 poços com células do incubador.Bata suave e repetidamente na placa virada para baixo sobre a pilha de toalhas de papel para que o meio seja completamente absorvido pelas toalhas. Transfira 50 microlitros da mistura de transfeção combinada para cada poço da placa de 96 poços e incube durante a noite por 18 a 24 horas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. É possível gerenciar a transfeção e o cronograma de estimulação de modo que permaneçam no instrumento quando mais de uma placa de 96 poços for testada em um mesmo experimento, garantindo que todas as placas sigam o mesmo intervalo de transfeção e exposição aos destilados.Antes da estimulação, observe as células transfectadas ao microscópio de contraste de fase para garantir uma confluência adequada de 50 a 80% por poço antes de retorná-las ao incubador. Em seguida, prepare o meio de estimulação adicionando 10 milimolares de heaps e 5 milimolares de glicose à solução salina balanceada de Hanks. Deixe descongelar em gelo 55 microlitros de alíquotas do reagente substrato para ensaio de AMP cíclico em tempo real.Prepare uma solução de abração igual a 2% misturando 55 microlitros do reagente substrato e 2.750 microlitros do meio de estimulação. Após espalhar uma camada grossa de toalhas de papel sobre a bancada, tampe suavemente e repetidamente a placa de cabeça para baixo sobre as toalhas de papel, de modo que o meio de transfeção seja absorvido pelas toalhas. Lave as células pipetando 50 microlitros do meio de estimulação para cada poço.Toque suave e repetidamente para remover o meio de estimulação da placa de 96 poços. Pipete 25 microlitros da solução de equilíbrio a 2% para cada poço e incube em temperatura ambiente no escuro por duas horas. Pouco antes do término do tempo de incubação, dilua as soluções estoque de odorizantes descongeladas até a concentração de trabalho e no meio de estimulação.Antes da adição do odorizante, utilize um leitor de placa por quimioluminescência para medir o nível basal de luminescência da placa. Remova rapidamente a placa do leitor e adicione 25 microlitros das diluições do odorizante a cada poço. Em seguida, inicie imediatamente a medição contínua da luminescência de todos os poços por 20 ciclos dentro de 30 minutos.Foram analisados 379 receptores olfativos humanos únicos frente a 30 micromolar de musceno utilizando o ensaio de AMP cíclico em tempo real. Blocos coloridos ao longo do eixo X indicam diferentes famílias de receptores olfativos humanos. O eixo Y representa a luminiscência normalizada 30 minutos após a adição do odorante, quando a resposta atingiu o máximo para o controle positivo.A resposta de OR5AN1 é indicada. Esta figura mostra medições em tempo real da ativação de OR5AN1 por diferentes concentrações de musceno e o resultado de um controle negativo sem odor. A seta indica o ponto temporal da adição do odorante.Aqui, é apresentada uma curva de resposta à concentração de OR5AN1 frente à muscona 30 minutos após a adição do odorante. A técnica descrita aqui leva um total de três dias, começando com uma placa estoque de camadas de cultura no primeiro dia. Uma vez dominada, o processo no último dia pode ser concluído em três horas para cada placa de 96 poços, se for realizado corretamente.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como gerenciar a ativação de receptores de odorantes utilizando um ensaio de AMP cíclico para aproveitar os resultados.

live-cell-measurement-odorant-receptor-activation-using-real-time

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Aqui demonstramos um protocolo para realizar a coloração de células vivas que podem ser usados ​​para detectar receptores olfativos na superfície de células HEK293T convenientemente. Além disso, ele também pode ser usado para ensaio para a expressão de outros receptores de superfície chemosensory ou GPCRs.

Assaying Expressão de Receptores de superfície chemosensory em células heterólogas

Este vídeo demonstra o protocolo para medir a ativação do receptor de odor em células transfectadas usando um biossensor de monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) e detecção de luminescência. O método é aplicado para estudar interações receptor-ligante e vias de sinalização em neurônios olfatórios.

Medindo a ativação do receptor de odor usando um ensaio de monofosfato de adenosina cíclico em tempo real

Fonte: de March, C. A. et. al., Monitoramento in vitro em tempo real da ativação do receptor de odor por um odorante na fase de vapor. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra o método para monitorar a ativação em tempo real de receptores de odor em células recombinantes de mamíferos usando medição de luminescência. A ligação ao odorante desencadeia a ativação da proteína G e a produção de cAMP, ativando proteínas glosensor que emitem luminescência após a ligação ao substrato, fornecendo uma...

Monitoramento em tempo real da ativação do receptor de odor em células recombinantes

Ativação persistente de inibição G receptores acoplados à proteína resulta em sensibilização da adenilil ciclase sinalização. Para identificar as vias moleculares essenciais, abordagens nonbiased são necessárias, no entanto, esta estratégia requer o desenvolvimento de um ensaio escalável sensibilização AMPc baseado em células. Relata-se um ensaio de sensibilização para a pequena molécula e triagem siRNA.

Induzida por drogas Sensibilização de adenililciclase: Racionalização Ensaio e miniaturização para pequenas moléculas e siRNA Triagem Applications

Padrões de ativação de receptores olfativos codificar identidade odor, mas a falta de dados publicados que identificam ligantes olfativos para receptores olfativos mamíferos impede o desenvolvimento de um modelo abrangente de codificação odor. Este protocolo descreve um método para facilitar a identificação de alto rendimento de ligandos de receptores olfactivos e quantificação da activação do receptor.

De alta capacidade de análise de mamíferos olfativas Receptores: Medição do Receptor de ativação via luciferase Atividade

A análise das propriedades fisiológicas dos neurônios sensoriais olfativos ainda enfrenta limitações técnicas. Aqui, nós os registramos por meio de patch-clamp perfurado em uma preparação intacta do epitélio olfatório em camundongos direcionados ao gene. Esta técnica permite a caracterização das propriedades da membrana e respostas a ligantes específicos de neurônios que expressam receptores olfativos definidos.

Perfurado gravação patch-clamp de rato Olfactory neurônios sensoriais na Intact neuroepitélio: Análise Funcional do Neurônios Expressando uma Odorant Receptor Identificados

Este protocolo analisa comportamento de navegação de larvas de Drosophila em resposta à estimulação optogenetic simultânea de seus neurônios olfativos. Luz de comprimento de onda de 630 nm é usada para ativar individuais neurônios olfativos expressando uma rodopsina canal avermelhado. Larval movimento simultaneamente é controlado digitalmente gravado e analisados utilizando o software personalizados.

Rastreamento do comportamento larval de Drosophila em resposta à estimulação optogenética de neurônios olfativos

Fisiologicamente, odorante receptores são ativados por moléculas odorant inaladas na fase de vapor. No entanto, mais sistemas in vitro utilizam o stimulation de odorante de fase líquida. Aqui, apresentamos um método que permite o monitoramento em tempo real e in vitro da ativação de receptores odorant após estimulação odorant em fase vapor.

Em tempo real em Vitro monitoramento da ativação do Odorant Receptor por um odorante na fase de Vapor

O protocolo apresentado neste estudo ilustra a eficácia do Detector de Diferença de AMPc In Situ  na medição do AMPc através de dois métodos. Um método utiliza um espectrofotômetro de leitura de placas de 96 poços com células HEK-293. O outro método demonstra células HASM individuais sob um microscópio fluorescente.

Dinâmica de cAMP em tempo real em células vivas usando o detector de diferença de cAMP fluorescente in situ

Neurônios receptores olfativos (ORNs) converter sinais de odor primeiro em um receptor de corrente que por sua vez desencadeia potenciais de ação que são transmitidos para os neurônios de segunda ordem no bulbo olfativo. Aqui, descrevemos a técnica da pipeta de sucção para gravar simultaneamente o receptor de odorante induzida atual e os potenciais de ação de ORNs mouse.

Odorante induzidas respostas registradas a partir de neurônios receptores olfativos utilizando a técnica de sucção da pipeta

Aprenda a medir a ativação de receptores de odorantes em tempo real usando ensaio de AMP cíclico em células Hana3A. Este método permite triagem eficiente de odorantes para estudos farmacológicos em neurociência.

Viver-pilha medição de odorante Receptor de ativação usando um ensaio de campo em tempo real

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