Um ensaio de inibição (HI) de hemaglutinação otimizado para quantificar os anticorpos específicos de gripe

O objetivo geral deste ensaio de inibição da hemaglutinação é medir os títulos de anticorpos contra vírus específicos de interesse. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da vacinologia sobre a imunidade e proteção mediadas por vacinas em diferentes populações e em várias idades e grupos de pacientes. As principais vantagens dessa técnica são que ela é precisa e permite a determinação rápida do título da presença de anticorpos neutralizantes.

Embora esse método possa fornecer informações sobre os títulos de anticorpos humanos, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como títulos de anticorpos para soro de camundongo, também sobrenadantes de cultura. Comece rotulando placas de microtitulação de 96 poços com as informações experimentais apropriadas. Em seguida, gire a placa na orientação vertical e use uma pipeta multicanal para adicionar 25 microlitros de PBS a cada poço, exceto o primeiro poço da linha de titulação inferior traseira.

Adicionar 50 microlitros da solução de antígeno recém-preparada de interesse ao primeiro poço da linha de titulação reversa, seguido pela adição de 25 microlitros de amostras de soro tratadas com RDE aos primeiros poços das dez fileiras superiores. Adicionar 25 microlitros do anti-soro adequado ao primeiro alvéolo da 11.ª linha como controlo positivo. A transferência de 25 microlitros do primeiro poço de cada linha para seus poços sucessivos para realizar diluições seriais duplas.

Pipetar 10 a 15 vezes para cada etapa de diluição, descartando os 25 microlitros finais dos últimos alvéolos. Em seguida, adicione 25 microlitros da solução de antígeno a cada poço das fileiras de um a 11 e 25 microlitros de PBS apenas a cada poço da linha de titulação reversa. Bata no prato com cuidado 10 vezes nos quatro lados para misturar.

Em seguida, cubra o prato por 30 minutos em temperatura ambiente. No final da incubação, adicione 50 microlitros de solução de glóbulos vermelhos a cada poço e misture a placa com mais batidas. Em seguida, cubra a placa novamente e incube os glóbulos vermelhos de acordo com as espécies utilizadas, conforme descrito na tabela.

Depois de adicionar os glóbulos vermelhos à placa, respeite o tempo de incubação apropriado para o tipo de sangue usado no ensaio. Uma incubação muito curta ou muito longa levará a uma interpretação incorreta dos resultados. No final da incubação, avalie a hemaglutinação inclinando a placa 90 graus por 25 segundos e marque os resultados para cada poço, enquanto a placa ainda está inclinada, em um esquema impresso da placa de 96 poços.

Neste experimento, a resposta de anticorpos induzida pela vacina foi avaliada em 26 voluntários saudáveis que receberam uma vacina trivalente inativada contra influenza contendo influenza A/H1N1/California/2009, A/H3N2/Texas/2012 e B/Massachusetts/O2/2012 antes da temporada de influenza de 24 de 2015. Foi observada uma resposta imune de reação cruzada para as cepas dos vírus A/H3N2/Suíça/2013 e A/H3N2/Texas/2012, com títulos médios geométricos significativamente mais baixos de inibição da hemaglutinação e soroproteção induzida contra influenza A/H3N2/Suíça/2013 em comparação com influenza A/H3N2/Texas/2012. Após a vacinação, os títulos de anticorpos contra ambas as cepas aumentaram, embora a cepa A/H3N2/Suíça/2013 não estivesse presente na vacina.

A hemaglutinina viral demonstra um potencial dependente da espécie para hemaglutinação eritrocitária. De interesse, o sangue de cobaia não hemaglutina adequadamente com influenza B e o sangue de peru tem potencial para hemaglutinação com altos títulos e baixa reatividade cruzada. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em três horas se for executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de soro com RDE para inativar quaisquer inibidores inespecíficos e ligação inespecífica durante a hemaglutinação do vírus. Após este procedimento, outros métodos como ELISA podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre o papel de imunoglobulinas específicas de patógenos individuais. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da imunologia viral aprofundarem nossa compreensão da imunidade relacionada à vacina em pacientes saudáveis e imunossuprimidos em diferentes faixas etárias.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar um ensaio de inibição da hemaglutinação para quantificar os títulos de anticorpos específicos da cepa de influenza em larga escala. Não se esqueça de que trabalhar com antígenos virais, sangue animal e amostras de soro humano pode ser extremamente perigoso e que precauções como trabalhar em um laboratório BSL2 devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.