Um ensaio de inibição (HI) de hemaglutinação otimizado para quantificar os anticorpos específicos de gripe
1 de dezembro de 2017
Os protocolos apresentados descrevem como realizar um ensaio de inibição de hemaglutinação para quantificar os anticorpos específicos de gripe de amostras de soro de destinatários de vacina contra gripe. O primeiro ensaio determina as concentrações de antígeno viral ideal por hemaglutinação. O segundo ensaio quantifica anticorpos específicos da gripe através da inibição da hemaglutinação.
O objetivo geral deste ensaio de inibição da hemaglutinação é medir os títulos de anticorpos contra vírus específicos de interesse. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de vacinologia sobre a imunidade e proteção mediadas por vacinas em diferentes populações e entre diversos grupos etários e grupos de pacientes. As principais vantagens desta técnica são sua precisão e a possibilidade de determinação rápida do título de anticorpos neutralizantes.
Embora este método possa fornecer informações sobre os títulos de anticorpos humanos, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como títulos de anticorpos para soro de camundongo ou também sobrenadantes de cultura. Comece rotulando placas de microtitulação de 96 poços com as informações experimentais apropriadas. Em seguida, posicione a placa na orientação vertical e use uma pipeta multicanal para adicionar 25 microlitros de PBS a cada poço, exceto ao primeiro poço da última linha de titulação.
Adicione 50 microlitros da solução de antígeno recém-preparada de interesse ao primeiro poço da linha de titulação reversa, seguido pela adição de 25 microlitros das amostras de soro tratadas com RDE aos primeiros poços das dez linhas superiores. Adicione 25 microlitros do antissoros apropriado ao primeiro poço da 11ª linha como controle positivo. Em seguida, transfira 25 microlitros do primeiro poço de cada linha para os poços subsequentes para realizar diluições seriadas, em duplicata.
Pipete para cima e para baixo de 10 a 15 vezes em cada etapa de diluição, descartando os últimos 25 microlitros dos poços finais. Em seguida, adicione 25 microlitros da solução de antígeno a cada poço das linhas um a 11 e apenas 25 microlitros de PBS a cada poço da linha de titulação final. Bata cuidadosamente na placa 10 vezes em cada um dos quatro lados para misturar.
Em seguida, cubra a placa por 30 minutos em temperatura ambiente. Ao final da incubação, adicione 50 microlitros de solução de hemácias a cada poço e misture a placa com mais batidas leves. Em seguida, cubra novamente a placa e incube as hemácias de acordo com a espécie utilizada, conforme descrito na tabela.
Após adicionar as hemácias à placa, respeite o tempo de incubação apropriado para o tipo de sangue utilizado no ensaio. Uma incubação muito curta ou muito longa levará a uma interpretação incorreta dos resultados. Ao final da incubação, avalie a hemaglutinação inclinando a placa em 90 graus por 25 segundos e marque os resultados para cada poço, enquanto a placa ainda estiver inclinada, em um esquema impresso da placa de 96 poços.
Neste experimento, a resposta de anticorpos induzida pela vacina foi avaliada em 26 voluntários saudáveis que receberam uma vacina inativada trivalente contra a gripe, contendo influenza A/H1N1/California/2009, A/H3N2/Texas/2012 e B/Massachusetts/O2/2012, antes da temporada de gripe de 2015. Observou-se uma resposta imune cruzada contra as cepas virais A/H3N2/Switzerland/2013 e A/H3N2/Texas/2012, com títulos médios geométricos de inibição da hemaglutinação significativamente menores e proteção sorológica induzida menor contra a gripe A/H3N2/Switzerland/2013 em comparação com a gripe A/H3N2/Texas/2012. Após a vacinação, os títulos de anticorpos contra ambas as cepas aumentaram, mesmo que a cepa A/H3N2/Switzerland/2013 não estivesse presente na vacina.
A hemaglutinina viral demonstra um potencial dependente da espécie para hemaglutinação de eritrócitos. De interesse, o sangue de porquinho-da-índia não realiza adequadamente hemaglutinação com o vírus da influenza B, enquanto o sangue de peru possui potencial para hemaglutinação com altas titulações e baixa reatividade cruzada. Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em três horas, se realizada corretamente.
Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de tratar o soro com EDR para inativar quaisquer inibidores inespecíficos e ligações inespecíficas durante a hemaglutinação do vírus. Após este procedimento, outras técnicas, como ELISA, podem ser realizadas para responder perguntas adicionais sobre o papel das imunoglobulinas específicas para o patógeno. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de imunologia viral avançarem na compreensão da imunidade relacionada a vacinas em pacientes saudáveis e imunossuprimidos em diferentes grupos etários.
Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar um ensaio de inibição da hemaglutinação para quantificar os títulos de anticorpos específicos de cepas de influenza em larga escala. Não se esqueça de que o trabalho com antígenos virais, sangue animal e amostras de soro humano pode ser extremamente perigoso e que precauções, como trabalhar em um laboratório BSL2, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.
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Visão Geral
Este artigo apresenta protocolos para realizar um ensaio de inibição da hemaglutinação com o objetivo de quantificar os títulos de anticorpos específicos para influenza em amostras de soro. O método é essencial para compreender a imunidade mediada por vacinas em diferentes populações.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Vacinologia
- Imunologia
- Sorologia
Antecedentes
- O ensaio de inibição da hemaglutinação mede as respostas de anticorpos contra a influenza.
- Ele fornece informações sobre a eficácia da vacina e a imunidade da população.
- Este método pode ser aplicado a diversos tipos de amostras, incluindo soro humano e murino.
- A compreensão dos títulos de anticorpos é essencial para avaliar o desempenho da vacina.
Objetivo do Estudo
- Quantificar os títulos de anticorpos específicos para influenza em indivíduos vacinados.
- Avaliar a resposta imune em diferentes grupos demográficos.
- Fornecer um método rápido e preciso para a determinação de títulos.
Métodos Utilizados
- Rotulagem de placas microtituladoras de 96 poços com informações experimentais.
- Uso de uma pipeta multicanal para adicionar PBS aos poços.
- Realização de hemaglutinação para determinar as concentrações ótimas de antígeno viral.
- Realização de inibição da hemaglutinação para quantificar os títulos de anticorpos.
Resultados Principais
- O ensaio quantifica com precisão os títulos de anticorpos contra a influenza.
- Ele demonstra a presença de anticorpos neutralizantes em amostras de soro.
- Os resultados podem orientar o desenvolvimento de vacinas e estratégias de saúde pública.
- O método é adaptável a diversos tipos de amostras e populações.
Conclusões
- O ensaio de inibição da hemaglutinação é uma ferramenta confiável para medir respostas imunes.
- Essa técnica aprimora a compreensão da imunidade induzida por vacinas.
- Aplicações futuras podem estender-se a outras infecções virais e populações.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A quantificação precisa dos títulos de anticorpos específicos para influenza é essencial para avaliar a imunidade induzida pela vacina e orientar as avaliações de imunogenicidade no desenvolvimento pré-clínico e clínico. O ensaio de inibição da hemaglutinação (IH) fornece um método padronizado e rápido para medir as respostas de anticorpos neutralizantes em diversas populações, apoiando decisões baseadas em dados sobre avanço ou interrupção no desenvolvimento de vacinas. Ao permitir a análise da reatividade cruzada entre cepas e a otimização de eritrócitos específica por espécie, este ensaio aumenta a confiança preditiva em estudos de imunologia translacional.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Analisa as respostas imunes mediadas por vacinas mediante a quantificação de títulos de anticorpos específicos para cepas, apoiando a desmistificação mecanicista de alvos antigênicos.
- Valor Operacional: Permite a validação funcional da hemaglutinina como um antígeno-chave da influenza por meio da inibição da aglutinação viral.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Padroniza concentrações de antígeno por meio da titulação de hemaglutinação (HA), garantindo entradas reprodutíveis para triagem subsequente de IH.
- Valor Operacional: Permite triagem de soro em alto rendimento utilizando diluições seriadas em dobro em formato de 96 poços, melhorando a escalabilidade do ensaio.
- Valor Científico: Minimiza reatividade cruzada por meio da seleção empírica de hemácias de animais (por exemplo, porquinho-da-índia, perú), aumentando a especificidade do ensaio para o vírus influenza B e cepas heterólogas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Mede a soroconversão induzida pela vacina e as médias geométricas de título (GMTs) em coortes saudáveis, fornecendo biomarcadores translacionais de imunogenicidade.
- Valor Operacional: Permite a comparação multifuncional das respostas imunes entre grupos etários e populações de pacientes utilizando pontos de corte padronizados de título.
- Valor Científico: Detecta respostas imunes cruzadas contra cepas não vacinais (por exemplo, A/H3N2/Suíça/2013), contribuindo para o desenvolvimento de vacinas de amplo espectro.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O ensaio de IH insere-se no fluxo de trabalho de imunogenicidade, desde a descoberta inicial até a validação pré-clínica, fornecendo dados quantitativos de anticorpos que orientam a seleção de antígenos, a otimização de adjuvantes e estudos de determinação de dose.
- Biologia Experimental: Apoia a verificação de hipóteses sobre a eficácia de vacinas mediante a medição da inibição funcional de hemaglutinação por anticorpos.
- Triagem: Fornece resultados quantitativos reprodutíveis de título a partir de diluições seriadas, permitindo a avaliação confiável de compostos ou candidatos a vacinas.
- Análises: Gera títulos de ponto final e médias geométricas que permitem a comparação estatística das respostas imunológicas entre grupos experimentais.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica por meio da avaliação da imunogenicidade em modelos animais (por exemplo, soro de camundongo) antes dos ensaios em humanos.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma plataforma padronizada de sorologia aplicável a múltiplas cepas de influenza e formatos de vacinas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Fornece confiança preditiva na imunidade induzida por vacinas por meio da medição de títulos de anticorpos neutralizantes como um correlato de proteção.
- Valor Operacional: Garante a reprodutibilidade do ensaio por meio da padronização da preparação do antígeno, do soro tratado com RDE e dos tempos de incubação com eritrócitos específicos para cada espécie.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar/não avançar ao identificar precocemente imunogenicidade insuficiente, reduzindo riscos biológicos em fases tardias.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos a vacinas com base na amplitude dos títulos entre cepas e nas taxas de seroproteção.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em virologia e sorologia para manipular antígenos virais, preparar soro tratado com RDE e interpretar os pontos finais da hemaglutinação.
- Depende do acesso a instalações compatíveis com nível de biossegurança 2 (BSL2) para o manejo seguro de vírus da influenza e produtos sanguíneos humanos/animais.
- Necessita padronização das fontes de eritrócitos (por exemplo, de cobaia, peru, humano tipo O) para minimizar reatividade cruzada e garantir a aglutinação específica por espécie.
- Exige controles precisos de tempo durante a incubação dos eritrócitos para evitar leituras falsas negativas ou falsas positivas na hemaglutinação.
- Limita-se à medição da atividade funcional de anticorpos; não quantifica classes de imunoglobulinas não neutralizantes ou não funcionais sem ensaios complementares (por exemplo, ELISA).
