Name: Enriquecimento de agregados da proteína insolúvel em detergente do cérebro humano após a morte (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Aprenda a enriquecer agregados de proteínas insolúveis em detergente de tecido cerebral humano pós-morte. Este método rápido facilita a identificação de proteínas mal dobradas em doenças neurodegenerativas.

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Os autores agradecer os Drs Jim Lah e Allan Levey, Emory departamento de Neurologia, sugestões e comentários úteis. Este trabalho foi parcialmente financiado pela parceria de medicina acelerando subvenção (U01AG046161-02), o Emory Alzheimer centro de pesquisa da doença (P50AG025688) e um Instituto Nacional sobre envelhecimento concedem (R01AG053960-01) para N.T.S. Esta pesquisa também foi apoiada em parte pelo núcleo neuropatologia da subvenção Emory neurociência NINDS núcleo instalações, P30NS055077.

declaração de ética: todos os tecidos do cérebro foram obtidos a partir da Emory Alzheimer &#39; s doença Research Center (ADRC) banco de cérebro. Tecidos humanos após a morte foram adquiridos ao abrigo de protocolos apropriados institucional Review Board (IRB).
 1. homogeneização e fracionamento <ol><li>seleção de tecido Nota: congelado o tecido do córtex frontal após a morte de controle saudável (Ctl) e patologicamente casos confirmados de AD foram seleccionados a partir do Emory Banco de cérebro ADRC (n = 2). Post-mortem neuropatológica avaliação da distribuição de placa amiloide foi realizada de acordo com o consórcio para estabelecer um registro para Alzheimer &#39; s doença semi-quantitativa marcando critérios 24, embora patologia do tangles emaranhado foi avaliada em conformidade com o sistema de preparo de Braak. 16 <ol><li>obter congelado o tecido cerebral post-mortem de controle saudável (Ctl) e patologicamente confirmado casos de AD. Utilizando recipientes de gelo seco, fórceps e uma lâmina de barbear, impostos especiais de consumo ~ porções de 250 mg de matéria cinzenta de cada amostra de tecido na tarada descartável pesam barcos, tendo o cuidado de evitar que o tecido descongelar. Registrar o peso de cada peça para ser homogeneizado.</li>
		<li>Impostos ~ 250 mg de matéria cinzenta, usando a pinça e navalha, inspecionando visualmente para localizar a interface entre a substância cinzenta externa e interna de substância branca. Evitar a substância branca e, mais importante, qualquer grandes vasos sanguíneos ou regiões sangrentas, meninges ou aracnoide. Mantenha o tecido congelado durante o processo de corte a trabalhar rapidamente e frequentemente colocando o barco pesagem com tecido cerebral em recipientes de isopor com gelo seco</li>
		<li>Gravar o peso exato da matéria cinzenta extirpado da cada pedaço congelado usando uma balança analítica. Calcular o volume de tampão baixo sal (LS) (ver tabela 1) necessário para homogeneização de homogenizacao (5 mL/g ou 20% w/v).</li>
		<li>Preparar 10 mL LS de tampão com 1x do inibidor de protease e fosfatase cocktail e calma na Ice.</li>
		<li>Remover tecido pesado e pesagem do barco de gelo seco e corte em pedaços de 2 x 2 mm aproximadamente, enquanto ele derrete. Transferência para um tubo de homogeneizador de pre-refrigerados homogenizacao 2ml no gelo</li>
		<li>Adicionar 5 mL/g (20% w/v) do buffer de sal baixo gelada (LS) com 1 X coquetel de inibidor de protease e fosfatase.</li>
		<li>Homogenize no tecido cerebral no gelo usando aproximadamente 10 traços de alta apuramento pilão A e 15 golpes de pilão de depuração baixa B.</li>
		<li>Transferir tudo homogeneizado para um tubo de polipropileno 2 mL, usando um pipeta Pasteur de vidro. Rótulo do tubo com &#8220; TH &#8221; (Homogenate Total), o tecido caso número e homogeneizado volume. alíquota 0,8 mL num tubo rotulado 1,5 mL. Qualquer excesso homogenate pode ser similarmente aliquotadas e armazenado a -80 ° C.</li>
		<li>a cada 0,8 mL alíquota, adicionar 100 µ l cada de 5 M NaCl e sarkosyl de 10% (p/v) para as concentrações de 0,5 M e 1% p/v, respectivamente. Misturar os tubos bem pela inversão e incubar no gelo por 15 min. de tubos de rótulo com &#34; TH-S &#34; (Total homogeneizado-Sarkosyl) para indicar que o homogenates estão no buffer de sarkosyl (tabela 1).</li>
		<li>Proceda à sonicação cada tubo para pulsos de três 5 s em 30% amplitude no gelo (intensidade máxima = 40%) usando uma sonda de microtip.</li> <li>determinar as concentrações de proteína do homogenates usando o ácido bicinchoninic (BCA) ensaio 25 método. 
		Nota: A concentração de proteína média de TH-S homogenates preparado em 5 mL LS por grama de tecido é de 15-20 mg/mL. O homogenates pode ser fracionada imediatamente ou armazenado a-80 ° C até o uso.</li>
		<li>Homogenates TH-S diluir a 10 mg/mL, usando gelada sark buffer (tabela 1) com 1 x inibidores de protease e fosfatase.</li>
		<li>Transferir 5 mg proteína (0,5 mL) de cada homogenate TH-S em 500 tubos de se µ l em policarbonato e par-equilíbrio com buffer de sark. Carregar os tubos em um rotor pre-refrigerado e se a 180.000 x g durante 30 min a 4 ° C. transferência do sarkosyl-solúvel fracções sobrenadantes (S1) para tubos de 1,5 mL e armazene a -80 ° C. 
		Nota: (Lavagem opcional) adicionar 200 µ l de sark-buffer para o se tubos contendo as frações insolúveis em detergente (P1) e desalojar as pelotas (P1) da parte inferior dos tubos se utilize uma ponta de pipeta de 200 µ l.</li>
		Tubos <li>brevemente de pulso-gire o invertido para 2-3 s (&#8804; 2.500 x g) em um microcentrifuge para transferir o buffer e pelotas (P1) para os tubos de 1,5 mL abaixo. Resuspenda as pelotas insolúveis (P1) no buffer de sark pipetando para cima e para baixo para garantir a pelota é interrompida.</li>
		<li>Par-equilíbrio e centrifugar 180.000 x g por um adicional 30 min a 4 ° C.</li>
		<li>Desprezar o sobrenadante de lavagem opcional (S2) e incube as pelotas de sarkosyl insolúveis (P2) em 50-75 µ l de tampão de ureia (tabela 1) com 1 x PIC (protease e fosfatase inibidor cocktail) por 30 min à temperatura ambiente para solubilizar o pelota. 
		Nota: Buffer de ureia quente a temperatura ambiente antes do uso para evitar a precipitação de SDS. Para aplicações sensíveis ao detergente, omitir SDS de buffer de ureia e considerar lavar o sedimento insolúvel (P2) no baixo sal buffer antes de resuspending no buffer de ureia.</li>
		<li>Transferir as ressuspensa Pelotas (P2) para tubos de 0,5 mL e usar breve (1 s) microtip sonication em amplitude de 20% (intensidade máxima = 40%) para solubilizar totalmente as pelotas.</li>
		<li>Determinar as concentrações de proteína de sarkosyl-solúvel (S1) e insolúveis (P2) frações usando o BCA método de ensaio. Use estas frações imediatamente ou armazenar a-80 ° C até o uso.</li>
	</ol></li></ol> 2. Immunoblotting <ol><li>mancha ocidental Nota: mancha ocidental foi realizada de acordo com os procedimentos anteriormente relatados com ligeiras alterações. 5 , 10 <ol><li>preparar 40 µ g amostras de homogenates total (TH-S), sark-solúvel (S1) e frações de sark insolúveis (P2) em 1 amortecedor da amostra X Laemmli SDS-page com pH TCEP 5 mM 7. Incubar as amostras a 95 ° C por 5 min.</li>
		Amostras de <li>carga em SDS-PAGE um pré-moldado bem 10 4-12% Bis-Tris gel. Electrophorese em 80 V para o primeiro centímetro (10 min) e 120 V para o restante (60 min), ou até que a tintura de seguimento atinge a parte inferior do gel.</li>
		<li>Use uma lâmina de barbear fresca e gel de faca para dividir-abrir a gaveta do gel de pre-cast. Delicadamente cortar fora os pentes e inferior do gel com uma lâmina de barbear fresco.</li>
		<li>Resuspenda as pelotas insolúveis (P1) em 200 µ l sark-buffer com 1x PIC pipetando cima e para baixo.</li>
		<li>Transferência para uma membrana de nitrocelulose de 0,2 µm usando um método de transferência de seco em uma máquina de mancha (consulte a tabela de materiais).</li>
		<li>Bloquear a membrana em tampão de bloqueio (BB) sem Tween 20 por 30 min, seguida com BB com 0,05% Tween 20 (BB/T) por 30 min. Após o bloqueio, lavar a membrana em TBS/T (0.1% Tween 20) por 5 min remover o tampão de bloqueio excesso.</li>
		<li>Preparar diluições de 1:1,000 de pT231 os anticorpos primários, Tau-2 (pan tau), AT8 e EEA1 no BB/T (0,05% Tween 20).</li>
		<li>Incubar as membranas em solução de anticorpo primário durante a noite a 4 ° C, com agitação circular. Lavar a membrana em TBS/T 3 x 15 min.</li>
		<li>Sonda a membrana com uma diluição de 1: 20.000 de fluorescente-etiquetadas infravermelho próximo anticorpo secundário no BB/T para 60 min à temperatura ambiente na escuridão agitador. Lavar a membrana para 3 x 10 min na TBS/T e 2 x 5 min em TBS</li>
		<li>Scan a membrana usando um sistema no comprimento de onda de excitação apropriada (por exemplo, 700 nm (canal vermelho) para tintura infravermelho 680 cabra anti-rato IgG (H + L) secundário e 800 nm (canal verde) para tintura infravermelho 790 burro anti-rabbit IgG (H + L de imagens de infravermelho secundária)).</li>
		<li>Usar o software de imagem para quantificar a intensidade do sinal e executar medidas de densitometria conforme o fabricante &#39; instruções de s, garantir autoconfiguração de fundo é definido como média o fundo todo.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Neste documento vamos apresentar e discutir um protocolo de detergente-fracionamento de etapa única Abreviado que é aplicável a uma ampla variedade de aplicações experimentais que variam de análise proteômica de espectrometria de massa-baseado a proteína funcional ensaios de enrolamento e mancha ocidental. 5 , 6 , 7 , 10 esta metodologia é talvez mais eficaz quando usado para estudar proteinopa...

Doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer (AD), a doença de Parkinson (PD), a doença de Huntington (HD), esclerose lateral amiotrófica (ela) e as doenças de príon estreitamente relacionadas são proteinopathies caracterizadas pelo acúmulo gradual de agregados de proteína insolúvel em detergente no cérebro com acompanhamento cognitivo declinam. 1 , 2 este recurso compartilhado patológico é pensado para jogar um papel central na etiologia e fisiopatologia dessas doenças neurodegenerativas. 2 estes agregados, normalmente, compostos de fibras de amiloides poliméricas, que são compostas de repetir unidades de misfolded proteínas exibindo Cruz β-estrutura. 1 , 2 , 3 , 4 bioquimicamente, agregados amiloides são altamente resistentes à desnaturação química ou térmica e solubilização,3 que apresenta desafios únicos para a sua purificação, análise e estudo através de técnicas bioquímicas tradicionais. 2 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 não é novidade, a fração de proteína insolúvel em detergente tem sido o foco de muita pesquisa em fisiopatologia das doenças neurodegenerativas que envolvem o acúmulo de misfolded proteínas. 6 , 12 , 13 , 14
Técnicas de fracionamento bioquímico frequentemente têm sido utilizadas para enriquecer a fração insolúvel em detergente de homogenates cerebral post-mortem. 6 , 12 , 13 , 14 um dos métodos mais comuns envolve a extração sequencial de tecido homogenates com buffers e detergentes de aumentar o rigor, seguido por ultracentrifugação para particionar as frações solúveis e insolúveis. Um protocolo comumente usado fracionamento sequencial6,14 envolve a homogeneização de amostras de tecido congelado em um buffer de detergente livre baixo sal (LS) e as pelotas insolúveis resultantes então são extraídas sequencialmente com amortecedores que contêm sal elevado, detergentes não-iônicos, alta sacarose, detergentes iônicos e finalmente chaotropes como ureia. 6 , 14 uma desvantagem óbvia de tais protocolos um fracionamento sequencial é o tempo substancial e compromisso de trabalho necessário para concluí-las. Incluindo a homogeneização e ultracentrifugação, um protocolo típico de cinco etapas de fracionamento pode levar várias horas ou mesmo dias para completar. 4 , 6 , 7 , 10 , 15 , 16 , 17 , 18 além disso, como muitos agregados de proteína patológica permanecem insolúveis em todos, mas as mais adversas condições19,20 a maioria das frações geradas são de valor limitado. Assim, as etapas de fracionamento menos rígidas utilizando altas concentrações de sal e detergentes não-iônicos são em grande parte redundantes.
Estudos anteriores mostraram que o detergente iônico N-Lauril-sarcosina (sarkosyl) é um excelente candidato para um protocolo simplificado fracionamento de detergente de etapa única. 5 , 6 , 12 , 13 , 14 , 21 , 22 , 23 como um detergente de desnaturação, sarkosyl é suficientemente rigorosa para solubilizar a maioria vasta das proteínas nativamente dobradas no cérebro sem solubilizing agregados de misfolded proteínas compostos por beta-amiloide (Aβ),6,11 tau fosforilada (pTau),6 TAR ADN-proteína obrigatória 43 (TDP-43),14 alfa-synuclein,12,13 do tremor epizoótico,23 ou U1 pequenas ribonucleoproteínas nucleares (snRNPs U1) como U1 - 70 K. 5 , 21 , 22 Como sarkosyl é menos rigoroso do sulfato dodecyl de sódio detergente aniônico onipresente (SDS), preserva menos robustas oligoméricas formas de agregados de misfolded proteínas que não podem suportar o tratamento de SDS. 9
Anteriormente, nós descrevemos um protocolo de detergente-fracionamento Abreviado que obtiveram resultados comparáveis aos métodos de fracionamento sequencial mais trabalhosos. 5 , omitindo as menos rigorosas etapas de fracionamento, fomos capazes de desenvolver um protocolo facile fracionamento de etapa única para o enriquecimento dos agregados de proteína insolúvel em detergente do cérebro humano após a morte. 5 este protocolo detalhado aqui descrito é bem adequado para uma ampla gama de aplicações experimentais que variam de mancha ocidental e ensaios de espectrometria de massa-baseado proteomics para enrolamento de proteína funcional e propagação de agregação. 5 , 6 , 21

<table><tbody><tr><td>Coquetel de inibidores de protease e fosfatase, sem EDTA (100X)</td><td>Coquetel de inibidores de protease e fosfatase</td> <td>Thermo Fisher</td><td>78441</td></tr><tr><td>Sistema de desmembranador sônico (ultrassom)</td>Ultrassônico <td>de microponta de FB505110</td><td></td> <td>Fisher</td></tr><tr><td>Scientific Ultracentrífuga Optimax TLX Ultracentrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>361545</td><td>ultracentrífuga refrigerada</td></tr><tr><td>TLA120.1 rotor</td>Rotor <td>de</td><td>ultracentrífuga</td> <td>Beckman Coulter</td></tr><tr><td>362224 500 ul (8 x 34 mm) tubos de policarbonato, parede espessa</td> Tubos de ultracentrífuga <td>Beckman Coulter</td><td>343776</td><td>para rotor TLA120.1</td></tr><tr><td>Tampão de amostra 4X SDS</td><td>Solução caseira</td><td>N/A</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>TCEP, pH neutro</td><td>Thermo Fisher</td><td>77720</td><td>tampão de bloqueio do agente redutor</td></tr> <tr><td>(TBS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>37542</td><td>tampão de bloqueio</td></tr> <tr><td>(TBS) tampão de bloqueio + 0,05% Tween 20</td><td>Thermo Fisher</td><td>37543</td><td>tampão de bloqueio e diluente de anticorpos</td></tr><tr><td>4-12% Bolt Bis-Tris Plus géis, 10 poços</td><td>Thermo Fisher</td><td>NW04120BOX</td><td>géis SDS-PAGE pré-moldados</td></tr><tr><td>MES SDS Running Buffer (20X)</td><td>Thermo Fisher</td><td>B0002</td><td>SDS-PAGE running buffer</td></tr><tr><td>N-Lauroilsarcosina sal de sódio (sarkosyl)</td><td>Sigma Detergente Aldrich</td><td>L5777-50G</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Tau-2 (pan tau)</td><td>Anticorpos Chemicon</td><td>MAB375</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-fosfo-treonina 231 Tau</td><td>Anticorpos Millipore</td><td>MAB5450</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fosfo-seroína 202 e treonina 205 Anticorpo Tau (AT8)</td><td>Anticorpos Thermo Fisher</td><td>MN1020</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-antígeno 1 do endossomo precoce (EEA1)</td><td>abcam</td><td>ab2900</td><td>anticorpos</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 680 anticorpo secundário IgG (H+L) de cabra anti-camundongo</td><td>Thermo Fisher</td><td>A21058</td><td>anticorpos</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 790 anticorpo secundário IgG (H+L) de burro</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11374</td><td>anticorpos</td></tr><tr><td>iBlot2 Dry Blotting System</td><td>Thermo Fisher</td><td>IB21001</td><td>Transferência de gel</td></tr><tr><td>iBlot2 Pilhas de transferência, nitrocelulose, mini</td><td>Transferência</td><td>de</td><td>gel</td> IB23002 Thermo Fisher</tr></tbody></table>

enriquecimento de agregados da proteína insolúvel em detergente do cérebro humano após a morte

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

Neste estudo, descrevemos um protocolo abreviado fracionamento de etapa única para o enriquecimento dos agregados de proteína insolúvel em detergente do cérebro humano após a morte. O detergente iônico N-Lauril-sarcosina (sarkosyl) efetivamente solubiliza proteínas dobradas nativamente no tecido cerebral, permitindo o enriquecimento de agregados da proteína insolúvel em detergente de uma ampla gama de proteinopathies neurodegenerativas, tais como A doença de Alzheimer (AD), doença de Parkinson e esclerose lateral amiotrófica e doenças de príon. Controle humano e tecidos do cérebro após a morte de AD foram homogeneizadas e sedimentada por ultracentrifugação na presença de sarkosyl para enriquecer agregados de proteína insolúvel em detergente incluindo tau fosforilada patológica, o componente do núcleo do tangles emaranhados em AD. Mancha ocidental demonstrou a solubilidade diferencial de agregados-tau fosforilada e a proteína solúvel em detergente, Early Endosome antígeno 1 (EEA1) no controle e no cérebro do AD. Análise proteômica também revelou o enriquecimento de β-amiloide (Aβ), tau, snRNP70 (U1 - 70 K) e apolipoproteína E (APOE) nas fracções sarkosyl insolúveis do cérebro AD comparados de controle, consistente com estratégias de fracionamento de tecido anterior . Assim, o presente protocolo simples enriquecimento é ideal para uma ampla gama de aplicações experimentais variando de mancha ocidental e proteína funcional ensaios de agregação co a espectrometria de massa-baseado proteomics.

O protocolo de sarkosyl de etapa única abreviado-fracionamento foi usado para enriquecer agregados de proteína insolúvel em detergente de controle e o cérebro após a morte de AD (Figura 1). Proteínas de frações TH-S, S1, S2 e P2 foram resolvidas por SDS-PAGE, fixado por 15 min em Coomassie azul reserva fixador seguida de coloração suave com buffer de coloração azul brilhante de Coomassie G-250. A etapa de ressuspensão é opcional, desde que não havia níveis in...

Um protocolo de fracionamento abreviado para o enriquecimento dos agregados de proteína insolúvel em detergente do cérebro humano após a morte é descrito.

Enriquecimento de agregados da proteína insolúvel em detergente do cérebro humano após a morte

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

O objetivo geral deste protocolo de fracionamento é enriquecer agregados proteicos insolúveis em detergente a partir de tecido cerebral humano pós-morte. Assim, este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da neurodegeneração, como a identificação e caracterização de agregados proteicos desnaturalizados na doença. A principal vantagem desta técnica é o enriquecimento rápido e isolamento de agregados proteicos insolúveis em detergente a partir de tecido cerebral em um curto espaço de tempo.Quem demonstrará este procedimento será Tram Nguyen, uma técnica do meu laboratório. Obtenha tecido cerebral post mortem congelado de controles saudáveis e de casos com diagnóstico patológico confirmado de DA. Utilize pinça e lâmina de barbear para remover porções de aproximadamente 250 miligramas de matéria cinzenta de cada amostra de tecido. Deixe o segmento cerebral descongelar por um minuto.Agora, pique um pedaço de tecido em pedaços de aproximadamente dois milímetros cúbicos enquanto descongela. Transfira para um tubo de homogeneizador Dounce de dois mililitros pré-resfriado sobre gelo. Lembre-se de evitar a substância branca e quaisquer vasos sanguíneos grandes.Trabalhe rapidamente e coloque o tecido em barquinhos descartáveis para pesagem TARE. Tenha cuidado para evitar o descongelamento do tecido, colocando com frequência o barquinho com o tecido cerebral em recipientes de poliestireno com gelo seco. Após dissecar e pesar todas as partes necessárias do tecido, retire um barquinho contendo um pedaço de tecido do gelo seco.Em seguida, adicione cinco mililitros de tampão com baixa concentração de sal, frio, contendo coquetel de inibidores de protease e fosfatase, por grama de tecido, e homogenize na gelo utilizando aproximadamente 10 movimentos do pistilo A de grande folga e 15 movimentos do pistilo B de pequena folga. Use então uma pipeta Pasteur de vidro de nove polegadas para transferir cada homogenato para um tubo de polipropileno de dois mililitros identificado. Aliquote o homogenato restante em tubos adicionais de 1,5 mililitro identificados, de maneira semelhante, para armazenamento a menos 80 graus Celsius. Para prosseguir com a fracionamento, adicione 100 microlitros de cloreto de sódio cinco molar e 100 microlitros de sarkosyl a 10 por cento a cada alíquota de 0,8 mililitro.Agite bem por inversão e, em seguida, incube no gelo por 15 minutos. Após a incubação, use um sonificador equipado com uma sonda de microponta para aplicar três pulsos de cinco segundos cada, com amplitude de 30 por cento.Após utilizar o método do ácido bicinconínico para determinar as concentrações proteicas dos homogenatos, adicione tampão sark gelado com inibidores de protease e fosfatase a cada amostra até uma concentração final de 10 miligramas por mililitro. Em seguida, transfira 500 microlitros de cada amostra para tubos de ultracentrífuga de policarbonato de 500 microlitros. Coloque os tubos em um rotor previamente resfriado e realize a ultracentrifugação a 180.000 vezes g durante 30 minutos a quatro graus Celsius.Após a centrifugação, transfira os sobrenadantes solúveis em sarkosyl S1 para tubos de 1,5 mililitro e armazene a menos 80 graus Celsius. Adicione 200 microlitros de tampão sark aos tubos de ultracentrífuga contendo as frações P1 insolúveis em detergente e use a ponteira da pipeta para desprender os pellets do fundo dos tubos de ultracentrífuga. Em seguida, transfira os pellets P1 re-suspendidos para novos tubos de ultracentrífuga de 500 microlitros, equilibre em pares e centrifugue a 180.000 × g por mais 30 minutos a quatro graus Celsius.Descarte o sobrenadante S2. Em seguida, adicione 50 a 75 microlitros de tampão de ureia com coquetel de inibidores de protease e fosfatase aos pellets insolúveis em sarkosyl e incube por 30 minutos à temperatura ambiente para solubilizar o pellet P2. Após a incubação, transfira os pellets P2 re-suspendidos para tubos de 0,5 mililitro previamente identificados e solubilize completamente os pellets, utilizando uma sonicação breve com microsonda de um segundo a 20 por cento de amplitude.Determine as concentrações de proteína das frações solúveis e insolúveis em sarkosil utilizando o método do ensaio BCA. Prepare amostras de 40 microgramas de homogenato total, frações S1 solúvel em sarkosil e P2 insolúvel em sarkosil, em tampão de amostra para eletroforese SDS-PAGE Laemmli 1x contendo TCEP 5 milimolar, pH 7. Incube as amostras a 95 graus Celsius por cinco minutos.Carregue as amostras em géis pré-moldados de Bis-Tris SDS-PAGE de 10 poços com gradiente de 4 a 12%. Realize a eletroforese a 80 volts durante o primeiro centímetro e a 120 volts por cerca de uma hora ou até que o corante de acompanhamento alcance a base do gel. Mergulhe as cassetes dos géis pré-moldados em água destilada e, em seguida, utilize uma lâmina de barbear nova e uma faca para géis para abri-los.Corte cuidadosamente os pentes e a parte inferior de cada gel com uma lâmina de barbear nova. Transfira para membranas de nitrocelulose de 0,2 mícrons utilizando um método de transferência a seco em uma máquina de blotting. Após a transferência, bloquee as membranas no tampão de bloqueio sem Tween-20 por 30 minutos, seguido pelo tampão de bloqueio com 0,5 por cento de Tween-20 por 30 minutos.Após o bloqueio, lave as membranas em TBS com 0,1 por cento de Tween-20 durante cinco minutos para remover o excesso de tampão de bloqueio. Prepare diluições 1:1.000 dos anticorpos primários no tampão de bloqueio com 0,5 por cento de Tween-20. Neste caso, são utilizados Phospho-Tau pT231 e EEA1.Incube as membranas na solução de anticorpo primário durante a noite a quatro graus Celsius com agitação circular. No dia seguinte, lave as membranas em TBS com 0,1 por cento de Tween-20 três vezes, por 15 minutos cada. Incube as membranas com uma diluição 1:20.000 do anticorpo secundário fluorescente marcado com infravermelho próximo e tampão bloqueador com 0,5 por cento de Tween-20 por 60 minutos à temperatura ambiente, no escuro, em agitador.Após a incubação, lave a membrana três vezes por 10 minutos em TBS com 0,1 por cento de Tween-20 e duas vezes em TBS por cinco minutos cada vez. Analise a membrana utilizando um sistema de imagem infravermelha no comprimento de onda de excitação apropriado para o anticorpo secundário utilizado. Este gel corado com Coomassie mostra 20 mcg de proteína das frações TH-S, S1, S2 e P2.A análise por Western blot demonstra claramente que, no cérebro de pacientes com DA, a proteína Tau patológica de alto peso molecular, fosforilada, forma agregados insolúveis na sarkosil, restando muito pouca Tau fosforilada nas frações solúveis em sarkosil. A EEA1 foi utilizada como marcador geral para a maioria das proteínas nativas não patológicas, que são naturalmente solúveis em sarkosil e se distribuem na fração S1 tanto no cérebro controle quanto no cérebro com DA. Notavelmente, houve um sinal ligeiramente menor para EEA1 na fração solúvel em comparação com a fração TH-S, indicando que um pequeno pool de EEA1 provavelmente é insolúvel em sarkosil, embora abaixo do limite de detecção pelo Western blot com este anticorpo específico.Esta figura mostra a análise proteômica de proteínas patológicas da DA utilizando um protocolo de fracionamento em um único passo ou múltiplos passos. A técnica de fracionamento em um único passo pode ser vantajosa para proteínas de baixa abundância, pois as perdas totais de amostra são significativamente reduzidas. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de excisar o máximo possível de substância branca do tecido cerebral.Após este procedimento, outros métodos como proteômica baseada em espectrometria de massas podem ser realizados com o objetivo de identificar e caracterizar os componentes proteicos centrais de agregados patológicos nas suas doenças degenerativas.

enrichment-detergent-insoluble-protein-aggregates-from-human

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

A heterogeneidade celular de tecido cerebral representa uma limitação significativa para o estudo de marcas epigenéticas na cromatina porque a maioria dos ensaios falta de resolução única célula. Neurônios são normalmente misturados com glia e outras células não-neuronais. Nós fornecemos um protocolo para extrair e coletar núcleos neuronal do cérebro humano.

Isolamento Núcleos neuronais de Tecidos Humanos Postmortem Cérebro

Nós descrevemos uma técnica para a preparação de esclarecer humanos homogeneizados cortical, separação de proteínas por SDS-PAGE, recuperação antigênica e immunoblotting com um anticorpo para o peptídeo Aâ. Usando este protocolo, que consistentemente detectar Aâ monomérica e multimérica no tecido cortical dos seres humanos com a patologia de Alzheimer.

SDS-PAGE/Immunoblot Detecção de multímeros Aâ no tecido cortical Humanos homogeneizados utilizando antígeno Epitope-Retrieval

Uma nova espécie de proteína príon celular...

Isolamento de Oligómeros PrP solúveis e insolúveis no cérebro humano normal

Este vídeo demonstra o protocolo para isolar fibrilas amilóides do extrato de tecido cerebral de camundongo usando centrifugação por gradiente de densidade e digestão de proteínas não amilóides.

Isolamento de fibrilas amilóides do extrato de tecido cerebral

Este vídeo explica o processo de isolamento e enriquecimento de agregados de proteínas insolúveis em detergente do tecido cerebral humano post-mortem congelado. Ele demonstra as principais etapas, incluindo homogeneização, tratamento com detergente, sonicação e ultracentrifugação para separar e purificar os agregados insolúveis. A etapa final envolve a solubilização dos agregados em tampão de ureia para análise posterior.

Isolamento de agregados de proteínas insolúveis em detergente do tecido cerebral humano post-mortem

Um protocolo de extração de proteínas comum utilizando tampão uréia / tiouréia / SDS para tecido cerebral humano e camundongos permite indentification de proteínas por 2D-DIGE e sua posterior caracterização por mini-immunoblotting 2DE. Este método permite a obtenção de resultados mais reprodutíveis e confiáveis ​​a partir de biópsias humanos e modelos experimentais.

Proteína Consenso Brain-derivada, protocolo de extração para o Estudo do cérebro humano e murino Proteome Usando ambas 2D DIGE e Mini 2DE Immunoblotting

Aqui, apresentamos um protocolo para o isolamento de alfa-sinucleína (α-syn) cada vez mais insolúvel/agregada do tecido cerebral humano post-mortem. Através da utilização de tampões com aumento da força do detergente e técnicas de ultracentrifugação de alta velocidade, as propriedades variáveis da agregação de α-syn em tecidos doentes e não doentes podem ser examinadas.

Extração seqüencial de solúveis e insolúveis alfa-sinucleína de Brains parkinsonianos

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Este método de purificação bioquímica com análise proteômica baseada em espectrometria de massa facilita a caracterização robusta de núcleos fibril amiloides, o que pode acelerar a identificação de alvos para prevenir a doença de Alzheimer.

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Abordagens experimentais para análise bioquímica da proteína ácida fibrilar glial e suas variantes associadas a doenças

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Enriquecimento de agregados da proteína insolúvel em detergente do cérebro humano após a morte

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