Mapeamento genômico de interações proteína-DNA com ChEC-seq em Saccharomyces cerevisiae

O objetivo geral deste procedimento é gerar mapas de todo o genoma de interações proteína-DNA in situ com alta resolução e baixo fundo, sem a necessidade de reticulação de formaldeído, solubilização de cromatina ou anticorpos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da transcrição, como onde vários fatores regulatórios se associam à cromatina, em relação às regiões reguladoras de genes. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece mapas de ligação genômica de alta resolução com fundo insignificante e evita limitações associadas aos protocolos ChEC-seq padrão.

Demonstrando o procedimento estará Sebastian Grunberg, meu colega do Fred Hutchinson Cancer Research Center. À tarde ou à noite do dia anterior à experiência, iniciar uma pré-cultura da estirpe de utilização experimental. Inocular três mililitros de peptona dextrose usada, ou um meio seletivo apropriado com uma única colônia da cepa, contendo o fator marcado com MNase.

Incube essa cultura durante a noite em uma incubadora shaker de 30 graus Celsius. Na manhã seguinte, dilua a cultura durante a noite em 50 mililitros de densidade média a óptica a 600 nanômetros de 0,2 a 0,3. Incubar a cultura na incubadora agitadora até atingir uma densidade óptica de 600 nanômetros de 0,5 a 0,7.

Prepare a quantidade necessária de tampão A mais aditivos e mantenha-a em temperatura ambiente durante o procedimento. Prepare tubos de microcentrífugas para coleta de amostras. Para cada novo fator analisado, coletar amostras sem adição de cálcio e adicionar 30 segundos, um minuto, 2,5 minutos, 5 minutos e 10 minutos após a adição de cálcio.

Para cada tubo, adicione 90 microlitros de solução de parada e 10 microlitros de 10% SDS. Quando a cultura atingir uma densidade óptica de 600 nanômetros de 0,5 a 0,7, decantar a cultura em um tubo cônico de 50 mililitros e centrifugar a 1.500 vezes g por um minuto à temperatura ambiente. Remova o sobrenadante, ressuspenda completamente as células em um mililitro de tampão A e transfira as células ressuspensas para um tubo de microcentrífuga.

Pulverize as células ressuspensas em uma microcentrífuga a 1.500 vezes g por 30 segundos em temperatura ambiente. Aspire o sobrenadante e ressuspenda completamente as células em um mililitro de tampão A pipetando para cima e para baixo. Pulverizar as células ressuspensas a 1.500 vezes g durante 30 segundos à temperatura ambiente.

Remova o sobrenadante, ressuspenda as células em um mililitro de tampão A e centrifugue novamente. Depois de remover o sobrenadante, ressuspenda completamente as células em 570 microlitros de tampão A. Adicione 30 microlitros de 2% de digitonina para facilitar a permeabilização das células e inverta para misturar. Permeabilize as células em um bloco de calor a 30 graus Celsius por cinco minutos.

Pipete a reação para cima e para baixo para garantir uma distribuição uniforme das células. Como controle negativo, transferir alíquotas de 100 microlitros de células permeabilizadas para um tubo de microcentrífuga contendo solução de parada e SDS e vórtice brevemente para misturar. Antes de iniciar o curso do tempo, é fundamental ter os tubos da solução de parada, a pipeta, as pontas da pipeta e um temporizador próximo aos blocos de calor para que os primeiros pontos de tempo possam ser coletados com eficiência.

Para iniciar o curso do tempo, adicione 1,1 microlitros de cloreto de cálcio de um molar às células permeabilizadas para ativar a MNase e inverta várias vezes rapidamente para misturar. Retorne imediatamente a reação mista a 30 graus Celsius e inicie um cronômetro. Em cada ponto de tempo a ser coletado, pipete a reação para cima e para baixo para garantir uma distribuição uniforme das células e, em seguida, remova uma alíquota de 100 microlitros de células permeabilizadas para um tubo de microcentrífuga contendo solução de parada e SDS.

Vórtice brevemente para misturar. Uma vez que todos os pontos de tempo tenham sido coletados, adicione quatro microlitros de 20 miligramas por mililitro de proteinase K a cada amostra. Vortex brevemente para misturar e incubar a 55 graus Celsius por 30 minutos.

Adicione 200 microlitros de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico a cada amostra, vortex vigorosamente para misturar e centrifugue na velocidade máxima por cinco minutos em temperatura ambiente. Remova a fase aquosa para um novo tubo. Adicione 30 microgramas de glicogênio e 500 mililitros de etanol a 100%.

Vortex vigorosamente para misturar e precipitar em gelo seco por 10 minutos ou até que a solução fique viscosa. Pulverize o DNA precipitado centrifugando na velocidade máxima e quatro graus Celsius por 10 minutos. Transvase o sobrenadante e lave cada pellet com um mililitro de etanol a 70% à temperatura ambiente.

Transvase o etanol e retire o restante invertendo e batendo suavemente os tubos numa toalha de papel. Centrifugar brevemente as amostras com uma centrífuga de bancada e, em seguida, utilizar uma pipeta para remover o ehtanol residual, tendo o cuidado de não perturbar o sedimento. Seque os pellets ao ar em temperatura ambiente por cinco minutos.

Enquanto os pellets de DNA estão secando, faça uma mistura mestre de tampão Tris e RNase A para ressuspender os pellets depois de secos e vórtice para misturar. Adicione 30 microlitros da solução de RNase A a cada pellet de DNA seco, vórtice para misturar e incube a 37 graus Celsius por 20 minutos para digerir o RNa. Após 20 minutos, misture um microlitro de corante de carga de DNA 6X com cinco microlitros de cada amostra e passe em um gel de agarose a 1,5% a 120 volts por 40 minutos.

Comece o procedimento de seleção de tamanho adicionando a cada amostra 75 microlitros de esferas de SPRI em uma solução de polietilenoglicol. Pipete para cima e para baixo 10 vezes para misturar as esferas e a mistura de DNA e, em seguida, incube em temperatura ambiente por cinco minutos. Durante a incubação do grânulo SPRI, prepare tubos de microcentrífugas contendo 96 microlitros de Tris pH 10 milimolar 8.0 e quatro microlitros de cloreto de sódio de cinco molares para cada amostra.

Coloque os tubos contendo as esferas e a mistura de DNA em um rack magnético por dois minutos para coletar as contas na lateral do tubo e, em seguida, transfira cada sobrenadante para um novo tubo contendo Tris e cloreto de sódio. Adicione 200 microlitros de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico a cada amostra, vórtice para misturar e centrifugue na velocidade máxima em temperatura ambiente por cinco minutos. Remova cada fase aquosa para um novo tubo, adicione 30 microgramas de glicogênio e 500 microlitros de etanol 100%.

Precipitar o ADN em gelo seco durante 10 minutos ou até que a solução fique viscosa. Pulverizar o ADN precipitado centrifugando à velocidade máxima e a quatro graus Celsius durante 10 minutos. Transvasar o sobrenadante e lavar cada pellet com um mililitro de etanol a 70%.

Transvase o etanol, retirando o restante invertendo e batendo suavemente os tubos sobre uma toalha de papel. Centrifugar brevemente as amostras utilizando uma centrifugadora de bancada e utilizar uma pipeta para remover o etanol residual, tendo o cuidado de não perturbar o sedimento. Seque os pellets ao ar em temperatura ambiente por cinco minutos.

Ressuspenda cada pellet seco em 25 microlitros de Tris pH 8. Determinar a concentração de cada amostra utilizando um ensaio de alta sensibilidade. A eletroforese em gel de agarose do DNA a partir de uma análise de clivagem endógena da cromatina de Reb1, um fator regulador geral que se liga às regiões depletadas de nucleossomos, revela um aumento dependente de cálcio na fragmentação do DNA ao longo do tempo, conforme indicado pelo esfregaço e eventual digestão completa do DNA genômico.

A visualização das extremidades dos fragmentos de um experimento de sequenciamento de clivagem endógena da cromatina Reb1 revela um enriquecimento robusto de Reb1 sobre o fundo, derivado da cepa MNase livre após 30 segundos de tratamento com cálcio. Da mesma forma, uma clivagem substancial do DNA foi observada por uma fusão da subunidade mediadora Med8 com MNase, mas não MNase livre impulsionada pelo promotor Med8 um minuto após a adição de cálcio. Para comparar os dados de sequenciamento de clivagem endógena da cromatina Reb1 com os dados de imunoprecipitação da cromatina e sequenciamento de alto rendimento, 1.992 picos de Reb1 determinados pelo método orgânico foram centrados no motivo, e a contagem final média do fragmento em cada posição de base em uma janela de 100 pares de bases ao redor do ponto médio do motivo foi determinada.

Uma assimetria e clivagem marcantes foram observadas com a maioria das extremidades dos fragmentos liberadas por Reb1-MNase mapeando para o lado a montante do motivo. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em um dia inteiro de trabalho, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de limitar o número de amostras analisadas em paralelo, para garantir tempos precisos de pipetagem e manuseio.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da transcrição para, pela primeira vez, caracterizar inequivocamente a associação genômica de um complexo de proteína do tamanho de megadalton sem ligação ao DNA em leveduras. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa ideia de como executar o método ChEC-Seq para mapeamento de todo o genoma de locais de ligação a proteínas no genoma da levedura em brotamento.