Neurocomportamentais avaliações em um modelo do rato de lesão cerebral hipóxica-isquêmica Neonatal
24 de novembro de 2017
Realizamos a oclusão da artéria carótida unilateral no pós-Natal dia 7-10 CD-1 mouse filhotes para criar um modelo de (HI) hipóxico-isquêmica neonatal e investigaram os efeitos da lesão cerebral de HI. Nós estudamos funções Neurocomportamentais nestes ratos em comparação com camundongos normais não operado.
O objetivo geral da cirurgia de lesão cerebral hipóxico-isquêmica em neonatos, seguida por testes cognitivos e motores, é obter um modelo murino para estudar essas lesões e os danos cerebrais relacionados. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre a lesão cerebral hipóxico-isquêmica neonatal, como a forma como tais lesões afetam as funções motoras e cognitivas. A principal vantagem desta técnica é que ela é bem conhecida e amplamente utilizada.
É também um modelo pré-clínico para paralisia cerebral e acidentes vasculares cerebrais neonatais. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades porque a artéria carótida direita unilateral é difícil de identificar. Demonstrará o procedimento, juntamente comigo, Yoon-Kyum Shin, um estudante de pós-graduação do nosso laboratório.
Após anestesiar pelo menos cinco filhotes de camundongo P-sete, posicione um filhote sob um microscópio de dissecação com o abdômen voltado para cima. Em seguida, limpe o pescoço com álcool. Para iniciar a cirurgia, use uma tesoura para fazer uma incisão de 0,7 milímetro no pescoço.
Em seguida, remova cuidadosamente o tecido adiposo com pinça, até expor a artéria carótida direita unilateral. A seguir, com fio 5-0, ligue a artéria carótida direita unilateral. Agora, feche a incisão no pescoço com nylon 5-0 e esterilize a incisão.
Em seguida, permita que a ninhada se recupere em uma câmara hipóxica a 37 graus Celsius com a tampa aberta por cerca de uma hora. Coloque outro camundongo submetido a manipulação cirúrgica na câmara hipóxica para recuperação. Quando todas as ninhadas estiverem completamente acordadas, feche a tampa da câmara e reduza os níveis de gás para estabelecer condições hipóxicas.
Após 90 minutos de hipóxia, devolva os filhotes com lesão cerebral às suas gaiolas. Uma semana depois, prepare os filhotes para cirurgia, como anteriormente, para procurar evidências da lesão. Faça uma incisão no couro cabeludo para identificar a lesão cerebral na área posterolateral do hemisfério direito.
Observe através do crânio semitransparente em busca de evidências de lesão cortical e lesão hipocampal. Assim, classifique os filhotes como lesados ou controles não lesados. Após a verificação, feche o couro cabeludo com sutura e esterilize a incisão.
Quando os camundongos tiverem seis semanas de idade, avalie sua memória com base na aprendizagem e na evitação de um estímulo adversivo. Utilize um aparelho comercial de duas câmaras para o teste de evitação passiva com passagem para iniciar o procedimento. Para começar, coloque um camundongo na câmara clara da caixa por 30 segundos.
Em seguida, abra a porta entre os compartimentos e registre a latência do animal para entrar no compartimento escuro. Permita até 300 segundos para a realização da tarefa. Quando os quatro membros do camundongo estiverem completamente dentro do compartimento escuro, feche a porta.
Em seguida, aplique um choque elétrico de 1/2 miliampère nos pés durante dois segundos e devolva o camundongo à sua gaiola. Vinte e quatro horas depois, repita o teste. Desta vez, permita que o camundongo leve um tempo completo de 300 segundos para entrar na câmara escura e não aplique choque no camundongo.
Realize o teste de caminhada na escada com camundongos de seis semanas de idade para discriminar entre distúrbios sutis da função motora, utilizando análises qualitativas e quantitativas. Primeiro, monte o equipamento em forma de escada e, em seguida, posicione uma câmera de vídeo para gravar os movimentos dos membros de um camundongo no equipamento. A seguir, coloque um camundongo no painel de partida e inicie a gravação com a câmera de vídeo.
Certifique-se de que o vídeo mostre as patas com boa nitidez. Quando o camundongo tocar no último painel do equipamento em forma de escada, interrompa a gravação. Em seguida, retorne o camundongo ao painel inicial e grave novamente a travessia do equipamento pelo animal.
Repita isso um total de quatro vezes por camundongo em cada data do experimento. Posteriormente, ao analisar o vídeo, conte manualmente o número de escorregões cometidos por cada membro enquanto reproduz o vídeo em velocidade 1/10. Quando um membro desliza entre as barras, isso constitui um escorregão.
Quando os camundongos tiverem seis semanas de idade, avalie sua força de preensão. Utilize um medidor de tensão de empuxo/tração, equipado com um fio triangular de dois milímetros de diâmetro, fixado a um painel. Posicione o camundongo sobre o painel, segurando-o pela cauda.
Em seguida, permita que o camundongo alcance apenas o fio metálico com suas patas dianteiras. Assim que o camundongo agarrar o fio, puxe suavemente sua cauda até que ele solte o aperto. O aparelho registrará a força máxima exercida sobre o fio em gramas.
Repita este teste cinco vezes antes de dar um descanso ao camundongo. Durante o teste de força de preensão, ocorrem movimentos notáveis de desempenhos precisos. Tente identificar esses movimentos ao longo de cinco tentativas antes de descansar o camundongo, por pelo menos um minuto, para reduzir a fadiga muscular.
Após o camundongo descansar por pelo menos um minuto, repita a série de cinco ensaios novamente. Em seguida, conceda outro descanso ao camundongo e realize a série pela última vez naquele dia de teste. A partir dos dados, utilize a média das três maiores pontuações para qualquer uma das patas dianteiras ou para ambas as patas dianteiras para análise.
Após a coleta dos cérebros de animais com 14 semanas de idade que sofreram lesão por hipóxia-isquemia, os cérebros foram avaliados morfologicamente quanto à ausência de lesão cortical, lesão leve ou lesão grave. Os mesmos animais foram submetidos a uma ressonância magnética uma semana antes, o que também foi muito revelador. Mesmo o cérebro morfologicamente normal apresentou lesão leve no hipocampo.
Na sexta semana de idade, cinco semanas após a lesão, os camundongos foram avaliados com diversas tarefas comportamentais. Os camundongos com lesão por hipóxia-isquemia apresentaram comprometimento cognitivo na tarefa de evitação passiva de 24 horas. Como apenas o hemisfério direito foi danificado, os camundongos exibiram funções motoras hemiplégicas.
Isso foi revelado pela diferença na porcentagem de escorregões nos degraus transversais da escada para cada membro anterior. Além disso, como a força de preensão envolve o córtex motor no cérebro, os grupos normais e com lesão cortical apresentaram diferenças na força de preensão. Nenhuma diferença foi observada entre os controles normais e os camundongos categoricamente não lesionados, mas os camundongos lesionados estavam claramente prejudicados.
Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como ligar a artéria carótida direita unilateral para gerar camundongos neonatos com hipóxia-isquemia e como realizar análises comportamentais de acompanhamento. É importante observar que, mesmo quando não há dano visível no cérebro cortical sete dias após a lesão, uma ressonância magnética pode revelar uma lesão no hipocampo. Além disso, é fundamental lembrar-se de manipular as crias com delicadeza e realizar a cirurgia o mais rapidamente possível.
Os filhotes têm peles muito fracas e finas, portanto tenha muito cuidado.
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Visão Geral
Este estudo investiga os efeitos da lesão cerebral hipóxico-isquêmica (HI) neonatal em um modelo murino. Foi realizada a oclusão da artéria carótida unilateral em camundongos CD-1 no 7º a 10º dia pós-natal para criar o modelo HI, permitindo a avaliação das funções neurocomportamentais.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Lesão cerebral neonatal
- Avaliação da função motora e cognitiva
Contexto
- A lesão cerebral hipóxico-isquêmica neonatal é uma preocupação significativa na saúde pediátrica.
- Este modelo ajuda a compreender o impacto dessas lesões no desenvolvimento cerebral.
- Ele serve como um modelo pré-clínico para condições como paralisia cerebral e acidentes vasculares cerebrais neonatais.
- Identificar a artéria carótida correta pode ser desafiador para iniciantes na técnica.
Objetivo do Estudo
- Estabelecer um modelo confiável em camundongo para estudar lesões cerebrais neonatais por isquemia-hipóxia.
- Avaliar os efeitos da isquemia-hipóxia sobre as funções motoras e cognitivas em camundongos.
- Fornecer subsídios para possíveis abordagens terapêuticas em lesões cerebrais neonatais.
Métodos Utilizados
- Cirurgia de oclusão unilateral da artéria carótida em filhotes de camundongo.
- Avaliação das funções neurocomportamentais após a cirurgia.
- Comparação entre camundongos operados e controles não operados.
- Colaboração com estudantes de pós-graduação para demonstração dos procedimentos.
Resultados Principais
- Estabelecimento de um modelo de IH neonatal em camundongos CD-1.
- Identificação de diferenças significativas nas funções neurocomportamentais.
- Compreensão dos efeitos da IH no desenvolvimento motor e cognitivo.
- Validação do modelo para pesquisas futuras sobre lesões cerebrais neonatais.
Conclusões
- A oclusão unilateral da artéria carótida é um método eficaz para modelar a hipóxia-isquemia neonatal.
- Este modelo pode facilitar pesquisas adicionais sobre estratégias terapêuticas.
- Compreender os desfechos neurocomportamentais é essencial para abordar lesões cerebrais neonatais.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este modelo murino neonatal de hipóxia-isquemia fornece um sistema pré-clínico para avaliar déficits motores e cognitivos relevantes para a paralisia cerebral e o acidente vascular cerebral neonatal. Avaliações comportamentais permitem a redução de riscos mecanicistas de candidatos terapêuticos ao associar lesão do hemisfério direito a desfechos funcionais. O modelo apoia a validação de alvos e o desenvolvimento de ensaios na pesquisa de doenças neurodegenerativas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas relacionadas à disfunção motora hemiplégica e ao comprometimento cognitivo.
- Valor Operacional: Oferece um sistema relevante à doença para a validação funcional de alvos em vias de lesão cerebral neonatal.
- Valor Preditivo: Reforça a confiança preditiva ao correlacionar a gravidade da lesão cortical com os resultados dos testes motores e cognitivos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Gera saídas neurocomportamentais padronizadas (latência na evitação passiva, contagem de escorregões na escada, força de preensão) para triagem de compostos.
- Medição Quantitativa: Fornece pontos finais reprodutíveis e quantificáveis adequados para análise comportamental de alto rendimento.
- Relevância para Triagem: Prepara sistemas biológicos validados para avaliação subsequente de agentes neuroprotetores ou neurorestauradores.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para a Doença: Modela condições humanas de HI neonatal, como paralisia cerebral e acidente vascular cerebral neonatal, com validade aparente em déficits motores.
- Continuidade Tradutiva: Conecta a descoberta à validação pré-clínica por meio de fenotipagem cognitiva e motora alinhada às observações clínicas.
- Decisões Ajustadas ao Risco: Orienta critérios de avançar/não avançar ao quantificar a gravidade da lesão por meio de fenótipos comportamentais correlacionados com ressonância magnética.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O modelo se insere no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a avaliação pré-clínica de eficácia, permitindo a avaliação longitudinal da recuperação neurocomportamental.
- Biologia da Descoberta: Apoia a clarificação de vias e a desmistificação biológica de alvos envolvidos nas cascatas hipóxico-isquêmicas.
- Triagem: Fornece fenótipos prontos para ensaio com leituras padronizadas de funções motoras e cognitivas para avaliação de compostos.
- Análises: Oferece medidas quantitativas de variáveis dependentes (latência, frequência de escorregões, força de preensão) para comparação entre grupos e cálculo do tamanho do efeito.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica por meio da estratificação de lesões validada por ressonância magnética e monitoramento comportamental longitudinal.
- Reutilização Corporativa: Funciona como uma plataforma reutilizável para triagem de múltiplas modalidades terapêuticas em programas de lesões neurodegenerativas e do desenvolvimento.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao associar a ligadura carotídea unilateral a déficits funcionais específicos do hemisfério.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio de protocolos cirúrgicos e comportamentais padronizados entre laboratórios.
- Valor Estratégico: Melhora decisões de avanço ou interrupção ao fornecer sinais preditivos precoces de eficácia motora e cognitiva.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos com base na recuperação comportamental em coortes com lesões equivalentes.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em cirurgia de roedores neonatos e ligadura microcirúrgica de vasos.
- Depende de equipamento de câmara hipóxica e regulação precisa de gás para indução consistente da lesão.
- Necessita de testes comportamentais cegos para evitar viés do observador na contagem de escorregões e na medição da latência.
- Requer adaptação do equipamento comportamental ao tamanho e à capacidade motora de camundongos com seis semanas de idade.
- Limitado pela variabilidade na penetrância da lesão, exigindo ressonância magnética pós-operatória ou triagem morfológica para estratificação da coorte.
