Citometria de Fluxo de Imagem Microfluídica por Microscopia Óptica de Tempo-estiramento com detecção assimétrica (ATOM)

O objetivo geral deste protocolo é preparar e usar um sistema de microscopia óptica de estiramento de tempo de detecção assimétrica para imagens de célula única de alto contraste sem marcação em fluxo microfluídico ultrarrápido. A principal vantagem do ATOM é que ele permite a captura de imagens ultrarrápidas com taxas de varredura de linha de até dezenas de megahertz, ao mesmo tempo em que aprimora o contraste da imagem nas células não rotuladas. O ATOM permite uma análise morfológica complexa de estruturas celulares e subcelulares com ensaios baseados em células não centralizadas em até 100.000 células por segundo, o que não é possível com a citometria de fluxo padrão.

para começar a configurar o sistema, use um colimador de fibra para acoplar um femto de banda larga ou pico segundo próximo ao laser pulsado IR a uma fibra óptica dispersiva de modo único conectada a um amplificador óptico. Ilumine uma classificação de difração de transmissão com o laser para produzir um chuveiro espectral. Oriente o nivelamento próximo à configuração do littrow para maximizar a eficiência da difração.

Configure um conjunto de lente de relé telescópico em um sistema de imagem 4f para direcionar o chuveiro espectral para o plano focal traseiro de uma lente objetiva abaixo de uma plataforma de amostra. Certifique-se de que o chuveiro espectral preencha a abertura traseira da lente objetiva. Coloque outra lente objetiva com um espelho plano em sua abertura traseira acima da plataforma de amostra.

Ajuste as lentes objetivas até que seus planos focais se sobreponham. Verifique se o chuveiro espectral passa pelo plano da imagem e segue o mesmo caminho de volta para a gradação. Coloque um chip microfluídico na plataforma de amostra e certifique-se de que o chuveiro espectral caia sobre o canal microfluídico.

Redirecione a luz retornada com um divisor de feixe depois que ela passar pela gradação. Separe a luz retornada em dois feixes com outro divisor de feixe. Use colimadores de fibra para acoplar os feixes a fibras monomodo de diferentes comprimentos para introduzir um atraso de tempo entre os feixes.

Conecte as fibras a um osciloscópio em tempo real por meio de um acoplador de fibra e um fotodetector. Ajuste o ganho do amplificador óptico até que a relação sinal-ruído do sinal óptico seja maior que 10 decibéis. Em seguida, bloqueie aproximadamente metade de cada viga retornada com blocos de viga de ponta de faca.

Ajuste os blocos de feixe até que a potência óptica medida em cada fibra seja cerca de metade da potência antes do bloco. Verifique se a largura de banda do osciloscópio e a taxa de amostragem são altas o suficiente para não influenciar a resolução da imagem. Para iniciar o experimento, dilua as amostras de células entre 10 e 10 e 6 por mililitro com solução salina tamponada com fosfato ou água de nascente.

Em seguida, coloque a solução celular em uma seringa de 10 mililitros. Conecte a seringa à entrada do canal microfluídico. Direcione a saída do canal microfluídico para um tubo de centrífuga.

Prenda a seringa em uma bomba de seringa e ajuste a vazão adequadamente para a largura do canal. Escolha o número de pontos de dados a serem salvos para o experimento. Em seguida, adquira e salve os dados do sinal óptico.

Digitalize e exporte os dados do osciloscópio para um computador. Processe os dados em imagens 2D e extraia uma biblioteca de parâmetros das imagens. Importe as imagens na biblioteca de parâmetros para um programa de visualização.

Atribua um parâmetro de interesse a cada eixo e selecione o conjunto de dados a ser exibido como um gráfico de dispersão. Verifique as imagens de células associadas a cada grupo no gráfico para identificar tendências. Use o gating manual ou exiba conjuntos de dados adicionais para análise adicional, conforme necessário.

O ATOM foi usado para adquirir imagens de células únicas de alto contraste de células humanas e fitoplâncton. Estruturas celulares características, como vacúolos, pirenóides e flagelos, são visíveis nas imagens do fitoplâncton. Parâmetros como tamanho e circularidade da célula foram determinados a partir das imagens ATOM para classificar as células para análise citométrica.

Os resultados da classificação podem ser exibidos como gráficos de dispersão 2D. Aqui, o volume versus circularidade foi plotado para um MCF7 mostrado em amarelo e PBMC mostrado em vermelho. Dois clusters foram observados para MCF7.

Ao identificar as imagens de alto contraste correspondentes a pontos de dados individuais, descobriu-se que o cluster inferior correspondia a fragmentos de células e detritos. Uma vez dominado, o sistema de imagem pode ser configurado em duas a três horas se for executado corretamente. Os procedimentos de imagem podem ser feitos em uma hora.

Não se esqueça de prestar atenção especial à segurança dos olhos ao trabalhar com a fonte de laser e o alinhamento do feixe de laser. Precauções como o uso de óculos de segurança devem sempre ser tomadas durante a execução desses procedimentos. Ao tentar este procedimento, lembre-se de monitorar o alinhamento do feixe óptico durante todo o processo de configuração do sistema de imagem para garantir a qualidade ideal da imagem.

Embora essa técnica possa fornecer informações sobre a detecção e quantificação de células raras ou aparentes durante o processo da doença, ela também pode ser aplicada à classificação do tipo de célula, em populações de células grandes e heterogêneas. Essa técnica é particularmente vantajosa quando se procura superar a limitação de rendimento da citometria de imagem, preservando a qualidade da imagem. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento de como implementar o ATOM desde a configuração do sistema até os procedimentos de imagem.