Um método de isolamento do romance grau clínico para rim humano Perivascular de células do estroma

O objetivo geral deste método de isolamento em grau clínico é isolar células estromais perivasculares renais humanas, ou kPSC, para o tratamento terapêutico celular de diversas doenças renais. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da medicina regenerativa, como a adequação das kPSCs humanas para terapia celular em doenças renais e transplante. As principais vantagens desta técnica são seu caráter clínico e a possibilidade de gerar um número suficiente de kPSCs para fins de terapia celular.

Ellen Lievers, uma técnica em nosso laboratório, demonstrará o teste funcional de kPSCs. Antes de iniciar o procedimento de isolamento de células renais, conecte uma bandeja de perfusão esterilizada a um banho-maria na posição vertical. Quando a bandeja de perfusão estiver aquecida pela água, mude-a para a posição horizontal, mantendo-a ainda conectada ao banho-maria, e então coloque um tubo L/S 25 na bomba.

Coloque a pinça de cultura em uma extremidade do tubo e deixe o tubo apoiado no fundo da bandeja. Coloque gaze estéril sobre o tubo para evitar obstrução e fixe um conector luer na outra extremidade do tubo; em seguida, adicione aproximadamente 100 mililitros de meio à bandeja e comece a lavar o tubo L/S 25 com uma velocidade de bomba de 100 mililitros por minuto. Para isolar as células renais, transfira o rim dos sacos estéreis duplos para a bandeja de perfusão estéril e use tesoura e rasgo suave para remover o tecido adiposo perirrenal e a cápsula renal.

Após localizar a artéria renal no retalho aórtico, use o pino acessório para canular a artéria renal e fixe o pino com um prendedor esterilizado. Com a bomba ligada, conecte a extremidade do tubo da bomba ao conector luer. Em seguida, lave o rim com o meio presente na bandeja a uma taxa de fluxo de 100 mililitros por minuto.

A seguir, adicione 20 mililitros de colagenase e 2,5 mililitros de DNAse à bandeja de perfusão e deixe as enzimas digerirem o rim, virando suavemente o órgão de tempos em tempos com a mão até que fique macio e o líquido de perfusão comece a ficar opaco. A duração da digestão com colagenase é crítica; tempo insuficiente levará a agregados celulares, enquanto tempo excessivo causará morte celular. Ao final da perfusão enzimática, massageie suavemente o rim até obter uma suspensão celular e remova o material não digerido e o pico.

Adicione 50 mililitros de soro humano normal à suspensão celular e, com a bomba em baixa taxa de fluxo, posicione o tubo conectado ao rim acima de vários tubos de coleta de 50 mililitros para permitir que a suspensão celular drene da bandeja de perfusão para os tubos de coleta. Quando todas as células tiverem sido coletadas, centrifugue as suspensões celulares e lave os pellets duas vezes com meio de lavagem, suplementado com 10% de soro humano normal. Após a segunda lavagem, reconstitua os pellets em um volume igual de meio de cultura celular ao volume dos pellets celulares.

Para cultivar as células renais brutas, adicione aproximadamente um mililitro de suspensão celular a 24 mililitros de meio de cultura celular alfa-MEM com lisado de plaquetas a 5% por frasco de cultura celular T 175 e incube os frascos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após dois dias, remova o sobrenadante e os detritos celulares e alimente as células com 25 mililitros de meio de cultura celular fresco. Quando as células estiverem confluentes, isole a fração positiva para NG2 por separação celular magnética, de acordo com protocolos padrão.

Em seguida, semeie quatro vezes 10 à terceira células positivas para NG2 por centímetro quadrado em um frasco de cultura celular de tamanho apropriado e coloque o frasco na incubadora de cultura celular. Quando as células atingirem confluência de 90 a 100%, colete o sobrenadante e lave as células aderentes duas vezes com PBS. Desprenda as células com o volume apropriado de tripsina de acordo com o tamanho do frasco, interrompendo a reação com o sobrenadante reservado após cinco minutos.

Resuspenda suavemente as células, transfira a suspensão celular para um tubo cônico de tamanho apropriado para centrifugação e replante as células numa densidade de quatro vezes 10 à terceira células por centímetro quadrado. Às vezes, após o enriquecimento de NG2, as células param de proliferar ou começam a crescer em estruturas tridimensionais. Isso pode ser resolvido por meio da tripsinização das células e seu replateamento.

Após quatro a cinco passagens, semeie os kPSCs em uma placa de seis poços com duas vezes 10 à quinta células por dois mililitros de meio por poço, e semeie cinco vezes 10 à quinta células epiteliais tubulares proximais em dois mililitros de meio para células epiteliais tubulares proximais por poço em uma placa de seis poços separada. Coloque ambas as placas na incubadora de cultivo celular por 48 horas, coletando o sobrenadante das células kPSC ao final da incubação, em seguida remova o sobrenadante das células epiteliais tubulares proximais e use uma ponteira amarela para fazer um arranhão na monocamada celular no fundo de cada poço. Lave as células arranhadas com PBS e adicione o meio condicionado proveniente dos cultivos de células estromais vasculares renais.

Em seguida, capture imagens do arranhão aos quatro, oito, 12 e 24 horas na mesma posição marcada em um microscópio invertido de campo claro para avaliar a porcentagem de fechamento ao longo do tempo. As células estromais perivasculares renais são células aderentes ao plástico, com formato fusiforme, que são positivas para marcadores de células estromais e perivasculares, e negativas para os marcadores CD31, CD34, CD45 e HLA-DR. Normalmente, uma população homogênea de células estromais perivasculares renais pode ser obtida na quarta passagem, com as células atingindo senescência por volta da nona a décima passagem.

Neste ensaio representativo de arranhão em ferida, para avaliar a capacidade funcional dos kPSCs, quando o meio condicionado de uma cultura de células estromais perivasculares renais foi adicionado, o fechamento da ferida ocorreu significativamente mais rápido do que nos poços cultivados com o meio controle. Uma vez dominada, a técnica de isolamento primário levará cerca de duas horas, sendo necessário de um a dois meses para gerar uma população homogênea de kPSCs. Ao realizar este procedimento, é importante interromper o tratamento com colagenase assim que o rim ficar macio e os fluidos se tornarem menos transparentes.

Além dos procedimentos demonstrados aqui, essas técnicas também podem ser utilizadas para o isolamento de células estromais perivasculares de outros órgãos sólidos. As cPSCs isoladas com esta técnica podem ser usadas para estudar o potencial regenerativo dessas células em diversos modelos de doenças renais e de transplante. Após assistir a este vídeo, você deverá ser capaz de isolar e cultivar cPSCs de maneira compatível com padrões clínicos.

Não se esqueça de que trabalhar com material humano apresenta risco de transmissão de vírus; sempre tome precauções, como testar para HIV, hepatite B e hepatite C ao realizar este procedimento.