Indução de diferenciação celular e imagens de células Vibrio parahaemolyticus Células Swimmer e Swarmer

O objetivo geral deste método é induzir a diferenciação celular da bactéria Vibrio parahaemolyticus e a formação de uma população de células de enxame diferenciadas facilmente disponíveis para análise de célula única por microscopia de fluorescência. Este método ajudará os cientistas a entender como as bactérias regulam a organização intracelular durante a diferenciação celular e a morfogênese. Como a imagem de células dentro de comunidades bacterianas pode ser um desafio, a principal vantagem dessa técnica é que ela produz uma população de células de enxame diferenciadas que existem em uma única camada de células prontamente disponíveis para análise de microscopia de célula única.

As implicações dessa técnica se estendem para uma melhor compreensão de como as bactérias regulam as mudanças no ciclo celular, na morfologia celular e na organização intracelular durante a diferenciação celular. A demonstração deste método é crítica, pois a indução confiável da diferenciação celular e a formação de células disponíveis para análise de célula única são difíceis de alcançar. Para preparar a solução de ágar para fazer placas de enxame, suspenda quatro gramas de infusão de coração, ou pó de H.I.agar e 100 mililitros de água bidestilada

Ferva cuidadosamente a solução de H.I.agar em um forno de micro-ondas, agitando o frasco de vez em quando até que o pó se dissolva. Autoclave a solução de ágar a 121 graus Celsius por 20 minutos, resfrie a solução de ágar a 60 t0 65 graus Celsius com agitação constante. O próximo passo envolve o manuseio de 2,2'Bipyridyl, que é altamente tóxico, portanto, luvas e óculos de segurança devem ser usados.

Adicionar 2,2'Bipiridil a uma concentração final de 50 micromolares. Adicione cloreto de cálcio a uma concentração final de quatro millamolar. Inocule uma pequena quantidade de células de V. parahaemolyticus da borda de uma única colônia em 5 mililitros de caldo LB.

Incubar a cultura a 37 graus Celsius em uma incubadora agitadora até atingir uma densidade óptica de 600 nanômetros de 0,8. Isso geralmente leva cerca de duas a três horas. Enquanto a cultura de células está crescendo, pipete 30 a 35 mililitros da solução final de H.I.agar em uma placa de Petri redonda de 150 milímetros e deixe o ágar solidificar.

Imediatamente antes de detectar a cultura de células, seque a placa de ágar na vertical com a tampa aberta a 37 graus Celsius por pelo menos 10 minutos ou até que quaisquer resíduos líquidos tenham desaparecido, mas não mais. Localize um microlitro de cultura de células no centro da placa de enxame de H.I.agar e deixe o local secar. Sele a placa com fita plástica transparente, tomando cuidado para evitar a formação de bolhas de ar e dobras na fita.

Incube a placa a 24 graus Celsius durante a noite. Isso resultará na formação de uma colônia de enxame V.Parahaemolyticus com chamas de enxame que se estendem do centro da colônia, como mostrado neste videoclipe de lapso de tempo. O primeiro passo neste procedimento é preparar lâminas de agarose para microscopia.

Adicione um grama de agarose a 100 mililitros de uma solução de caldo de 20% PBS e 10% LB. Ferva cuidadosamente a solução no micro-ondas para dissolver a agarose e deixe esfriar até 65 a 70 graus Celsius enquanto mistura com uma barra de agitação magnética. Coloque uma lâmina de microscópio limpa em uma seção perfeitamente nivelada de uma bancada de trabalho.

Fixe a lâmina na bancada cobrindo ambas as extremidades da lâmina com duas camadas de fita adesiva de laboratório de uso geral. A distância entre os dois pedaços de fita deve ser de cerca de três centímetros. Pipete cerca de 250 microlitros da solução de agarose previamente preparada sobre a superfície de vidro não coberta.

Coloque uma segunda lâmina de microscópio na mesma orientação da lâmina inferior na parte superior e pressione levemente para baixo para que a agarose residual possa fluir para os lados. Deixe a agarose solidificar por um a dois minutos. Use um bisturi para cortar qualquer agarose residual presa às laterais da lâmina do microscópio.

Quando a agarose solidificar, puxe lentamente a lâmina de vidro superior para fora da inferior em um movimento horizontal. Remova lentamente a fita das extremidades da lâmina do microscópio. A lâmina de agarose deve ser usada o mais rápido possível, pois começará a secar lentamente.

Imediatamente antes da transferência das células do enxame para a lâmina do microscópio, use um bisturi para cortar a fita plástica da placa do enxame previamente preparada. Durante a excisão do ágar enxame, é importante direcionar o corte de fora para dentro da colônia de enxame para evitar contaminar as chamas de enxame com células que se originam do meio da colônia. Use um bisturi novo para cortar um pedaço de ágar de três milímetros por 10 milímetros da borda mais externa de uma colônia de enxame, certificando-se de direcionar os cortes de fora da borda da colônia de enxame para o interior da colônia.

Transfira o pedaço de ágar enxame para a lâmina de agarose do microscópio com as células voltadas para a almofada de agarose para imprimir as células de enxame na almofada de agarose. Depois de esperar cerca de 30 segundos, remova o pedaço de ágar cuidadosamente da almofada de agarose. Coloque uma lamínula de vidro na almofada de agarose onde as células foram impressas.

As células agora estão prontas para microscopia de fluorescência. Imagens de microscopia estéreo de uma colônia de enxames de V. parahaemolyticus em ampliação crescente mostram erupções de enxame que se estendem da periferia da colônia de enxames. As células nas explosões são agrupadas apenas em mono ou bicamadas, enquanto as células no meio da colônia de enxame são empilhadas em várias camadas.

A imagem de microscopia DIC revelou que as erupções consistem apenas em uma população totalmente diferenciada de células de enxame, enquanto as células do meio da colônia de enxame são significativamente mais curtas e provavelmente representam uma mistura de células nadadoras e de enxame. Como prova de princípio, a imagem de microscopia de fluorescência e DIC foi realizada em células nadadoras e enxameadoras de V.Parahaemolyticus do tipo selvagem, expressando ectopicamente uma proteína essencial da quimiotaxia, YFP-CheW. Nas células nadadoras, o YFP-CheW localiza-se de maneira unipolar e bipolar, mas nas células do enxame, o YFP-CheW é sempre localizado bipolarmente e também forma aglomerados posicionados aleatoriamente ao longo do comprimento da célula.

Mudanças no padrão de localização de YFP-CheW durante a diferenciação de células nadadoras para enxameadores também foram demonstradas por exibições de distribuição de focos e análises demográficas de perfis de intensidade de fluorescência. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia celular microbiana explorarem como a bactéria Vibrio parahaemolyticus regula sua organização interna durante seus distintos estados diferenciados de células nadadoras e enxameadoras. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como induzir a diferenciação celular da bactéria Vibrio parahaemolyticus e como preparar uma população de células de enxame diferenciadas para análise de célula única por microscopia de fluorescência.

Não se esqueça de que o Vibrio parahaemolyticus é um patógeno humano e procedimentos e regulamentos adequados sobre como lidar com patógenos BSL 2 em sua região devem ser aplicados.