Exame ecocardiográfico e histológico da morfologia cardíaca no Mouse

O objetivo geral deste exame ecocardiográfico combinado com investigações histológicas é examinar a função e morfologia cardíaca em diferentes modelos de camundongos transgênicos sob condições basais e fisiopatológicas. Para começar, enquanto segura levemente um rato pela cauda, use uma balança de laboratório padrão para determinar o peso corporal do animal. Depois de anestesiar o mouse de acordo com o protocolo de texto, aperte levemente o pé traseiro e observe se a perna se retrai.

Use um barbeador comercial para roedores para raspar o lado esquerdo do tórax e a axila esquerda. Posicione o animal em uma almofada quente ajustada a 40 a 42 graus Celsius em uma posição rasa do lado esquerdo, com a cabeça às 12 horas e a cauda às 6 horas. Em seguida, use fita adesiva para fixar o braço esquerdo, a perna esquerda e a cauda.

Aplique gel de ecocardiografia pré-aquecido no tórax raspado e na cabeça do transdutor. Em seguida, coloque o transdutor ecocardiográfico paraesternal esquerdo, direcionando-o para o lado direito do pescoço para obter uma visão bidimensional de acesso paraesternal longo ao nível do músculo papilar. Em seguida, gire o transdutor 90 graus no sentido horário para obter um acesso curto view.

Estabeleça uma configuração de profundidade mínima e um zoom para maximizar a qualidade da imagem e a taxa de quadros. Defina a velocidade de varredura para o máximo. Grave imagens guiadas em modo M 2D em visualização de acesso curto.

Registre pelo menos três séries de três semiloops de batimentos cardíacos para cada animal. Depois de obter gravações bem-sucedidas, remova a fita dos membros e da cauda. Limpe o gel de ecocardiograma da almofada de aquecimento do tórax do camundongo e do transdutor.

Deixe o mouse sob observação na almofada de aquecimento, coberta com lenço de papel para evitar exposição desnecessária à luz e perda de calor até que ele acorde. Em seguida, coloque o animal de volta na gaiola. Analise imagens gravadas no modo M a partir de uma visualização de acesso curto para determinar as dimensões e a função do ventrículo esquerdo ou do VE.

Usando a identificação da interface sangüínea tecidual nas imagens armazenadas, medir a espessura da parede anterior do VE na sístole e diástole, os diâmetros sistólico e diastólico final interno do VE e a espessura da parede posterior do VE na sístole e diástole. Meça as dimensões diastólicas no momento das dimensões diastólicas máximas aparentes do VE e as dimensões sistólicas finais do VE no final da excursão sistólica mais anterior da parede posterior do VE. Toque na tela sensível ao toque no ícone de análise e, em seguida, no ícone LVAWd.

Posicione o paquímetro eletrônico na interface entre a cavidade ventricular direita e a parede anterior do VE na diástole. Em seguida, posicione o paquímetro eletrônico na interface entre a parede anterior do VE e a cavidade do VE para obter a espessura da parede anterior diastólica do VE. Posicione o paquímetro na interface entre a cavidade do VE e a parede posterior do VE para obter o diâmetro interno e diastólico do VE.

Posicione o paquímetro na interface entre a parede posterior do VE e o pericárdio para obter a espessura da parede posterior diastólica do VE. Para dimensões sistólicas do VE, toque na tela sensível ao toque no ícone da VCVE e posicione o paquímetro eletrônico na interface entre a cavidade ventricular direita e a parede anterior do VE na sístole. Posicione o paquímetro eletrônico na interface entre a parede anterior do VE e a cavidade do VE para obter a espessura da parede anterior sistólica do VE.

Posicione o paquímetro na interface entre a cavidade do VE e a parede posterior do VE para obter o diâmetro interno e sistólico do VE. Posicione o paquímetro na interface entre a parede posterior do VE e o pericárdio para obter a espessura da parede posterior sistólica do VE. Após o sacrifício dos animais de acordo com o protocolo de texto, medir seus pesos corporais.

Em seguida, use um cotonete com álcool 70% para desinfetar o tórax e o abdômen. Faça uma incisão transversal na pele, um centímetro distal ao esterno. Em seguida, usando uma pinça romba, remova a pele do tórax movendo-se na direção da cabeça.

Com uma pinça fina, segure o esterno levemente e abra o diafragma inserindo a ponta romba de uma tesoura fina. Corte a caixa torácica em ambos os lados paralelamente ao esterno. Em seguida, mova o esterno na direção da cabeça.

Localize o coração no tórax. Com uma pinça fina, segure o tronco vascular do coração e use uma tesoura fina para cortar abaixo do órgão. Em seguida, meça o peso do coração e estabeleça uma relação entre o peso do coração e o corpo.

Transfira o coração para dois mililitros de solução de formalina tamponada a 10% neutra em um tubo de 15 mililitros e fixe o órgão a quatro graus Celsius durante a noite. Para realizar a coloração de aglutinina de gérmen de trigo ou WGA, coloque as lâminas previamente preparadas em WGA conjugado com tetrametilrodamina e incube as amostras em temperatura ambiente em uma câmara úmida por sessenta minutos. Use PBS para lavar as amostras três vezes por cinco minutos cada.

Em seguida, use o meio de montagem de fluorescência DAPI contido para montar as seções. Armazene-os a quatro graus Celsius no escuro antes da análise. Esses registros ecocardiográficos representativos demonstram a utilidade da ecocardiografia para identificar fenótipos cardíacos em camundongos geneticamente modificados.

A diferença entre um camundongo com função cardíaca normal e um animal com ventrículo esquerdo dilatado ou VE e função reduzida do VE pode ser facilmente identificada. Aqui é mostrada uma comparação das medidas do diâmetro dos cardiomiócitos em animais sem e com hipertrofia cardíaca usando cortes cardíacos de parafina corados com H&E e medidas de cortes longitudinais do tecido cardíaco. Esta figura ilustra a medição dos diâmetros transversais dos cardiomiócitos usando cortes de parafina corados com WGA de corações de camundongos controle e animais com hipertrofia cardíaca.

Esses painéis retratam a utilidade da imuno-histoquímica PECAM1 de seções cardíacas para determinar a densidade dos vasos do tecido cardíaco normal e corações com angiogênese aumentada.