Tuning na banda Theta do hipocampo In Vitro: Metodologias para gravação a partir do Circuito de Septohippocampal de Roedores Isolado

O objetivo geral deste protocolo é apresentar procedimentos para extrair toda a preparação hipocampal e explorar a geração de rede neuronal rítmica usando gravações de campo, unitárias e patch-clamp, bem como estimulação optogenética. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurociência da aprendizagem e da memória, facilitando muito o estudo dos mecanismos celulares e sinápticos subjacentes às oscilações rítmicas no hipocampo. A principal vantagem dessa técnica é que ela usa uma preparação otimizada para investigar os circuitos em oscilações detalhadas, que desempenham um papel crucial nas informações da memória dependente do hipocampo.

Para iniciar este procedimento, coloque o cérebro na placa de dissecção na posição vertical, remova o cerebelo com uma lâmina de barbear, corte o cérebro ao meio ao longo do plano sagital médio e retorne os dois hemisférios isolados à câmara de retenção. Em seguida, coloque o único cérebro hemisseccionado na posição vertical na placa de dissecação. Gire o prato até que as estruturas sagitais médias estejam voltadas para o experimentador e o contorno embutido do complexo septal seja visível como uma fina camada de tecido em forma de pêra no interior do tálamo.

Em seguida, insira uma espátula revestida sob o septo e mova a ponta para baixo até atingir a placa de dissecação, corte as fibras que conectam a área septal cordialmente. Agora, repita a mesma operação ao longo da borda anterior do septo e corte as fibras que se conectam à parte frontal do cérebro. Com a espátula segurando levemente a parte interna do córtex logo acima do hipocampo na posição vertical, use a microespátula para puxar cuidadosamente para baixo os núcleos talâmico, hipotalâmico e restante do tronco cerebral.

Em seguida, use a espátula para cortar e remover o tecido retirado. Em seguida, insira a espátula revestida no ventrículo lateral sob a extremidade rostral do hipocampo dorsal. Segure a espátula horizontalmente, alinhada com o plano sagital médio do cérebro hemisseccionado e deslize-a pelo contorno suave das paredes ventriculares, até que a ponta emerja cordialmente.

Segure a espátula sob o hipocampo e pressione-a levemente nas fibras de conexão ao longo da camada interna onde o hipocampo se une ao córtex sobrejacente e, em seguida, aplique a microespátula no lado externo dessa camada e pressione-a contra a espátula revestida para cortar as fibras de conexão. Para completar a extração, gire a placa de dissecção e insira a espátula revestida sob o hipocampo ventral. Segure levemente o hipocampo com a espátula e corte as conexões endócrinas usando um movimento de corte contra a espátula.

Quando o isolamento estiver completo, mantenha o hipocampo apoiado no prato e adicione uma gota de solução de sacarose gelada para mantê-lo fresco. Corte cuidadosamente qualquer córtex e fibras restantes e separe o hipocampo do septo, aplicando suavemente uma lâmina de barbear no fórnix. Depois disso, transfira a preparação para solução de sacarose em temperatura ambiente e deixe-a recuperar por 15 a 30 minutos antes de transferir para a câmara de registro.

Nesta etapa, configure o sistema de perfusão alimentado por gravidade para permitir alta velocidade contínua no fluxo de ACSF oxigenado. Em seguida, interrompa o fluxo de ACSF e transfira o hipocampo para a câmara de registro, usando a extremidade larga de uma pipeta de vidro. Deixe a preparação saturada de sacarose afundar e assentar no fundo.

Coloque a preparação no centro da câmara de registro, com a superfície lisa de CA1 e subículo por cima. Estabilize o hipocampo com pequenos pesos das extremidades septais e temporais e reinicie o fluxo de ACSF. Neste procedimento, abaixe o eletrodo LFP até a superfície do hipocampo.

Avance o eletrodo LFP através da camada de parâmetros e observe o aumento na atividade de pico extracelular à medida que a descarga de uma única unidade de neurônios individuais é detectada. Abaixe ainda mais o eletrodo e observe que o pico começa a desaparecer novamente à medida que a ponta cruza o radiatom. Observe que uma oscilação de rede claramente visível na faixa de frequência torna-se aparente e atinge a amplitude máxima à medida que o local de gravação é abaixado através do radiátomo.

Para testar as propriedades espaciais das oscilações espontâneas na região CA1, coloque um segundo eletrodo LFP em um local CA1 e observe que as oscilações CA1 são sincronizadas em grandes distâncias. Para testar as propriedades das oscilações nas camadas do hipocampo, deixe um eletrodo LFP de referência em um local de radiatom CA1. Começando logo acima do estrato oriens, abaixe um segundo eletrodo na camada de células do parâmetro e através do radiatom.

Observe uma inversão gradual do sinal LFP na camada de parâmetros. Para testar as oscilações gama e o acoplamento gama no hipocampo intacto, coloque um eletrodo de campo na borda do subículo CA1 e abaixe-o até que fique na interface entre o parâmetro e as camadas moleculares. Nesse nível, um potencial de campo exibindo oscilações gama claras com mudanças na amplitude dessa fase bloqueada para o ritmo local pode ser registrado.

Em seguida, ajuste a escala para observar a escala de tempo lenta do acoplamento gama. Observe que as rajadas gama ocorrem em duas bandas de frequência distintas que podem ser reveladas por banda durante o sinal LFP em andamento, na faixa gama lenta e rápida. Para gravação de grampo de patch de célula inteira durante oscilações do hipocampo in vitro, use microscopia de vídeo de fluorescência com ampliação de baixa e alta potência para visualizar interneurônios tdTomato positivos localizados perto da superfície de uma preparação de hipocampo de um camundongo PV tom.

Sob visão de baixa ampliação do hipocampo, coloque um eletrodo LFP no subículo CA1 para monitorar as oscilações enquanto se prepara para experimentos de patch clamp. Em seguida, mude para a ampliação de 40x e mergulhe a objetiva sobre a região de destino. Abaixe-o até que as camadas superiores se tornem visíveis, sob a microscopia de fluorescência, selecione a célula fluorescente PV tom e aproxime-se com uma pipeta de remendo preenchida com solução intercelular padrão.

Uma vez na configuração de toda a célula, examine as propriedades fisiológicas da célula PV identificada durante as oscilações espontâneas do hipocampo. Observe o registro do potencial de membrana intercelular das células PV que são caracterizadas pelo comportamento de pico rápido e rajadas de potenciais de ação sincronizados com o ritmo do subículo CA1 em andamento. Neste procedimento, coloque um eletrodo LFP na área do subículo CA1 e remende uma célula de parâmetro próxima no hipocampo isolado de um camundongo, expressando a opcina excitatória sensível à luz azul, CHR2 em interneurônios PV.

Coloque um guia de luz de fibra óptica acima da preparação do hipocampo e centralize-o na região gravada. Use luz azul de uma fonte de LED para estimulação genética óptica, que consiste em pulsos de luz de 10 a 20 milissegundos ou comandos de tensão de onda senoidal entregues em frequências. Na pinça de corrente, caracterize a atividade da célula registrada durante oscilações espontâneas.

Em seguida, inicie o protocolo de estimulação e registre as respostas à luz. Observe que as oscilações de campo e a atividade sináptica e o neurônio registrado tornam-se cada vez mais sincronizados durante a estimulação optogenética e que o ritmo rítmico das células PV resulta em um controle robusto da frequência e da potência das oscilações. Aqui é mostrada a atividade eletrofisiológica registrada a partir de uma célula de parâmetro durante as oscilações.

Os traços de pinça atuais mostram disparos espontâneos, mas não rítmicos, em repouso e potenciais pós-sinápticos inibitórios que não estavam claramente sincronizados com a oscilação LFP que emerge lentamente. Os registros de grampo de tensão mostram que as correntes pós-sinápticas inibitórias correspondentes têm o potencial de reversão em torno de 70 milivolts negativos. E aqui está a atividade eletrofisiológica registrada de um interneurônio PV fluorescente de pico rápido durante as oscilações.

No grampo de corrente, esta célula estava disparando espontaneamente em repouso e era fortemente impulsionada por potenciais pós-sinápticos excitatórios rítmicos que foram bloqueados em fases com a oscilação estável do LFP. Nos registros de pinça de tensão, o potencial de reversão de corrente pós-sináptica excitatória estava aproximadamente em zero milivolts. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em duas a três horas, ao tentar este procedimento, é importante lembrar de oxigenar uma solução vigorosamente e usar um sistema de perfusão que permita um fluxo de alta velocidade, mas constante, de ACSF armado sobre a preparação durante os registros eletrofisiológicos.

Após este procedimento, outros métodos, como estimulação optogenética ou silenciamento de populações de tipos celulares específicos, podem ser usados para responder a perguntas adicionais, como identificar os subtipos celulares que formam osciladores no hipocampo. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da neurociência explorarem sistematicamente a dinâmica das oscilações no eixo temporal septal do hipocampo in vitro. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como extrair toda uma preparação do hipocampo para explorar a função das redes neuronais rítmicas usando gravações de grampo de campo, unidade e patch, bem como estimulação optogenética.