Name: Tuning na banda Theta do hipocampo In Vitro: Metodologias para gravação a partir do Circuito de Septohippocampal de Roedores Isolado (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Aprenda a extrair o hipocampo de roedores para gravar oscilações theta in vitro usando técnicas de patch-clamp e estimulação optogenética. Este método avança o estudo dos circuitos neurais envolvidos na memória.

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Este trabalho foi apoiado pelos Institutos canadenses de Pesquisa em Saúde e Ciências Naturais.

<ol><li>Buzsaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theta+rhythm+of+navigation%3A+link+between+path+integration+and+landmark+navigation%2C+episodic+and+semantic+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Theta rhythm of navigation: link between path integration and landmark navigation, episodic and semantic memory.</a> Hippocampus. 15 (7), 827-840 (2005).</li>
<li>Sanders, H., Renno-Costa, C., Idiart, M., Lisman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grid+Cells+and+Place+Cells%3A+An+Integrated+View+of+their+Navigational+and+Memory+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Grid Cells and Place Cells: An Integrated View of their Navigational and Memory Function.</a> Trends Neurosci. 38 (12), 763-775 (2015).</li>
<li>O'Keefe, J., Recce, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+relationship+between+hippocampal+place+units+and+the+EEG+theta+rhythm%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Phase relationship between hippocampal place units and the EEG theta rhythm.</a> Hippocampus. 3 (3), 317-330 (1993).</li>
<li>Winson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+hippocampal+theta+rhythm+results+in+spatial+memory+deficit+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Loss of hippocampal theta rhythm results in spatial memory deficit in the rat.</a> Science. 201 (4351), 160-163 (1978).</li>
<li>M'Harzi, M., Jarrard, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategy+selection+in+a+task+with+spatial+and+nonspatial+components%3A+effects+of+fimbria-fornix+lesions+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Neural+Biol%22%5BJournal%5D)">Strategy selection in a task with spatial and nonspatial components: effects of fimbria-fornix lesions in rats.</a> Behav Neural Biol. 58 (3), 171-179 (1992).</li>
<li>Osipova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theta+and+gamma+oscillations+predict+encoding+and+retrieval+of+declarative+memory%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Theta and gamma oscillations predict encoding and retrieval of declarative memory.</a> J Neurosci. 26 (28), 7523-7531 (2006).</li>
<li>Stumpf, C., Petsche, H., Gogolak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+significance+of+the+rabbit%27s+septum+as+a+relay+station+between+the+midbrain+and+the+hippocampus.+II.+The+differential+influence+of+drugs+upon+both+the+septal+cell+firing+pattern+and+the+hippocampus+theta+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Electroencephalogr+Clin+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">The significance of the rabbit's septum as a relay station between the midbrain and the hippocampus. II. The differential influence of drugs upon both the septal cell firing pattern and the hippocampus theta activity.</a> Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 14, 212-219 (1962).</li>
<li>Mitchell, S. J., Ranck, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+theta+rhythm+in+medial+entorhinal+cortex+of+freely+moving+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Generation of theta rhythm in medial entorhinal cortex of freely moving rats.</a> Brain Res. 189 (1), 49-66 (1980).</li>
<li>Alonso, A., Garcia-Austt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+sources+of+theta+rhythm+in+the+entorhinal+cortex+of+the+rat.+I.+Laminar+distribution+of+theta+field+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Neuronal sources of theta rhythm in the entorhinal cortex of the rat. I. Laminar distribution of theta field potentials.</a> Exp Brain Res. 67 (3), 493-501 (1987).</li>
<li>Vertes, R. P., Kocsis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brainstem-diencephalo-septohippocampal+systems+controlling+the+theta+rhythm+of+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Brainstem-diencephalo-septohippocampal systems controlling the theta rhythm of the hippocampus.</a> Neuroscience. 81 (4), 893-926 (1997).</li>
<li>Bland, B. H., Colom, L. V., Konopacki, J., Roth, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+records+of+carbachol-induced+theta+rhythm+in+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Intracellular records of carbachol-induced theta rhythm in hippocampal slices.</a> Brain Res. 447 (2), 364-368 (1988).</li>
<li>Cobb, S. R., Buhl, E. H., Halasy, K., Paulsen, O., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronization+of+neuronal+activity+in+hippocampus+by+individual+GABAergic+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synchronization of neuronal activity in hippocampus by individual GABAergic interneurons.</a> Nature. 378 (6552), 75-78 (1995).</li>
<li>Williams, J. H., Kauer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+carbachol-induced+oscillatory+activity+in+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Properties of carbachol-induced oscillatory activity in rat hippocampus.</a> J Neurophysiol. 78 (5), 2631-2640 (1997).</li>
<li>Chapman, C. A., Lacaille, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+induction+of+theta-frequency+oscillations+in+hippocampal+inhibitory+interneurons+and+pacing+of+pyramidal+cell+firing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cholinergic induction of theta-frequency oscillations in hippocampal inhibitory interneurons and pacing of pyramidal cell firing.</a> J Neurosci. 19 (19), 8637-8645 (1999).</li>
<li>Strata, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+oscillations+in+CA3+hippocampal+pyramids%3A+physiological+relevance+to+theta+rhythm+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Intrinsic oscillations in CA3 hippocampal pyramids: physiological relevance to theta rhythm generation.</a> Hippocampus. 8 (6), 666-679 (1998).</li>
<li>Kocsis, B., Bragin, A., Buzsaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interdependence+of+multiple+theta+generators+in+the+hippocampus%3A+a+partial+coherence+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Interdependence of multiple theta generators in the hippocampus: a partial coherence analysis.</a> J Neurosci. 19 (14), 6200-6212 (1999).</li>
<li>Fellous, J. M., Sejnowski, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+induction+of+oscillations+in+the+hippocampal+slice+in+the+slow+%280.5-2+Hz%29%2C+theta+%285-12+Hz%29%2C+and+gamma+%2835-70+Hz%29+bands%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Cholinergic induction of oscillations in the hippocampal slice in the slow (0.5-2 Hz), theta (5-12 Hz), and gamma (35-70 Hz) bands.</a> Hippocampus. 10 (2), 187-197 (2000).</li>
<li>Gillies, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+atropine-resistant+theta+oscillations+in+rat+hippocampal+area+CA1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">A model of atropine-resistant theta oscillations in rat hippocampal area CA1.</a> J Physiol. 543 (Pt 3), 779-793 (2002).</li>
<li>Gloveli, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthogonal+arrangement+of+rhythm-generating+microcircuits+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Orthogonal arrangement of rhythm-generating microcircuits in the hippocampus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13295-13300 (2005).</li>
<li>Konopacki, J., Eckersdorf, B., Kowalczyk, T., Golebiewski, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Firing+cell+repertoire+during+carbachol-induced+theta+rhythm+in+rat+hippocampal+formation+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Firing cell repertoire during carbachol-induced theta rhythm in rat hippocampal formation slices.</a> Eur J Neurosci. 23 (7), 1811-1818 (2006).</li>
<li>Hajos, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintaining+network+activity+in+submerged+hippocampal+slices%3A+importance+of+oxygen+supply%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply.</a> Eur J Neurosci. 29 (2), 319-327 (2009).</li>
<li>Manseau, F., Goutagny, R., Danik, M., Williams, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hippocamposeptal+pathway+generates+rhythmic+firing+of+GABAergic+neurons+in+the+medial+septum+and+diagonal+bands%3A+an+investigation+using+a+complete+septohippocampal+preparation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The hippocamposeptal pathway generates rhythmic firing of GABAergic neurons in the medial septum and diagonal bands: an investigation using a complete septohippocampal preparation in vitro.</a> J Neurosci. 28 (15), 4096-4107 (2008).</li>
<li>Goutagny, R., Jackson, J., Williams, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-generated+theta+oscillations+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Self-generated theta oscillations in the hippocampus.</a> Nat Neurosci. 12 (12), 1491-1493 (2009).</li>
<li>Jackson, J., Goutagny, R., Williams, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+slow+gamma+rhythms+are+intrinsically+and+independently+generated+in+the+subiculum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fast and slow gamma rhythms are intrinsically and independently generated in the subiculum.</a> J Neurosci. 31 (34), 12104-12117 (2011).</li>
<li>Amilhon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parvalbumin+Interneurons+of+Hippocampus+Tune+Population+Activity+at+Theta+Frequency%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Parvalbumin Interneurons of Hippocampus Tune Population Activity at Theta Frequency.</a> Neuron. 86 (5), 1277-1289 (2015).</li>
<li>Huh, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitatory+Inputs+Determine+Phase-Locking+Strength+and+Spike-Timing+of+CA1+Stratum+Oriens%2FAlveus+Parvalbumin+and+Somatostatin+Interneurons+during+Intrinsically+Generated+Hippocampal+Theta+Rhythm%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Excitatory Inputs Determine Phase-Locking Strength and Spike-Timing of CA1 Stratum Oriens/Alveus Parvalbumin and Somatostatin Interneurons during Intrinsically Generated Hippocampal Theta Rhythm.</a> J Neurosci. 36 (25), 6605-6622 (2016).</li>
<li>Gu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA-dependent+phase+synchronization+between+septal+and+temporal+CA3+hippocampal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">NMDA-dependent phase synchronization between septal and temporal CA3 hippocampal networks.</a> J Neurosci. 33 (19), 8276-8287 (2013).</li>
<li>Jackson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+theta+rhythm+flow+through+intact+hippocampal+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reversal of theta rhythm flow through intact hippocampal circuits.</a> Nat Neurosci. 17 (10), 1362-1370 (2014).</li>
<li>Gonzalez-Burgos, G., Lewis, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+neurons+and+the+mechanisms+of+network+oscillations%3A+implications+for+understanding+cortical+dysfunction+in+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Schizophr+Bull%22%5BJournal%5D)">GABA neurons and the mechanisms of network oscillations: implications for understanding cortical dysfunction in schizophrenia.</a> Schizophr Bull. 34 (5), 944-961 (2008).</li>
</ol>

Os autores declaram que não há interesses comerciais ou financeiros concorrentes.

Embora as gravações eletrofisiológicas de fatias agudas do hipocampo constituam uma técnica in vitro padrão, os métodos aqui apresentados diferem substancialmente da abordagem clássica. Ao contrário das preparações finas em fatias onde as camadas celulares específicas são visíveis na superfície e podem ser examinadas diretamente, as preparações intactas do hipocampo são mais parecidas com as configurações in vivo onde os eletrodos são abaixados em regiões cerebrais direcionadas enquanto atravessam cama...

As oscilações do hipocampo (4 - 12 Hz) estão entre as formas mais predominantes de atividade rítmica no cérebro de mamíferos e acreditam desempenhar papéis fundamentais nas funções cognitivas, como o processamento da informação espaciotemporal e a formação de memórias episódicas 1 , 2 , 3 . Enquanto vários estudos in vivo que realçam a relação das células do quadrado modificadas com estudos espaciais de navegação e lesão, além de evidências clínicas, sustentam a visão de que as oscilações do theta do hipocampo estão envolvidas na formação da memória 4 , 5 , 6 , os mecanismos associados Com a geração das oscilações do theta do hipocampo ainda não são totalmente compreendidas. As primeiras investigações in vivo sugeriram que a atividade theta dependia principalmente de osciladores extrínsecos, em particular a entrada rítmicaA partir de estruturas cerebrais aferentes, como o septo e o córtex entorrinal 7 , 8 , 9 , 10 . Um papel para fatores intrínsecos - conectividade interna das redes neurais do hipocampo juntamente com as propriedades dos neurônios do hipocampo - também foi postulado com base em observações in vitro 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . No entanto, além de alguns estudos históricos 19 , 20 , 21 , dificuldades no desenvolvimento de abordagens que poderiam replicar atividades de população fisiologicamente realistas em simples preparações de fatia in vitroS têm, durante muito tempo, um exame experimental mais detalhado das habilidades intrínsecas do hipocampo e áreas relacionadas para auto-gerar oscilações theta. Uma desvantagem importante da configuração experimental padrão de fatias finas in vitro é que a organização celular e sináptica 3D das estruturas cerebrais geralmente está comprometida. Isso significa que muitas formas de atividades de rede concertada baseadas em conjuntos de células espacialmente distribuídos, que vão desde grupos localizados (≤ 1 mm de raio) até populações de neurônios espalhados por uma ou mais áreas cerebrais (&gt; 1 mm), não podem ser suportadas. Diante dessas considerações, era necessário um tipo diferente de abordagem para estudar como as oscilações theta emergem no hipocampo e se propagam para estruturas de saída corticais e subcorticais relacionadas. Nos últimos anos, o desenvolvimento inicial da preparação &quot;septo-hipocampo completo&quot; para examinar a interação bidirecionalAs citações das duas estruturas 22 e a evolução subseqüente da preparação do &quot;hipocampo isolado&quot; revelaram que as oscilações teta intrínsecas ocorrem espontaneamente no hipocampo que não possui entrada rítmica externa 23 . O valor dessas abordagens reside na visão inicial de que toda a estrutura funcional dessas regiões teve que ser preservada para funcionar como um gerador de ritmo theta in vitro 22 .

<table><tbody><tr><td><forte>Reagentes</forte>Cloreto de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4 - fosfato de sódio monobásico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glicose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio di-hidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbato de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7631-25G</td><td></td></tr><tr><td>Nome </td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de dissecação padrão</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-951-25</td><td>extração cerebral</td></tr><tr><td>Bisturi Punho #4, 14 cm</td><td>WPI</td><td>500237</td><td>extração cerebral</td></tr><tr><td>Filtro pinça, mandíbulas planas, retas (11 cm)</td><td>WPI</td><td>500456</td><td>extração de cérebro</td></tr><tr><td>Lâminas de bisturi de aço inoxidável Paragon #20</td><td>Ultident</td><td>02-90010-20</td><td>extração de cérebro</td></tr><tr><td>Tesoura de dissecação curva de ponta fina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>extração de</td><td>cérebro</td>711999</tr><tr><td>Espátula fina revestida de teflon (PTFE) VWR</td><td></td><td>82027-534</td><td>preparação</td></tr> <tr><td>para o hipocampoEspátula Hayman Style Microspatula</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-401-25A</td><td>preparação para hipocampo</td></tr><tr><td>Colher de laboratório</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-375-20</td><td>preparação para hipocampo</td></tr><tr><td>Vidro borossilicato Pasteur Pipetas</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td>preparação para hipocampo</td></tr><tr><td>Droper</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>preparação para hipocampo</td></tr><tr><td>Lâminas de barbear Lâmina de barbear</td><td>VWR</td><td>55411-055</td><td>preparação do hipocampo</td></tr><tr><td>Papel para lentes (4 x 6")</td><td>VWR</td><td>52846-001</td><td>preparação do hipocampo</td></tr><tr><td>Placas de Petri de vidro (100 x 20 mm)</td><td>VWR</td><td>25354-080</td><td>preparação do hipocampo</td></tr><tr><td>Bandeja de plástico para gelo; tamanho 30 x 20 x 5 cm</td><td>n.a.n.a.preparação</td><td></td> <td>do hipocampo</td></tr><tr><td>Aquecedor de solução única em linha</td><td>Warner Instruments</td><td>Sistema de perfusão SH-27B</td><td></td></tr><tr><td>Pedras de ar de aquário para borbulhar</td><td>sistema de perfusão n.a.n.a.sistema</td><td></td> de <td>perfusão</td></tr><tr><td>Tubulação Tygon E-3603 (ID 1/16 OD 1/8)</td><td>Fisherbrand</td><td>14-171-129</td><td>sistema de perfusão</td></tr><tr><td>Frigideira elétrica</td><td>Preto & Sistema de</td> <td>perfusão</td><td>Decker n.a.</td></tr> <tr><td>95% O2/5% CO2 mistura gasosa (carbogênio)&nbsp;</td>Sistema <td>de</td><td>perfusão</td>SG466204A <td>Vitalaire</td></tr><tr><td>Garrafas/frascos de vidro (4 x 1 L)</td><td>n.a.n.a.sistema</td><td></td> de <td>perfusão</td></tr><tr><td>Gravação submersa Desenho personalizado da câmara</td><td>(FM)</td><td>n.a.Alternativa</td> <td>comercial pode ser utilizada</td></tr><tr><td>Pipetas de vidro (1,5/0,84 OD/ID (mm)) WPI</td><td></td> <td>1B150F-4</td><td>electrofisiologia</td></tr><tr><td>Hum Bug 50/60 Hz Eliminador de ruído</td><td>Quest Scientific</td><td>Eletrofisiologia</td> <td>Q-Humbug</td></tr><tr><td>Amplificador patch-clamp Multiclamp 700B</td><td>Dispositivos</td><td>moleculares Eletrofisiologia</td><td>MULTICLAMP</td></tr><tr><td>Programa Multiclamp 700B Commander</td><td>Dispositivos moleculares</td><td>Eletrofisiologia MULTICLAMP</td><td></td></tr><tr><td>Conversor digital/analógico</td><td>Dispositivos moleculares</td><td>Eletrofisiologia DDI440</td><td></td></tr><tr><td>PCLAMP10</td><td>Dispositivos</td> <td>molecularesPCLAMP10</td><td>eletrofisiologia</td></tr><tr><td>Mesa de isolamento de vibrações&nbsp;</td><td>Newport</td><td>n.a.eletrofisiologia</td><td></td></tr> <tr><td>Micromanipuladores (operados manualmente</td><td>) Siskiyou&nbsp;</td><td>Eletrofisiologia MX130</td><td>(LFP)</td></tr><tr><td>Micromanipuladores (automatizados)</td><td>Siskiyou&nbsp;</td><td>Eletrofisiologia MC1000e</td><td>(patch)</td></tr><tr><td>Monitor de áudio&nbsp;</td><td>Sistemas A-M Modelo</td><td>3300</td><td>eletrofisiologia</td></tr><tr><td>Micropipeta/Patch extrator de pipetas</td><td>Sutter</td><td>P-97</td><td>eletrofisiologia</td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência vertical personalizado</td><td>Siskiyou</td><td>n.a.Imaging</td><td></td></tr> <tr><td>Câmera de vídeo analógica</td><td>COHU</td><td>4912-2000/0000</td><td>Imagem</td></tr><tr><td>Capturador de quadros digital com software de imagem</td><td>EPIX, Inc</td><td>PIXCI-SV7</td><td>Objetiva de imagem</td></tr><tr><td>Olympus 2.5X</td><td>Olympus</td><td>MPLFLN</td><td>Objetiva de</td></tr><tr><td>imersão em água Olympus</td><td></td><td>UIS2 LUMPLFLN</td><td>Imaging</td></tr> Sistema <tr><td>de diodo emissor de luz (LED) feito sob medida&nbsp;</td><td>estimulação</td><td></td> <td>optogenética personalizada (Amhilon et al., 2015)</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Animais</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PV::Camundongos Cre (KI)</td> Número <td>de estoque do</td> <td>Jackson Laboratory</td> 008069 <td>Permitir&nbsp; Expressão gênica dirigida por Cre em interneurônios PV</td></tr><tr><td>Camundongos Ai9 condicionais constitutivos (R26-lox-stop-lox-tdTomato (KI))Número</td> <td>de estoque do</td> <td>Jackson Laboratory</td> 007905 <td>Express TdTomato após recombinação mediada por Cre</td></tr><tr><td>Camundongos Ai32 (R26-lox-stop-lox-ChR2 (H134R)-EYFP</td><td>Jackson</td><td>Laboratory stock número 012569</td><td>Expresse a proteína de fusão de channelrhodopsin-2/EYFP aprimorada após exposição a Cre camundongos recombinase</td></tr><tr><td>PVChY</td><td>Criação domiciliar</td><td>n.a.Descendentes</td> <td>obtidos do cruzamento da linhagem PV-Cre com camundongos Ai32 (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP</td></tr></tbody></table>

tuning na banda theta do hipocampo<em&gt; in vitro</em&gt;: metodologias para gravação a partir do circuito de septohippocampal de roedores isolado

Tuning in the Hippocampal Theta Band In Vitro: Methodologies for Recording from the Isolated Rodent Septohippocampal Circuit

Este protocolo descreve os procedimentos para a preparação e gravação do hipocampo inteiro isolado, de WT e camundongos transgênicos, além de melhorias recentes em metodologias e aplicações para o estudo das oscilações theta. Uma caracterização simples da preparação isolada do hipocampo é apresentada pelo qual a relação entre os osciladores internamente da teta do hipocampo é examinada em conjunto com a atividade das células piramidais e interneurônios GABAérgicos, nas áreas cornu ammonis-1 (CA1) e subículo (SUB). No geral, mostramos que o hipocampo isolado é capaz de gerar oscilações theta intrínsecas in vitro e que a ritmicidade gerada no hipocampo pode ser manipulada com precisão pela estimulação optogenética de interneurônios com parvalbumina positiva (PV). A preparação de hipocampo isolado in vitro oferece uma oportunidade única de usar gravações simultâneas de grampos e grampos intracelulares de neu visualmente identificadoRons para entender melhor os mecanismos subjacentes à geração de ritmo theta.

<html> Esta seção ilustra exemplos de resultados que podem ser obtidos estudando oscilações theta na preparação de hipocampo isolado no mouse in vitro . O procedimento de dissecção para extração do hipocampo isolado está ilustrado na Figura 1 . Usando esta preparação, as oscilações teta intrínsecas podem ser examinadas durante a colocação de eletrodos de campo múltiplos, registrando atividade geral e entradas sinápticas sincronizadas para populações ...

Aqui, apresentamos um protocolo para a gravação da teta de rede neuronal rítmica e das oscilações gama de uma preparação isolada do hipocampo inteiro. Descrevemos os passos experimentais da extração do hipocampo para detalhes de gravações de grampos de campo, unidade e toda célula, bem como a estimulação optogenética do ritmo de theta.

Tuning na banda Theta do hipocampo<em&gt; In Vitro</em&gt;: Metodologias para gravação a partir do Circuito de Septohippocampal de Roedores Isolado

This protocol outlines the procedures for preparing and recording from the isolated whole hippocampus, of WT and transgenic mice, along with recent ...

O objetivo geral deste protocolo é apresentar procedimentos para extrair o preparado completo do hipocampo e explorar a geração de redes neurais rítmicas utilizando gravações de campo, unitárias e por patch-clamp, bem como estimulação optogenética. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de neurociência do aprendizado e da memória, facilitando grandemente o estudo dos mecanismos celulares e sinápticos que sustentam as oscilações rítmicas no hipocampo. A principal vantagem desta técnica é que utiliza um preparado otimizado para investigar em detalhes os circuitos envolvidos nas oscilações, que desempenham um papel crucial na informação da memória dependente do hipocampo.Para iniciar este procedimento, posicione o cérebro sobre a bandeja de dissecação em posição vertical, remova o cerebelo com uma lâmina de barbear e, em seguida, corte o cérebro ao meio ao longo do plano sagital médio, devolvendo as duas hemisférios isolados à câmara de armazenamento. Em seguida, posicione o cérebro hemissectomizado em posição vertical sobre a bandeja de dissecação. Gire a bandeja até que as estruturas sagitais médias estejam voltadas para o pesquisador e o contorno embutido do complexo septal seja visível como uma camada fina com formato de pêra, localizada internamente ao tálamo.Em seguida, insira uma espátula revestida sob o septo e mova a ponta para baixo até alcançar o recipiente de dissecação, cortando as fibras que conectam a área septal cordialmente. Agora, repita a mesma operação ao longo da borda anterior do septo e corte as fibras que se ligam à parte frontal do cérebro. Com a espátula segurando levemente a parte interna da córtex logo acima do hipocampo em posição ereta, use a microespátula para puxar cuidadosamente para baixo os núcleos talâmicos, hipotalâmicos e o restante dos núcleos do tronco encefálico.Posteriormente, use a espátula para cortar e remover o tecido afastado. Em seguida, insira a espátula revestida no ventrículo lateral sob a extremidade rostral do hipocampo dorsal. Mantenha a espátula na posição horizontal, alinhada com o plano médio-sagital do cérebro hemissecionado, e deslize-a ao longo do contorno suave das paredes ventriculares até que a ponta emerja cordialmente.Segure a espátula sob o hipocampo e pressione-a levemente contra as fibras de conexão na camada interna onde o hipocampo se une à córtex sobrejacente. Em seguida, aplique a microespátula no lado externo dessa camada e pressione-a contra a espátula revestida para cortar as fibras de conexão. Para concluir a extração, gire o recipiente de dissecação e insira a espátula revestida sob o hipocampo ventral. Segure suavemente o hipocampo com a espátula e corte as conexões endocrinas utilizando um movimento de corte contra a espátula.Após a conclusão do isolamento, mantenha o hipocampo repousando sobre a placa e adicione uma gota de solução de sacarose gelada para mantê-lo resfriado. Cuidadosamente, remova qualquer córtex e fibras remanescentes e separe o hipocampo do septo aplicando suavemente uma lâmina de barbear ao fórnice. Em seguida, transfira o preparo para uma solução de sacarose em temperatura ambiente e deixe-o recuperar por 15 a 30 minutos antes de transferi-lo para a câmara de registro.Nesta etapa, monte o sistema de perfusão por gravidade para permitir o fluxo contínuo e rápido de ACSF oxigenado. Em seguida, interrompa o fluxo de ACSF e transfira o hipocampo para a câmara de registro, utilizando a extremidade larga de uma pipeta de vidro. Deixe o preparo saturado com sacarose afundar e acomodar-se no fundo.Coloque o preparado no centro da câmara de gravação, com a superfície lisa do CA1 e do subículo voltada para cima. Estabilize o hipocampo com pequenos pesos nas extremidades septal e temporal e reinicie o fluxo de ACSF. Neste procedimento, abaixe o eletrodo de potencial de campo local até a superfície do hipocampo.Avance o eletrodo de potencial de campo local através da camada parâmetro e observe o aumento na atividade de disparos extracelulares à medida que são detectados os disparos de unidade única de neurônios individuais. Abaixe ainda mais o eletrodo e observe que os disparos começam a desvanecer novamente quando a ponta atravessa a região radiata. Observe que uma oscilação de rede claramente visível na faixa de frequência teta se torna aparente e atinge amplitude máxima enquanto a posição de gravação é abaixada através da radiata.Para testar as propriedades espaciais das oscilações theta espontâneas ao longo da região CA1, posicione um segundo eletrodo de potencial de campo local (LFP) em um local da CA1 e observe que as oscilações theta da CA1 se sincronizam ao longo de grandes distâncias. Para testar as propriedades das oscilações theta ao longo das camadas hipocampais, mantenha um eletrodo de referência de LFP em um local do stratum radiatum da CA1. Começando logo acima do stratum oriens, abaixe um segundo eletrodo através da camada de células piramidais e pelo stratum radiatum.Observe uma inversão gradual do sinal de potencial de campo local na camada paramétrica. Para testar as oscilações gama e o acoplamento entre teta e gama no hipocampo intacto, posicione um eletrodo de campo na borda entre CA1 e subículo e abaixe-o até que fique situado na interface entre as camadas paramétrica e molecular. Nesse nível, pode-se registrar um potencial de campo que exibe oscilações gama claras com alterações na amplitude que estão travadas em fase com o ritmo teta local.Em seguida, ajuste a escala para observar a escala temporal lenta do acoplamento theta-gama. Observe que as rajadas de gama ocorrem em duas bandas de frequência distintas, que podem ser reveladas por banda durante o sinal contínuo de potencial de campo local (LFP), nas faixas de gama lenta e rápida. Para o registro com microeletrodo de célula inteira durante oscilações theta hipocampais in vitro, utilize microscopia de vídeo com fluorescência e ampliação de baixa e alta potência para visualizar interneurônios positivos para tdTomato localizados próximo à superfície de uma preparação hipocampal de um camundongo PV tom.Sob a visão em baixa ampliação do hipocampo, posicione um eletrodo de potencial de campo local na subícula CA1 para monitorar oscilações teta durante o preparo para experimentos de patch clamp. Em seguida, mude para ampliação de 40x e imerja a objetiva sobre a região-alvo. Abaixe-a até que as camadas superiores se tornem visíveis; sob microscopia de fluorescência, selecione a célula PV tom fluorescente e aproxime-se com uma pipeta de patch preenchida com solução intracelular padrão.Uma vez na configuração de célula inteira, examine as propriedades fisiológicas da célula PV identificada durante oscilações hipocampais espontâneas. Observe a gravação do potencial da membrana intracelular proveniente de células PV, caracterizadas por comportamento de disparo rápido e rajadas de potenciais de ação sincronizados com o ritmo teta em curso no subículo CA1. Neste procedimento, posicione um eletrodo de potencial de campo local (LFP) na região do subículo CA1 e realize o registro em uma célula paramétrica próxima no hipocampo isolado de um camundongo, expressando a opsina excitatória sensível à luz azul, CHR2, em interneurônios PV.Posicione uma guia de luz de fibra óptica acima do preparado hipocampal e centralize-a na região gravada. Utilize luz azul proveniente de uma fonte de LED para estimulação optogenética, que consiste em pulsos de luz de 10 a 20 milissegundos ou comandos de tensão em onda senoidal entregues em frequências teta. No regime de fixação de corrente, caracterize a atividade da célula gravada durante oscilações teta espontâneas.Em seguida, inicie o protocolo de estimulação e registre as respostas à luz. Observe que as oscilações de campo e a atividade sináptica e o neurônio registrado tornam-se cada vez mais sincronizados durante a estimulação optogenética e que o ritmo rítmico das células PV resulta em um controle robusto da frequência e da potência das oscilações theta. Mostrada aqui está a atividade eletrofisiológica registrada de uma célula parâmetro durante oscilações theta.Os traçados em condição de corrente constante mostram disparos espontâneos, mas não rítmicos, em repouso e potenciais pós-sinápticos inibitórios que não estavam claramente sincronizados com a oscilação lentamente emergente do potencial de campo local. Gravações em condição de tensão constante mostram que as correntes pós-sinápticas inibitórias correspondentes possuem potencial de reversão em torno de menos 70 milivolts. E aqui, está a atividade eletrofisiológica registrada de um interneurônio fluorescente PV de disparo rápido durante oscilações theta.No modo de fixação de corrente, esta célula apresentava disparos espontâneos em repouso e era fortemente ativada por potenciais pós-sinápticos excitatórios rítmicos que estavam sincronizados com a oscilação estável do potencial de campo local. Em gravações no modo de fixação de tensão, o potencial de inversão da corrente pós-sináptica excitatória era aproximadamente zero milivolts. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em duas a três horas; ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de oxigenar vigorosamente a solução e utilizar um sistema de perfusão que permita um fluxo rápido, porém constante, de ACSF enriquecido sobre o preparado durante as gravações eletrofisiológicas.Após este procedimento, outros métodos, como estimulação ou silenciamento por optogenética de populações específicas de células, podem ser utilizados para responder perguntas adicionais, como identificar os subtipos celulares que formam osciladores teta no hipocampo. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de neurociência explorarem sistematicamente a dinâmica das oscilações teta ao longo do eixo septotemporal do hipocampo in vitro. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como extrair um preparado completo do hipocampo com o objetivo de explorar a função de redes neuronais rítmicas por meio de gravações de campo, de unidades e de patch clamp, bem como por estimulação optogenética.

tuning-hippocampal-theta-band-vitro-methodologies-for-recording-from

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo demonstra um protocolo para modular as oscilações em um modelo de camundongo geneticamente modificado com canais iônicos sensíveis à luz em seus neurônios do septo medial GABAérgico. Ao fornecer pulsos de luz ao hipocampo, o protocolo visa sincronizar a atividade neuronal e gerar oscilações, que são registradas como potenciais de campo locais.

Manipulação seletiva de oscilações em um modelo de camundongo

Este vídeo demonstra um método para registrar as respostas sinápticas CA3-CA1 em uma fatia de hipocampo de rato. Ele descreve as etapas envolvidas na colocação dos eletrodos de estimulação e registro na fatia do hipocampo e na medição do potencial pós-sináptico excitatório de campo (fEPSP) para avaliar a força da resposta sináptica.

Registrando respostas sinápticas CA3-CA1 em uma fatia de hipocampo de rato

Este vídeo demonstra a implantação estereotáxica de um feixe de eletrodos de fio e uma fibra óptica no hipocampo de um modelo de camundongo.

Implantando um feixe de eletrodos e fibra óptica no hipocampo do camundongo

Este vídeo demonstra a gravação da atividade da rede neuronal rítmica, também conhecida como oscilações, em um hipocampo isolado. Os eletrodos são inseridos em várias camadas e posições espaciais para detectar e analisar as oscilações. Isso mostra as composições neuronais únicas e a conectividade da rede neuronal em diferentes camadas do hipocampo.

Registro in vitro de oscilações no hipocampo de camundongos

Este vídeo demonstra o método para usar a optogenética para modular a dinâmica da rede hipocampal, ativando interneurônios sensíveis à luz geneticamente modificados em uma fatia de cérebro de camundongo, aprimorando a sincronização da oscilação e estudando o comportamento do circuito neural.

Controle optogenético da dinâmica da rede hipocampal

A atividade no hipocampo está relacionada a estágios cognitivos e comportamentais específicos. Aqui, descrevemos um método analítico para detectar oscilações altamente organizadas dentro do hipocampo usando uma abordagem baseada em frequência de tempo (ou seja, análise wavelet).

Detecção automática de altamente organizada Oscilações Theta no Murino EEG

Nós descrevemos o uso de optogenetics e eletrofisiológicas gravações para manipulações seletivas das oscilações de theta hippocampal (5-10 Hz) no comportamento de ratos. A eficácia do arrastamento ritmo é monitorada utilizando o potencial do campo local. Uma combinação de opto - e inibição farmacogenética aborda a leitura eferente de sincronização hippocampal.

Optogenetic de arrastamento de Theta Hippocampal oscilações em comportar-se ratos

Ilustramos como executar gravação e elétrica de modulação da atividade epileptiforme 4-aminopiridina-induzida em fatias de cérebro de roedor usando matrizes de microeletrodos. Uma câmara de gravação personalizada mantém a viabilidade do tecido durante prolongadas sessões experimentais. Viver o mapeamento de eletrodo e seleção de pares estimulantes são executadas por uma interface de usuário gráfica personalizada.

Gravação e modulação da atividade epileptiforme em fatias de cérebro de roedor acoplado para matrizes de microeletrodos

Este protocolo descreve a gravação dos potenciais de campo local com haste multi sondas de silicone linear. Conversão de sinais usando análise de densidade atual fonte permite a reconstrução do local atividade elétrica no hipocampo do mouse. Com esta técnica, oscilações espacialmente restrita do cérebro podem ser estudadas em ratos movimentando-se livremente.

Gravação espacialmente restrita oscilações no hipocampo de ratos de comportar-se

Utilizamos eletrodos de gravação e estimulação em fatias de cérebro hipocampal longitudinal e eletrodos de gravação e estimulação longitudinalmente posicionados no hipocampo dorsal in vivo para evocar potenciais pós-sinápticos extracelulares e demonstrar plasticidade sináptica de longo prazo ao longo do CA1 interlamelar longitudinal.

Investigando a plasticidade sináptica de longo prazo no hipocampo interlamelar CA1 por gravação de campo eletrofisiológico

Este protocolo descreve o uso de um dispositivo de gravação personalizado e eletrodos para registrar potenciais de campo locais e investigar o fluxo de informações no hipocampo e no córtex pré-frontal do camundongo.

Gravações extracelulares duplas no hipocampo de camundongos e córtex pré-frontal

Aprenda a extrair o hipocampo de roedores para gravar oscilações theta in vitro usando técnicas de patch-clamp e estimulação optogenética. Este método avança o estudo dos circuitos neurais envolvidos na memória.

Tuning na banda Theta do hipocampo In Vitro: Metodologias para gravação a partir do Circuito de Septohippocampal de Roedores Isolado (Vídeo) | JoVE Journal

Tuning na banda Theta do hipocampo

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