Quimio-enzimático síntese de N- os glicanos para desenvolvimento de matriz e anticorpos de HIV de criação de perfil
5 de fevereiro de 2018
Uma abordagem modular para a síntese de N- os glicanos para fixação a um vidro revestido de óxido de alumínio slide (slide ACG) como desenvolveu um microarray glicano e demonstrou-se seu uso para a criação de perfil de um HIV amplamente neutralizando anticorpos.
O objetivo geral desta metodologia é desenvolver uma abordagem quimioenzimática modular para a síntese de N-glicanos, construindo um novo microarranjo de glicanos em uma lâmina de vidro revestida de óxido de alumínio para detectar a ligação de heteroglicanos de anticorpos contra o HIV. Esses métodos podem ajudar a responder a questões-chave em glicobiologia para identificação de glicanos específicos de vírus celulares para muito desenvolvimento. A principal vantagem desse método é detectar uma ligação fraca e identificar uma mistura de açúcares que se ligam a uma proteína, como o anticorpo de um paciente com HIV.
As implicações desta técnica se estendem a um diagnóstico de infecções por influenza porque o catabolista siálico expresso nas células epiteliais das vias aéreas humanas e os problemas são comuns enquanto os sintomas. Portanto, o glycoarray será uma ferramenta ideal para determinar a especificidade dos subtipos selvagens. Embora este método possa fornecer especificidades de glicano dos anticorpos contra o HIV, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como o diagnóstico de vários tipos de câncer com base no padrão de ligação de anticorpos séricos humanos a antígenos séricos humanos específicos impressos na superfície.
Para iniciar este procedimento, adicione 2-5 micromoles de glicano previamente preparado e um frasco de fundo redondo de cinco mililitros. Adicione uma barra de agitação magnética ao frasco e tampe-o com um septo de borracha. Adicione 400 microlitros de DMF recém-seco e 10-25 micromoles do ligante de ácido fosfônico ao frasco.
Em seguida, agite a mistura de reação a 800 rpm por cinco horas. Quando a reação estiver concluída, evapore o solvente usando um evaporador rotativo a uma pressão de vácuo de cinco a 10 milibar e 40 graus Celsius. Em seguida, dissolva a mistura de reação seca e 0,5 mililitro de água e coloque em cima do leito de gel de poliacrilamida.
Eluir os produtos com água e recolher fracções de um a dois mililitros. Para verificar as frações coletadas por TLC, localize cada fração em uma placa TLC e mergulhe a placa em 0,25 molares de molibdato de cério e amônio. Aqueça a placa manchada com uma placa quente para visualizar o produto.
Depois de combinar o produto contendo frações e congelar a solução, biofolize para obter o produto desejado como um pó branco. Em seguida, dissolva o produto seco em dois mililitros de água e adicione hidróxido de paládio. Colocar um balão contendo hidrogénio no balão e agitar a mistura de reacção a 800 rpm durante 15 horas em atmosfera de hidrogénio.
Quando a reação estiver completa, filtre a mistura através de uma cama Celite e lave com dois mililitros de metanol e dois mililitros de água destilada deionizada. Em seguida, evapore o solvente usando um evaporador rotativo a 300 milibar de pressão de vácuo e 40 graus Celsius. Em seguida, dissolva a mistura crua em aproximadamente um mililitro de água e carregue-a em cima de uma camada de gel de poliacrilamida.
Eluir o produto com água e recolher fracções de um a dois mililitros. Depois de combinar o produto contendo frações e congelar a solução, biofolize para obter o produto desejado como um pó branco. Uma vez que o produto esteja seco, caracterize-o por enimar e espectroscopia de massa usando óxido de deutério como solvente.
Para anodização de superfície, defina uma incubadora com temperatura controlada para quatro graus Celsius. Em seguida, transferir uma solução aquosa de ácido oxálico 0,3 molar previamente preparada para um copo de 500 mililitros contendo uma barra de agitação magnética. Coloque uma haste de platina de 10 centímetros de comprimento como cátodo na solução.
Continue mexendo o ácido oxálico a 300 rpm durante todo o processo de anodização. No software rastreador de laboratório, clique no botão de configuração e, em seguida, clique na opção de função Sweep Voltage. Defina a tensão de partida e parada para 25.8 volts.
O número de pontos para 100, a conformidade para um e o atraso de varredura para 1200 milissegundos. Em seguida, clique em OK. Prenda uma corrediça de vidro revestida de alumínio voltada para o cátodo.
Clique no botão de teste de execução e observe a medição atual. Após a anodização da superfície, lave bem a lâmina de vidro com água destilada dupla e seque com gás nitrogênio. Armazene a lâmina de vidro em uma câmara de umidade relativa de 30% até uso posterior.
Para a fabricação, prepare soluções de 100 microlitros de todos os glicanos monovalentes em etanolglicol na concentração de 10 milimolares. Dilua as soluções de glicano com tampão de impressão para fazer 100 soluções micromolares. Para o Estudo de Heteroligantes, adicione cinco microlitros de glicano MAN-5 a cinco microlitros de cada solução de glicano.
Transfira os glicanos preparados para a microplaca de 384 poços para a etapa de impressão do microarray. Depois de inserir uma microplaca na tecnologia de matriz da impressora, imprima microarrays por pino robótico depositando 0,6 nanolitros das soluções de glicano em cada lâmina de vidro revestida de alumínio. Em seguida, prepare 70 microlitros de anticorpo primário PG-9 e tampão PTSB contendo 3% BSA.
Em seguida, prepare 120 microlitros de anticorpo fluorescente secundário de burro e tampão anti-imunoglobulina G e PBST anti-humana contendo 3% BSA no escuro. Misture PG9 e o anticorpo de marca fluorescente secundário na proporção de 1:1. Em seguida, incube os anticorpos pré-misturados por 30 minutos a quatro graus Celsius.
Após a incubação, carregue uma lâmina de vidro revestida de alumínio na câmara de incubação da lâmina, que é dividida em 16 poços. Transfira 100 microlitros dos anticorpos pré-misturados para a matriz de glicanos. Depois de incubar a quatro graus Celsius por 16 horas, remova os anticorpos pré-misturados da matriz de glicanos com uma pipeta e, em seguida, remova a câmara de incubação da lâmina.
Lave a lâmina de vidro em tampão PBST e água deionizada. Em seguida, seque a lâmina de vidro a 2000 vezes a gravidade. Em seguida, abra o software de análise de imagem de microarray.
Insira a lâmina seca de vidro no scanner de matriz com os recursos da matriz voltados para baixo. Clique no menu de configurações. Defina a resolução da imagem para cinco micrômetros por pixel.
E defina o comprimento de onda em 635 nanômetros com PMT 450 e potência para 100%Clique no botão de varredura para iniciar a imagem do slide. Por fim, clique no ícone do arquivo para salvar a imagem digitalizada no formato TIF para análise de imagem. Neste estudo, uma ampla gama de N-glicanos foi sintetizada usando uma estratégia quimioenzimática modular.
Para demonstrar a eficácia da estratégia, uma estrutura isométrica biantenária foi sintetizada por métodos quimioenzimáticos. A galactosilação enzimática para o dissacarídeo 1 seguida pela fucosilação do trissacarídeo 2 proporcionou o tetrassacarídeo 3 desejado. Por satilação e redução das modificações finais do bloco de construção dois e três, proporcionadas às moléculas desejadas quatro e cinco.
A estereosselação de três O-glicossalação do módulo quatro do trissacarídeo seis forneceu hexassacarídeo sete. A desproteção e a reação antes do módulo cinco produziram dedecasacchaídeo nove. A detecção global proporcionou o glicano 10, que foi caracterizado por enimar e espectroscopia de massa.
Os glicanos contendo uma cauda de pentililamina na extremidade redutora foram modificados com ligantes de ácido fosfônico e fixados à superfície revestida de vidro de alumínio por meio da química do fospirídeo. O anticorpo amplamente neutralizante do HIV-1 PG9 foi rastreado quanto à sua especificidade de glicanos usando matrizes homo e heteroglicanos para demonstrar pela primeira vez sua ineteração com heteroglicanos adjacentes na alça V1 / V2 da superfície do HIV1 PG120. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 24 horas, desde a imobilização do glicano até a análise beta, se for realizada corretamente.
Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar lâmina de vidro revestida de alumínio recém-anodizado para Glycan 10. Para colocar este procedimento estão os slides de técnicos médicos. A determinação da constante corporal pode ser realizada para quantificar as interações de ligação entre carboidratos e proteínas de interesse.
Após o desenvolvimento dessa técnica, ela abriu caminho para os pesquisadores entenderem melhor o papel do carboidrato nas doenças infecciosas no Quênia e ajudarem a desenvolver novas terapias contra doenças. Não se esqueça de que trabalhar com agentes tóxicos pode ser extremamente perigoso e precauções como o uso de roupas, óculos e máscaras devem sempre ser tomadas ao realizar experimentos.
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Visão Geral
Este estudo apresenta uma abordagem quimio-enzimática modular para sintetizar N-glicanos em lâminas de vidro revestidas com óxido de alumínio, facilitando aplicações de microarranjos de glicanos. A metodologia é demonstrada através do perfil de um anticorpo anti-HIV amplamente neutralizante, mostrando seu potencial em glicobiologia.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Glicobiologia
- Imunologia
- Tecnologia de microarranjo
Fundamentos
- N-glicanos desempenham um papel crucial nas interações célula-vírus.
- Compreender os padrões de ligação de glicanos pode auxiliar no diagnóstico de infecções virais.
- Métodos atuais podem não detectar efetivamente interações de ligação fracas.
- Microarranjos de glicanos podem fornecer insights sobre a especificidade de anticorpos.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um novo método para sintetizar N-glicanos.
- Criar um microarranjo de glicanos para detectar interações de anticorpos anti-HIV.
- Explorar as implicações para o diagnóstico de outras infecções virais e cânceres.
Métodos Utilizados
- Síntese quimio-enzimática de N-glicanos.
- Construção de microarranjos de glicanos em lâminas ACG.
- Perfil de anticorpos anti-HIV amplamente neutralizantes.
- Análise de padrões de ligação de glicanos.
Principais Resultados
- Síntese bem-sucedida de N-glicanos para aplicações em microarranjos.
- Detecção demonstrada de interações de ligação fracas.
- Identificação de padrões específicos de glicanos associados a anticorpos anti-HIV.
- Possíveis aplicações para o diagnóstico de influenza e cânceres.
Conclusões
- A abordagem modular melhora a síntese de N-glicanos.
- Esta técnica pode melhorar a compreensão da especificidade dos glicanos.
- Apresenta potencial para aplicações mais amplas em diagnósticos.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
This chemo-enzymatic N-glycan synthesis method enables rapid generation of diverse glycan libraries for microarray-based antibody profiling, addressing a critical gap in detecting weak and heterogeneous glycan-protein interactions relevant to HIV vaccine design. By facilitating the analysis of hetero-ligand binding behaviors of broadly neutralizing antibodies like PG9, the approach supports mechanistic de-risking in early immunogen discovery and improves predictive confidence in antigen selection. The modular strategy provides a scalable, reusable platform for epitope mapping and target validation across infectious disease and oncology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping glycan-specific antibody interactions that inform target relevance and mechanism of action.
- Operational Value: Supports biological de-risking through systematic profiling of hetero-ligand binding patterns on defined glycan arrays.
- Predictive Value: Enhances portfolio triage by identifying glycan motifs associated with potent neutralizing activity, guiding immunogen design decisions.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces covalently attached, structurally diverse N-glycans on aluminum oxide-coated glass slides, creating standardized microarrays for reliable compound and antibody screening.
- Quantitative Output: Enables detection of weak binding interactions through fluorescent readouts, providing measurable affinity and specificity data for hit validation.
- Platform Reuse: The modular synthesis strategy allows rapid regeneration of glycan libraries, supporting iterative screening campaigns and cross-project standardization.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly supports translational biomarker discovery by linking specific glycan structures (e.g., Man5GlcNAc2 and di-sialylated bi-antennary N-glycans) to HIV antibody binding phenotypes.
- Preclinical Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by providing a defined glycan system to assess antibody efficacy and specificity prior to in vivo testing.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by revealing off-target or weak-binding glycan interactions that may indicate reduced therapeutic potential or safety concerns.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery workflow from early target validation through lead identification, enabling glycan-dependent antibody characterization that informs downstream preclinical development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by defining glycan epitopes recognized by HIV broadly neutralizing antibodies, reducing mechanistic ambiguity in target validation.
- Screening: Delivers assay-ready glycan microarrays with high reproducibility and quantitative readouts, enabling reliable evaluation of antibody-glycan interactions across large libraries.
- Analytics: Generates binding signal data (e.g., fluorescence intensity) that allows comparative analysis of homo- and hetero-glycan binding, facilitating structure-activity relationship mapping.
- Translational Research: Connects to preclinical work by identifying glycan-specific antibody profiles that can be correlated with functional neutralization and used to guide immunogen optimization.
- Enterprise Reuse: The chemo-enzymatic modular approach is adaptable across targets, allowing reuse of the synthesis and array fabrication workflow for multiple antibody discovery campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in glycan-dependent antibody recognition.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through covalent glycan attachment and controlled array fabrication on ACG slides.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling rapid glycan library generation and reducing reliance on external synthesis or fragmented screening efforts.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying glycan-binding phenotypes linked to potent neutralization, informing advancement decisions in vaccine and therapeutic pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in carbohydrate chemistry, enzymatic synthesis, and microarray handling to ensure proper glycan modification and array quality.
- Depends on instrumentation for rotary evaporation, polyacrylamide gel electrophoresis, and array scanning with specific wavelength and PMT settings.
- Necessitates cross-team standardization of glycan solution preparation, printing concentrations, and antibody incubation protocols to maintain inter-assay consistency.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different glycan targets or antibody classes, particularly in linker chemistry and surface immobilization efficiency.
- Includes practical limitations such as the need for freshly anodized slides and careful handling of toxic reagents during phosphonate linker coupling and hydrogenation steps.
