Quimio-enzimático síntese de N- os glicanos para desenvolvimento de matriz e anticorpos de HIV de criação de perfil

O objetivo geral desta metodologia é desenvolver uma abordagem quimioenzimática modular para a síntese de N-glicanos, construindo uma nova microplaca de glicanos em lâmina de vidro revestida com óxido de alumínio para detectar a ligação de heteroglicanos a anticorpos do HIV. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais em glicobiologia, na identificação de glicanos específicos de células e vírus, para ampla aplicação no desenvolvimento de novas terapias. A principal vantagem deste método é a detecção de ligações fracas e a identificação de uma mistura de açúcares que se ligam a uma proteína, como por exemplo, anticorpos de pacientes com HIV.

As implicações dessa técnica estendem-se ao diagnóstico de infecções por influenza, pois o catabolismo de ácido siálico ocorre em células epiteliais das vias aéreas humanas e é comum durante os sintomas. Portanto, a glicomatra será uma ferramenta ideal para determinar a especificidade de subtipos selvagens. Embora este método possa fornecer informações sobre as especificidades de glicanos por anticorpos do HIV, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como o diagnóstico de diversos tipos de câncer com base no padrão de ligação de anticorpos séricos humanos frente a antígenos séricos específicos humanos impressos na superfície.

Para iniciar este procedimento, adicione 2-5 micromols do glicano previamente preparado a um frasco redondo de cinco mililitros. Adicione uma barra de agitação magnética ao frasco e tampe-o com uma septa de borracha. Adicione 400 microlitros de DMF recentemente seco e 10-25 micromols do ligante de ácido fosfônico ao frasco.

Em seguida, agite a mistura de reação a 800 rpm por cinco horas. Após a conclusão da reação, evapore o solvente utilizando um evaporador rotativo sob pressão de vácuo de cinco a 10 milibares e temperatura de 40 graus Celsius. Em seguida, dissolva a mistura de reação seca em 0,5 mililitro de água e carregue sobre uma coluna de gel de poliacrilamida.

Elua os produtos utilizando água e colete frações de um a dois mililitros. Para analisar as frações coletadas por TLC, aplique cada fração em uma placa de TLC e mergulhe a placa em molibdato de amônio de cério 0,25 molares. Aqueça a placa manchada em uma placa aquecedora para visualizar o produto.

Após combinar as frações contendo o produto e congelar a solução, liofilize para obter o produto desejado na forma de um pó branco. Em seguida, dissolva o produto seco em dois mililitros de água e adicione hidróxido de paládio. Afixe um balão contendo hidrogênio ao frasco e agite a mistura reacional a 800 rpm por 15 horas sob atmosfera de hidrogênio.

Após a conclusão da reação, filtre a mistura através de uma cama de Celite e lave com dois mililitros de metanol e dois mililitros de água destilada desionizada. Em seguida, evapore o solvente utilizando um evaporador rotativo sob pressão de vácuo de 300 milibares e temperatura de 40 graus Celsius. Após isso, dissolva a mistura bruta em aproximadamente um mililitro de água e carregue-a na parte superior de uma cama de gel de poliacrilamida.

Elua o produto com água e colete frações de um a dois mililitros. Após combinar as frações contendo o produto e congelar a solução, liofilize para obter o produto desejado na forma de um pó branco. Uma vez que o produto esteja seco, caracterize-o por RMN e espectroscopia de massas utilizando óxido de deutério como solvente.

Para a anodização superficial, ajuste um incubador com controle de temperatura a quatro graus Celsius. Em seguida, transfira uma solução aquosa de ácido oxálico 0,3 molar previamente preparada para um béquer de 500 mililitros contendo um bastão de agitação magnético. Coloque uma haste de platina de 10 centímetros de comprimento como cátodo na solução.

Mantenha a agitação do ácido oxálico a 300 rpm durante todo o processo de anodização. No software de rastreamento de laboratório, clique no botão de configuração e, em seguida, clique na opção de função Varredura de Tensão. Defina a tensão inicial e final em 25,8 volts.

O número de pontos para 100, a conformidade para um e o atraso de varredura para 1200 milissegundos. Em seguida, clique em OK. Prenda uma lâmina de vidro revestida com alumínio com a face voltada para o cátodo.

Clique no botão de executar o teste e observe a medição de corrente. Após a anodização da superfície, lave a lâmina de vidro cuidadosamente com água bidestilada e seque com gás nitrogênio. Armazene a lâmina de vidro em uma câmara com 30% de umidade relativa até seu uso posterior.

Para a fabricação, prepare 100 microlitros de soluções de todos os glicanos monovalentes em etanol glicol a uma concentração de 10 milimolar. Dilua as soluções de glicanos com tampão de impressão para obter soluções de 100 micromolar. Para o Estudo Heteroligando, adicione cinco microlitros do Glicano MAN-5 a cinco microlitros de cada solução de glicano.

Transfira os glicanos preparados para a microplaca de 384 poços para a etapa de impressão do microarranjo. Após inserir uma microplaca no arranjo da impressora array tech, imprima os microarranjos com pino robótico, depositando 0,6 nanolitros das soluções de glicanos em cada lâmina de vidro revestida com alumínio. Em seguida, prepare 70 microlitros do anticorpo primário PG-9 e tampão PTSB contendo 3% de BSA.

Em seguida, prepare 120 microlitros de anticorpo secundário marcado com fluoróforo, Donkey e Anti-IgG humana, em tampão PBST contendo 3% de BSA, no escuro. Misture PG9 e o anticorpo secundário marcado com fluoróforo na proporção de 1:1. Incube então os anticorpos pré-misturados por 30 minutos a quatro graus Celsius.

Após a incubação, carregue uma lâmina de vidro revestida com alumínio na câmara de incubação de lâminas, que é dividida em 16 poços. Transfira 100 microlitros dos anticorpos pré-misturados para a matriz de glicanos. Após a incubação a quatro graus Celsius por 16 horas, remova os anticorpos pré-misturados da matriz de glicanos com uma pipeta e, em seguida, remova a câmara de incubação da lâmina.

Lave a lâmina de vidro em tampão PBST e água desionizada. Em seguida, seque a lâmina por centrifugação a 2000 ×g. Depois, abra o software de análise de imagens de microarranjo.

Insira a lâmina de vidro seca no escâner de matriz com as estruturas organizadas voltadas para baixo. Clique no menu de configurações. Defina a resolução da imagem como cinco micrômetros por pixel.

E defina o comprimento de onda em 635 nanômetros com PMT 450 e potência em 100%. Clique no botão de digitalização para iniciar a aquisição da imagem do lâmina. Por fim, clique no ícone de arquivo para salvar a imagem digitalizada em formato TIF para análise de imagem. Neste estudo, uma ampla variedade de N-glicanos foi sintetizada utilizando uma estratégia quimioenzimática modular.

Para demonstrar a eficácia da estratégia, uma estrutura isoelétrica biantenária foi sintetizada por métodos quimioenzimáticos. A galactosilação enzimática do dissacarídeo 1, seguida pela fucosilação do trissacarídeo 2, forneceu o tetrossacarídeo desejado 3. A saturação completa e as modificações na extremidade redutora dos blocos construtores dois e três forneceram as moléculas desejadas quatro e cinco.

A glicosilação estereosseletiva de três O do módulo quatro do trissacarídeo seis forneceu o hexasacarídeo sete. A desproteção e reação anterior ao módulo cinco produziram o dodecasacarídeo nove. A desproteção global forneceu o glicano 10, que foi caracterizado por enamir e espectroscopia de massas.

Glicanos contendo uma cauda de pentilamina na extremidade redutora foram modificados com ligantes de ácido fosfônico e ligados à superfície revestida com vidro de alumínio por meio de química fosfinídica. O anticorpo amplamente neutralizante do HIV-1, PG9, foi testado quanto à sua especificidade por glicanos utilizando matrizes homo e heteroglicanas para demonstrar, pela primeira vez, sua interação com heteroglicanos adjacentes no loop V1/V2 da superfície PG120 do HIV-1. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em 24 horas, da imobilização dos glicanos até a análise beta, se for executada corretamente.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de usar lâminas de vidro recobertas com alumínio anodizado fresco para a Glicana 10. Para a execução deste procedimento, são utilizadas as lâminas dos técnicos de laboratório. A determinação da constante corporal pode ser realizada para quantificar as interações de ligação entre o carboidrato e a proteína de interesse.

Após o desenvolvimento dessa técnica, abriu-se caminho para que pesquisadores compreendessem melhor o papel dos carboidratos nas doenças infecciosas no Quênia e ajudassem a desenvolver novas terapias contra essas doenças. Não se esqueça de que trabalhar com agentes tóxicos pode ser extremamente perigoso e de que precauções, como o uso de roupas, óculos e máscaras, devem sempre ser tomadas ao realizar experimentos.