Name: Salvamento e Caracterização do Vírus Recombinante de um Clone Infeccioso do Vírus do Novo Mundo Zika (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Aprenda a recuperar o vírus Zika infeccioso a partir de um clone de cDNA em duas partes. Este método oferece vantagens de estabilidade para pesquisas em flavivirologia e pode ser aplicado a outros sistemas virais difíceis de clonar.

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Os autores agradecem a Kristen Bullard-Feibelman, Milena Veselinovic e Claudia Rückert por sua assistência na caracterização do vírus derivado de clones. Este trabalho foi apoiado em parte por doações do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas, NIH sob subsídios AI114675 (BJG) e AI067380 (GDE).

1. Transformação e Recuperação de Plasmídeos de Clone Infecciosos <ol><li> Transforme ambos os plasmídeos (separadamente) usando um protocolo de transformação comercial ( por exemplo , NEB 5 Minute Transformation Protocol) com algumas modificações. Ambos os plasmídeos contêm um gene que codifica a resistência à ampicilina, portanto, use ampicilina ou carbenicilina para seleção. A carbanilhilina é preferida, pois é mais estável. <ol><li> Remova as células (veja a Tabela de Materiais) a partir de um congelador de -80 ° C e descongelar no gelo durante 5-10 min. Caldo de lisogenia de pré-aquecimento (LB) (contendo placas de 10 g / L de NaCl e 25 μg / mL de carbenicilina, chamadas LB-carb) e o caldo com repressão de catabolitos (SOC (sem antibióticos) - chegando com as células) a 37 ° C. </li><li> Adicionar entre 100 pg-10 ng em 1 μL de ADN plasmídico a um tubo contendo 50 μL de células competentes; Misture suavemente acendendo o tubo. </li><li> Incubar tubos em gelo durante 5 min. </li><li> Tubos de choque térmico a 42 ° C durante 30 sEm banho-maria. Retorne ao gelo durante 2 minutos imediatamente após choque térmico. </li><li> Pipetar 950 μL de temperatura ambiente COS em cada tubo e misturar por pipetagem. Distribuir 100 μL da mistura bacteriana sobre uma placa LB-carb e incubar durante a noite a 37 ° C (aproximadamente 12-14 h). </li></ol></li><li> Retire as placas da incubadora a 37 ° C após 12-14 h de incubação. Coloque as placas em uma gaveta escura à temperatura ambiente para permitir que as colônias continuem a crescer (aproximadamente 8-9 h). </li><li> Usando 5 mL de caldo Terrific (TB, contendo 25 μg / mL de carbenicilina, chamado TB-carb), cresça 5-10 pequenas colônias para cada plasmídeo durante a noite a 30 ° C em um agitador bacteriano (aproximadamente 14-16 h). NOTA: As pequenas colônias são um indicador de que o plasmídeo está intacto; Colônias com plasmídeos contendo deleções, rearranjos ou mutações (aqui denominados eventos de instabilidade) crescerão mais rapidamente e, portanto, serão maiores. Portanto, deve-se tentar escolher as colônias mais pequenas na placa, especificamente nãoT selecionando as maiores colônias presentes. Algumas colônias de tamanho médio também podem ser selecionadas para integridade. A menor temperatura utilizada reduz a probabilidade de as células serem superadas (OD 600 acima de 0,6-0,8). Como a maioria dos pesquisadores realiza um crescimento durante a noite, ele permite mais controle e menor chance de crescimento excessivo. </li><li> Verifique as culturas líquidas para turbidez (aproximadamente OD 600 de 0,6-0,8). Coloque os tubos turvos a 4 ° C e permita que outros tubos se tornem turvos crescendo por mais tempo. NOTA: Não produza bactérias para OD 600 valores maiores que o recomendado, pois podem ocorrer eventos de instabilidade plasmídica. </li><li> Extrair DNA de plasmídeo de bactérias com um kit de miniprep de plasmídeo comercial (ver Tabela de Materiais). Eluir em 15 μL de tampão de eluição pré-aquecido (até 70 ° C em um bloco de aquecimento). Permitir que o tampão de eluição incuba na coluna durante 5 minutos antes da centrifugação. NOTA: Preserve pelo menos 1 mL desta cultura inicial a 4 ° C paraMais uma vez na próxima etapa. </li><li> Digerir 10 μL dos plasmídeos recuperados para avaliar se os eventos de instabilidade plasmídica ocorreram durante a cultura. NOTA: digerir p1 com SalI / NheI e p2 com BamHI / HindIII a 37 ° C durante 1 h. Confirme a presença das bandas corretas após a digestão ( Figura 2a ) por eletroforese em gel e avance para o passo 2. Se estiver preparando DNA de plasmídeo por amplificação do círculo de rolamento (RCA), reserve alguns dos eluentes de miniprep para servir como modelo. </li></ol> 2. Preparação de ADN de plasmídeo suficiente para ligadura NOTA: A ligação e a subsequente eletroporação requerem uma quantidade suficiente de DNA plasmídico que deve ser gerado através de maxiprep ou RCA. Embora a maxiprep seja a abordagem tradicionalmente utilizada, a RCA oferece a vantagem de não requerer bactérias, eliminando o potencial de toxicidade induzida por plasmídeos em bactérias que podem resultar em eventos de instabilidade. <ol><li><stRong&gt; Execute o seguinte procedimento de maxiprep. <ol><li> Para cada plasmídeo que demonstrou o padrão de digestão da enzima de restrição correto na seção anterior, adicione 500 μL de cultura de iniciador a 1 L de carbeno de TB-Carb (25 μg / mL) e agite durante a noite a 30 ° C (aproximadamente 14-16 h , Aproximadamente OD 600 de 0,6-0,8). NOTA: Não permita que a cultura cresça sobre este valor OD 600 . Isso irá potencialmente resultar em eventos de instabilidade dentro dos plasmídeos. </li><li> Colhe as bactérias e realize maxipreps por protocolo do fabricante (veja Tabela de Materiais). </li></ol></li><li> Usando o miniprep salvo da etapa 1.6, execute o seguinte para o procedimento RCA. <ol><li> Transferir 1 μL de ADN plasmídico para um tubo contendo 50 μL de tampão de amostra. </li><li> Desnaturar a amostra a 95 ° C durante 3 minutos e depois incubar a 4 ° C até estar pronto para usar. </li><li> Prepare a amplificação comercialPré -mistura (ver tabela de materiais ). Combine 50 μL de tampão de reação com 2 μL de mistura enzimática em um conjunto de tubos em gelo. NOTA: A pré-amplificação deve ser mantida em gelo até estar pronta para uso. É conveniente preparar uma mistura principal combinando reagentes suficientes para o número necessário de reações de amplificação. Qualquer pré-mistura não utilizada deve ser descartada. </li><li> Transferir 50 μL de pré-mistura de amplificação preparada para a amostra desnaturada. </li><li> Incubar os tubos de reação a 30 ° C durante 18 h. </li><li> Incubar os tubos a 65 ° C durante 10 min para inativar a polimerase de DNA ø29. </li><li> Armazene os tubos de reação a 4 ° C ou -20 ° C até estar pronto para uso. NOTA: Neste ponto, o DNA de plasmídeo preparado através de ambos os métodos deve ser quantificado (usando absorvância a 260 nm) e o genoma de ZIKV deve ser Sanger sequenciado inteiramente para confirmar que não ocorreram eventos de instabilidade (deleções e rearranjos) durante a preparação. </li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Nome do Primer </td><td> Sequência (5 &#39;- 3&#39;) </td></tr><tr><td> ZIKV PRVABC59 1For. </td><td> AGTTGTTGATCTGTGTGAATCAGAC </td></tr><tr><td> ZIKV Conserved 632For. </td><td> GCCCTATGCTGGATGAGG </td></tr><tr><td> ZIKV Conserved 692Rev. </td><td> GGTTCCGTACACAACcCAAGTTG </td></tr><tr><td> ZIKV Conserved 1313Rev. </td><td> CTCCCTTTGCCAAAAAGTCCACA </td></tr><tr><td> ZIKV Conserved 1201For. </td><td> CCAACACAAGGTGAAGCCTAC </td></tr><tr><td> ZIKV Conserved 1663For. </td><td> GCAGACACCGGAACTCCACACT </td></tr><tr><td> ZIKV Conserved 2008For. </td><td> CAGATGGCGGTGGACATGC </td></tr><tr><td> ZIKV Conserved 2350Rev. </td><td> GTGAGAACCAGGACATTCCTCC </td></tr><tr><td> ZIKV Conserved 2605For. </td><td> TACAAGTACCATCCTGACTCCC </td></tr><tr><td> ZIKV Conserved 3499Rev. </td><td>GCCTTATCTCCATTCCATACCA </td></tr><tr><td> ZIKV Conserved 3961Rev. </td><td> TTGCCAACCAGGCCAAAG </td></tr><tr><td> ZIKV Conserved 4132For. </td><td> CATTTGTCATGGCCCTGG </td></tr><tr><td> ZIKV Conserved 4561Rev. </td><td> CTATTGGGTTCATGCCACAGAT </td></tr><tr><td> ZIKV Conserved 4665For. </td><td> GACCACAGATGGAGTGTACAGAGT </td></tr><tr><td> ZIKV Conserved 5189Rev. </td><td> AAGACAGTTAGCTGCTTCTTCTTCAG </td></tr><tr><td> ZIKV Conserved 5219For. </td><td> GAGAGTTCTTCCTGAAATAGTCCGTGA </td></tr><tr><td> ZIKV Conserved 6086Rev. </td><td> CTTGCTTCAAGCCAGTGTGC </td></tr><tr><td> ZIKV Conserved 6119For. </td><td> GCCTCATAGCCTCGCTCTATCG </td></tr><tr><td> ZIKV Conserved 6721Rev. </td><td> CCATTCCAAAGCCCATCTTCCC </td></tr><tr><td> ZIKV Conserved 6769For. </td><td> CCAGCCAGAATTGCATGTGTCC </td></tr><tr><td> ZIKV Conserved 7209Rev. </td><td> ATCATTAGCAGCGGGACTCCAA </td></tr><tr><td> ZIKV Conservado 7343Para. </td><td> GTTGTGGATGGAATAGTGGT </td></tr><tr><td> ZIKV Conserved 8243For. </td><td> TGCCCATACACCAGCACTATGA </td></tr><tr><td> ZIKV PRVABC59 8893Rev. </td><td> TGCATTGCTACGAACCTTGTTG </td></tr><tr><td> ZIKV conservou 9133Para. </td><td> AGCCCTTGGATTCTTGAACGAGGA </td></tr><tr><td> ZIKV PRVABC59 9673Rev. </td><td> AACGCAATCATCTCCACTGACT </td></tr><tr><td> ZIKV Conserved 9686For. </td><td> GATGATAGGTTTGCACATGCC </td></tr><tr><td> ZIKV Conserved 10321Rev. </td><td> GTCCATGTACTTTTCTTCATCACCTAT </td></tr><tr><td> ZIKV Conserved 10455For. </td><td> CAGGAGAAGCTGGGAAACC </td></tr><tr><td> ZIKV Conserved 10621Rev. </td><td> CAGATTGAAGGGTGGGGAAGGTC </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Primers para sequenciação de clones de cDNA. Os plasmídeos podem ser sequenciados inteiramente com os primers listados. Primers marcados como &quot;conservados&quot; indiCate que provavelmente são capazes de seqüenciar / amplificar todos os genótipos de ZIKV. Os primers rotulados como &quot;PRVABC59&quot; são específicos desta cepa, mas também podem funcionar para outras estirpes de genótipos asiáticos e possivelmente outros genótipos. 3. Preparação de ARN transcrito in vitro <ol><li> Configure a reação de digestão de DNA maxiprep ou RCA preparado. <ol><li> Para a digestão com p1, misture 10 μL de tampão de reação 10x, 3 μL de ApaLI, 3 μL de BamHI-HF, 3 μL de rSAP ou CIP e 3,3 μg de DNA p1. Adicione ddH 2 O a 100 μL. </li><li> Para a digestão com p2, misture 10 μL de 10x de tampão de reação, 3 μL de ApaLI, 3 μL de EcoRI-HF e 13,3 μg de DNA de p2. Adicione ddH 2 O a 100 μL. </li><li> Incubar a 37 ° C por 1-2 h. </li><li> Purifique usando um gel comercial e um kit de limpeza de PCR (veja a Tabela de Materiais). Eluir em 30 μL de tampão de eluição pré-aquecido a 70 ° C em um bloco de aquecimento (incubar oColuna por 5 min antes de girar). NOTA: Mantenha 1 μL para funcionar em um gel mais tarde. </li></ol></li><li> Prepare a reação de ligação. <ol><li> Combina 10 μL de tampão de reacção de ligação de ADN T4 10x, 3 μL de T4 DNA ligase (400 U / μL), 29 μL de p1 purificado e 29 μL de p2 purificado. Adicione ddH 2 O a 100 μL. </li><li> Incubar à temperatura ambiente durante 2 h ou 16 ° C durante a noite. </li><li> Purifique usando um gel comercial e um kit de limpeza de PCR (veja a Tabela de Materiais). Eluir em 10 μL de tampão de eluição pré-aquecido a 70 ° C em um bloco de aquecimento (incubar coluna durante 5 minutos antes de girar). NOTA: Mantenha 1 μL para funcionar em um gel mais tarde. </li></ol></li><li> Executar plasmídeos não digeridos, plasmídeos digeridos e ligação em um gel de agarose. O produto de ligação deve ter uma banda de peso molecular mais elevado (cerca de 11 kb) do que o plasmídeo digerido isolado, indicando que a ligação foi bem sucedida ( Figura 2b ).</li><li> Configure a reação de transcrição in vitro T7. <ol><li> Combine 10 μL de mistura ARCA / NTP 2x, 2 μL de mistura de ARN polimerase T7 e 8 μL de reação de ligação purificada para um volume final de 20 μL. NOTA: O ARCA incluído na mistura é um sensor analógico que é incorporado exclusivamente na orientação correta. Os análogos da capa padrão podem resultar em apenas ~ 50% dos transcritos com uma tampa na orientação correta. </li><li> Incubar durante 4 h a 37 ° C. </li><li> Medir a concentração de ARN através de um espectrofotômetro UV. Opcionalmente, execute um gel de agarose desnaturante para confirmar o comprimento da transcrição de RNA. </li></ol></li></ol> 4. Resgate de vírus infeccioso por eletroporação <ol><li> Dias antes da eletroporação, preparar 1 balão T182 de células Vero (entre T150 e T182 é aceitável, cultivado em DMEM + 10% de soro fetal bovino (FBS)) por construção a ser recuperada. Inclua 1 T182 como um controle de transfecção simulada. CeLls devem ser utilizados em uma confluência de 70-80%. </li><li> Quando as células estão prontas, coloque 12 mL / reação de DMEM + 15% de FBS + 10 mM de HEPES em um banho de água aquecido a 37 ° C. </li><li> Descarte as células por tripsinização com um protocolo padrão e recupera as células na mídia com FBS a 10% para inativar a tripsina; Centrifugação de células a 150 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Lavar células em 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS), células de sedimentação a 150 xg durante 5 min a 4 ° C. Repita este passo duas vezes para um total de três lavagens. </li><li> Ressuspender células em 200 μL de RPMI 1640 + HEPES 10 mM (estéril) por número de amostras. Transfira 200 μL de suspensão celular para um tubo estéril. As células devem ser ~ 0,5 x 10 7 células / mL. </li><li> Adicionar 20 μL de água (mock neg control) ou 20 μL de RNA (de preferência 5-10 μg) produzido no passo 3.4 para cada conjunto de células. Misture suavemente puxando o tubo e transfira o conteúdo do tubo para uma cubeta de eletroporação de intervalo de 2 mm. </li><li> Defina um elétronOporador para 170 V LV, omega (resistência) a 0 e 950 μF (aproximadamente a 625 V / cm e 20 ms constante para outras máquinas). Configure a resistência à configuração mais baixa disponível, seja 0 ou ∞ se disponível. </li><li> Pulso uma vez e imediatamente adicionar 600 μL de DMEM + 15% FBS + 10 mM HEPES que foi aquecido no passo 4.2. Enxágue dentro da cuvete cuidadosamente para remover todas as células. Adicionar células a um balão de cultura de tecido T75 contendo 10 mL de meio pré aquecido. Remova a mídia adicional da cuvete usando o conta-gotas que acompanha a cuvete. Tenha cuidado para manter a esterilidade. </li><li> Balão de redemoinho para misturar meios e células e colocar em uma incubadora de 37 ° C. </li><li> Verifique no dia seguinte a viabilidade celular e faça-o todos os dias até 50-75% de morte celular. A morte celular é observada comparando-se ao mock controle eletroporado. NOTA: O efeito citopático ZIKV (CPE) é bastante pronunciado nas células Vero, resultando em células arredondadas que se destacam e flutuam no meio de cultura. Nós temosObservou uma faixa de 8-10 dias como ideal para a colheita. </li><li> Coloque o sobrenadante em um tubo cônico e centrifugue para remover detritos celulares a&gt; 3,000 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Remova o sobrenadante esclarecido para um novo tubo e adicione-o com uma concentração final de FBS a 20% (de 100% de estoque). Adicionalmente, adicione HEPES estéril a uma concentração final de 10 mM como agente tampão para preservar a infecciosidade do vírus enquanto está congelado (a partir de um estoque esterilizado de 1 M). </li><li> Misture o vírus por vórtice e alíquota em frascos de tampa roscada. Armazene a -80 ° C para uso futuro. </li></ol> 5. Titulação do vírus recuperado <ol><li> Seed o número apropriado de placas de 6 ou 12 poços de células Vero no dia anterior à titulação. </li><li> Remova o vírus do congelador e faça diluições em série de 10 vezes em DMEM + 2% de FBS em tubos ou placas de 96 poços. NOTA: O título esperado dos clones recuperados é entre 1 x 10 6 e 5 x 10 7 PFU / mL. </li><li> Adicione 200 oR 400 μL de cada diluição em duplicado para um poço de uma placa de 12 ou 6 poços, respectivamente. </li><li> Coloque as placas em uma incubadora a 37 ° C e roote a cada 15 minutos, para um período total de ~ 1-1,5 h de adsorção. </li><li> Remova o inóculo viral e adicione 1 mL de (12 poços) ou 2 mL (6 poços) de aderência DMGM-Tragacanto a cada poço. NOTA: É possível usar agarose, ágar, metilcelulose ou outro meio de sobreposição aqui. </li><li> Incubar células em incubadora a 37 ° C durante 5 dias. O tempo para a formação adequada da placa irá variar dependendo da sobreposição utilizada. </li><li> Para consertar células, remova as placas da incubadora e decanta a sobreposição suavemente em desinfetante. </li><li> Adicione suficiente 20% de etanol / 0,1% de violeta de cristal (CV) a cada poço para cobrir e girar para misturar. NOTA: Muitos outros fixadores existem e podem ser usados ​​aqui. Além disso, se estiver usando uma sobreposição de agarose ou ágar, uma segunda sobreposição pode ser usada em conjunto com vermelho neutro para visualizar placas sem fixação. 20% de etanol mostrou-se serEficaz na inativação de vírus envolvidos em estudos anteriores; Não use esse valor para vírus não envolvidos, pois não serão inativados 19 . </li><li> Incube as placas durante 30-60 minutos à temperatura ambiente (num gabinete de biossegurança de classe II); Descarte CV (por regulação local) e lave as placas com água da torneira. </li><li> Deixe as placas secar e contamine as placas manualmente. NOTA: Referência 20 pode ser usado como uma referência adicional para realizar ensaios de placa. </li></ol>

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<li>Chang, A. C., Cohen, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+characterization+of+amplifiable+multicopy+DNA+cloning+vehicles+derived+from+the+P15A+cryptic+miniplasmid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Construction and characterization of amplifiable multicopy DNA cloning vehicles derived from the P15A cryptic miniplasmid.</a> J Bacteriol. 134 (3), 1141-1156 (1978).</li>
<li>Weger-Lucarelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Characterization+of+Recombinant+Virus+Generated+from+a+New+World+Zika+Virus+Infectious+Clone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Development and Characterization of Recombinant Virus Generated from a New World Zika Virus Infectious Clone.</a> J Virol. 91 (1), (2017).</li>
<li>Roberts, P. L., Lloyd, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus+inactivation+by+protein+denaturants+used+in+affinity+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Biologicals%22%5BJournal%5D)">Virus inactivation by protein denaturants used in affinity chromatography.</a> Biologicals. 35 (4), 343-347 (2007).</li>
<li>Baer, A., Kehn-Hall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+concentration+determination+through+plaque+assays%3A+using+traditional+and+novel+overlay+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems.</a> J Vis Exp. (93), e52065(2014).</li>
<li>Weger-Lucarelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Characterization+of+Recombinant+Virus+Generated+from+a+New+World+Zika+Virus+Infectious+Clone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Development and Characterization of Recombinant Virus Generated from a New World Zika Virus Infectious Clone.</a> J Virol. , (2016).</li>
<li>Grubaugh, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Drift+during+Systemic+Arbovirus+Infection+of+Mosquito+Vectors+Leads+to+Decreased+Relative+Fitness+during+Host+Switching%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Genetic Drift during Systemic Arbovirus Infection of Mosquito Vectors Leads to Decreased Relative Fitness during Host Switching.</a> Cell Host Microbe. 19 (4), 481-492 (2016).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Aqui descrevemos um método para a recuperação de um sistema de clone de cDNA infeccioso bipartido para ZIKV. Os clones para ZIKV descritos anteriormente sofrem atenuação ou requerem a adição de íntrons, tornando os plasmídeos maiores e impedindo o resgate em células de insetos. O vírus infeccioso pode ser recuperado usando o sistema de clones de dois plasmídeos em células de mamíferos ou insetos (dados não mostrados). Além disso, o vírus recuperado desse sistema se comporta de forma semelhante ao vírus do tipo selvagem e...

O vírus Zika (ZIKV; Família Flaviviridae : Gênero Flavivírus ) é um flavivírus transmitido por mosquito que chegou ao Brasil em 2013-14 e posteriormente foi associado a um surto maciço de doença febril que se espalhou pelas Américas 1 . Além disso, o ZIKV tem sido associado a desfechos graves da doença, como a síndrome de Guillain-Barré em adultos e microcefalia em fetos e neonatos 2 . Pouco se sabia sobre ZIKV antes da sua rápida propagação no hemisfério ocidental. Isso incluiu a falta de ferramentas moleculares, dificultando assim a pesquisa mecanicista. Ferramentas moleculares para vírus, tais como clones de cDNA infecciosos, facilitam a vacina e o desenvolvimento terapêutico antiviral e permitem a avaliação de fatores genéticos virais relacionados à patogênese viral diferencial, resposta imune e evolução viral. Os clones infecciosos de Flavivirus são conhecidos por serem altamente instáveis ​​em bactérias devido a crPromotores procarióticos ypticos presentes em seus genomas 3 . Várias abordagens têm sido usadas para melhorar esse problema; Incluindo a inserção de repetições em tandem a montante das sequências virais 4 , mutação das seqüências promotoras procarióticas putativas 5 , dividindo o genoma em múltiplos plasmídeos 6 , vetores numéricos de baixa cópia (incluindo cromossomos artificiais bacterianos) 7 , 8 e inserção de intrões no genoma viral 9 . Um sistema completo sem modificações foi descrito para ZIKV; No entanto, este clone pareceu ser atenuado na cultura celular e em camundongos 10 . Outros grupos criaram intrões no genoma de ZIKV, permitindo a interrupção de seqüências instáveis ​​em bactérias que podem ser empalmadas em células de mamíferos in vitro para a produção de vírus infecciosos 11, 12 . Além disso, um sistema baseado em PCR, intitulado Infectious-Subgenomic-Amplicons, foi utilizado com sucesso para resgatar o protótipo MR766 de ZIKV 13 . A abordagem descrita aqui não requer seqüências estranhas, mas sim interrompe o genoma na região de alta instabilidade usando múltiplos plasmídeos, que já foram utilizados com sucesso com vírus da febre amarela 6 , dengue 14 , 15 e do Nilo Ocidental 16 . Além disso, a adição da sequência de ribozima da hepatite D no terminal genômico viral facilita a criação de um autêntico final 3 &#39;sem a necessidade de adicionar um site de linearização. Além disso, ambos os plasmídeos são construídos em um vetor de números de baixa cópia (pACYC177, ~ 15 cópias por célula) para mitigar qualquer toxicidade residual 17 . O vírus recuperado exibe um perfil de crescimento comparável aoVírus parental em curvas de crescimento in vitro em 8 linhas celulares compreendendo uma variedade de tipos de células derivadas de mamíferos e insetos e exibiu perfis patogênicos idênticos em camundongos e taxas de infecção, disseminação e transmissão em mosquitos 18 . Aqui, detalhamos um protocolo descrevendo como cultivar os plasmídeos de clones infecciosos, gerar RNA viral completo (o genoma viral) in vitro e recuperar vírus infecciosos em cultura celular. Primeiro, descrevemos a propagação de plasmídeos em bactérias ou amplificação sem bactérias usando amplificação do círculo circulante (RCA). Em seguida, mostramos como os dois plasmídeos são digeridos e subsequentemente ligados em conjunto para gerar vírus de comprimento total. Finalmente, descrevemos a produção de ARN transcrito e sua subsequente eletroporação em células Vero, seguidas de titulação de vírus recuperado ( Figura 1 ). A abordagem descrita é rápida, permitindo queR recuperação de stocks de vírus infecciosos em 1-2 semanas.

<table><tbody><tr><td>NEB Stable CompetentE. coli</td><td>New England BioLabs</td><td>C3040H</td><td></td></tr><tr><td>Carpenicilina, Sal Dissódico</td><td>vários</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zyppy Plasmid Miniprep Kit Zymo</td><td>Research</td><td>D4036</td><td></td></tr><tr><td>ZymoPURE Plasmid Maxiprep Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4202</td><td></td></tr><tr><td>SalI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3138S</td><td>20.000 unidades/ml</td></tr><tr><td>NheI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3131S</td><td>20.000 unidades/ml</td></tr><tr><td>ApaLI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0507S</td><td>10.000 unidades/ml</td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3101S</td><td>20.000 unidades/ml</td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3136S</td><td>20.000 unidades/ml</td></tr><tr><td>HindIII-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3104S</td><td>20.000 unidades/ml</td></tr><tr><td>illustra TempliPhi 100 Kit de Amplificação</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>25640010</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel e PCR Clean-up</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609.5</td><td></td></tr><tr><td>Fosfatase Alcalina de Camarão (rSAP)</td><td>New England BioLabs</td><td>M0371S</td><td>1.000 unidades/ml</td></tr><tr><td>Fosfatase Alcalina, Intestino de Bezerro (CIP)</td><td>New England BioLabs</td><td>M0290S</td><td>10.000 unidades/ml</td></tr><tr><td>T4 DNA Kit de</td> mRNA Ligase <td>New England BioLabs</td><td>M0202S</td><td>400,000units/mL</td></tr><tr><td>HiScribe T7 ARCA</td><td>New England BioLabs</td><td>E2065S</td><td></td></tr><tr><td>Células Vero</td><td>ATCC</td><td>CCL-81</td><td></td></tr><tr><td>ECM 630 Sistema de Eletroporação de Alto Rendimento</td><td>BTX</td><td>45-0423</td><td>Outras máquinas são aceitáveis.</td></tr><tr><td>Caldo LB com ágar (Miller)</td><td>Sigma</td><td>L3147</td><td>Também pode ser caseiro.</td></tr><tr><td>Ótimo Caldo</td><td>Sigma</td><td>T0918</td><td>Pode ser caseiro também.</td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Celltreat</td><td>229693</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de cultura</td><td>VWR International</td><td>60818-576</td><td></td></tr><tr><td>Balões T75 Balões</td><td>Celltreat</td><td>229340</td><td></td></tr><tr><td>Balões T182</td><td>Celltreat</td><td>229350</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 com L-glutamina</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM com L-glutamina e 4,5 g/L de glicose</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovino (FBS)</td><td>Atlas Biologicals</td><td>FP-0500-A</td><td></td></tr><tr><td>Tragacanto em pó</td><td>MP Bio</td><td>MP 104792</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>Amresco</td><td>0528-1006</td><td></td></tr><tr><td>Etanol desnaturado</td><td>VWR International</td><td>BDH1156-1LP</td><td></td></tr><tr><td>Placa</td> <td>de 6 poçosCelltreat</td><td>229106</td><td></td></tr><tr><td>placa de 12 poços</td><td>Celltreat</td><td>229111</td><td></td></tr><tr><td>Sequenciamento Oligos</td><td>IDT consulte a</td><td>tabela 1</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0</td><td>ThermoFisher</td><td>Qubit 3.0</td><td>outros métodos são aceitáveis.</td></tr><tr><td>Kit de ensaio Qubit dsDNA BR</td><td>ThermoFisher</td><td>Q32850</td><td>outros métodos são aceitáveis.</td></tr><tr><td>Kit de ensaio Qubit RNA HS</td><td>ThermoFisher</td><td>Q32852</td><td>outros métodos são aceitáveis.</td></tr><tr><td>Gabinete de Biossegurança Classe II</td><td>Varia</td><td>N/A</td><td>Isso é necessário para o trabalho com vírus vivos.</td></tr></tbody></table>

salvamento e caracterização do vírus recombinante de um clone infeccioso do vírus do novo mundo zika

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Os clones de cDNA infecciosos permitem a manipulação genética de um vírus, facilitando assim o trabalho em vacinas, patogênese, replicação, transmissão e evolução viral. Aqui descrevemos a construção de um clone infeccioso para o vírus Zika (ZIKV), que atualmente está causando um surto explosivo nas Américas. Para evitar a toxicidade para bactérias comumente observadas com plasmídeos derivados de flavivírus, geramos um sistema de dois plasmídeos que separa o genoma no gene NS1 e é mais estável que as construções de comprimento total que não puderam ser recuperadas com sucesso sem mutações. Após a digestão e a ligação para unir os dois fragmentos, o ARN viral completo pode ser gerado por transcrição in vitro com polimerase de ARN T7. Após a eletroporação do ARN transcrito nas células, recuperou-se o vírus que apresentava cinética de crescimento in vitro semelhante e fenótipos de virulência e infecção in vivo em camundongos e mosquitos, respectivamente.

O protocolo aqui descrito permite a recuperação do vírus Zika infeccioso derivado de clones. Manipular o sistema de clones infecciosos de dois plasmídeos é direto quando realizado com cuidado, em comparação com versões completas que são altamente instáveis ​​(dados não mostrados). Após a digestão e a ligação das duas peças distintas, o ARN tampado é produzido usando transcrição in vitro com polimerase T7 que é então eletroporada em células Vero ( Figura 1</s...

Este protocolo descreve a recuperação do vírus Zika infeccioso a partir de um clone de cDNA infeccioso com dois plasmídeos.

Salvamento e Caracterização do Vírus Recombinante de um Clone Infeccioso do Vírus do Novo Mundo Zika

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

O objetivo geral deste procedimento é recuperar o vírus infeccioso a partir de um clone de Z-DNA de vírus Zika em duas partes. Este método pode responder perguntas fundamentais na área da flavivirologia, como estratégias de vacinas, patogênese, transmissão e evolução viral. A principal vantagem desta técnica é que o sistema em duas partes é mais estável do que as abordagens de sequência completa.Embora este método possa fornecer informações sobre o vírus Zika, ele também pode ser aplicado a outros sistemas virais que se mostraram difíceis de clonar devido à instabilidade do plasmídeo. O procedimento será demonstrado por James Weger, um pós-doutorando do meu laboratório. Comece preparando reações de digestão para ambos os plasmídeos que codificam o genoma do vírus Zika, P1 e P2. Digeste 3,3 microgramas de P1 com ApaL1 e BamH1 High Fidelity na presença de uma fosfatase competente em um volume final de 100 microlitros.Para P2, digira 13,3 microgramas de DNA de P2 com ApaL1 e EcoR1 High Fidelity em um volume final de 100 microlitros. Incube ambas as reações a 37 graus Celsius por 1,2 hora. Após purificar os plasmídeos digeridos utilizando um kit comercial de purificação de gel e PCR, adicione 30 microlitros de tampão de eluição pré-aquecido a 70 graus Celsius à coluna e incube por cinco minutos.Após centrifugar os plasmídeos digeridos purificados, prepare a reação de ligação combinando 29 microlitros do P1 purificado e 29 microlitros do P2 purificado com tampão de reação de ligação de DNA T4 e ligase de DNA T4 em água bidestilada, até um volume final de 100 microlitros. Incube a reação de ligação à temperatura ambiente por duas horas. Após a incubação, purifique o plasmídeo ligado como anteriormente.Desta vez, utilize 10 microlitros de tampão de eluição pré-aquecido. Em seguida, submeta os plasmídeos não digeridos, os plasmídeos digeridos e a ligação a um gel de agarose. Uma ligação bem-sucedida deve gerar um produto de ligação de aproximadamente 11 kb.Após confirmar que os plasmídeos migram com o peso molecular correto, monte uma reação de transcrição in vitro com T7 utilizando oito microlitros da reação de ligação purificada e incube por quatro horas a 37 graus Celsius. Após a incubação, meça a concentração de RNA por meio de um espectrofotômetro de UV. Um ou dois dias antes da eletroporação, prepare um frasco T182 com células Vero por construto a ser recuperado.Inclua um frasco T182 para ser usado como controle simulado de eletroporação. Quando as células estiverem com 70 a 80% de confluência, aqueça o DMEM contendo 15% de FBS e 10 milimolar de heaps em banho-maria aquecido a 37 graus Celsius. Desserre as células por tripsinização de acordo com métodos padrão e colete as células e o meio contendo 10% de FBS para inativar a tripsina.Em seguida, centrifugue as células a 150 × g durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Após lavar as células três vezes com PBS, suspenda cada pellet celular em RPMI 1640 acrescido de 10 milimolares de HEPES até uma concentração de aproximadamente 0,5 × 10⁷ células por mililitro. Transfira 200 microlitros da suspensão celular para um tubo estéril.Em seguida, adicione 20 microlitros de água como controle simulado ou 20 microlitros de RNA a cada conjunto de células. Misture suavemente as células agitando levemente o tubo e, em seguida, transfira o conteúdo do tubo para uma cubeta de eletroporação com intervalo de dois milímetros. Configure o eletroporador em 170 volts, resistência zero Omega e 950 microfarads.Pulse as células uma vez e adicione imediatamente 600 microlitros do meio pré-aquecido. Adicione as células a um frasco de cultura de tecidos T75 contendo 10 mililitros do meio pré-aquecido. Remova todo o meio remanescente do cubeta utilizando a pipeta incluída com o cubeta.Agite o frasco para misturar o meio e as células, e em seguida coloque-o no incubador a 37 graus Celsius. No dia seguinte e a cada dia subsequente, verifique a viabilidade das células até que seja observada uma morte celular de 50 a 75% em relação ao controle submetido à eletroporação simulada. Quando for observada morte celular de 50 a 75%, colete o sobrenadante em um tubo cônico e, em seguida, centrifugue a mais de 3.000 × g por 10 minutos a quatro graus Celsius para remover os detritos celulares.Após a centrifugação, transfira o sobrenadante clarificado para um novo tubo e adicione FBS até uma concentração final de 20%. Adicione, adicionalmente, HEPES estéril até uma concentração final de 10 milimolar como agente tampão para preservar a infectividade do vírus durante o congelamento. Por fim, homogeneíze o vírus por vortex e alíquotas em tubos com tampa de rosca. Armazene o vírus a menos 80 graus Celsius para uso futuro.Esta imagem mostra o efeito semelhante do vírus Zika do tipo selvagem PRVABC59 e derivado de clone infeccioso sobre a cinética de crescimento da linhagem celular de primata não humano Vero. Esta imagem mostra o efeito de ambos os vírus sobre células placentárias humanas. Cinéticas de crescimento semelhantes são observadas em uma linhagem derivada de mosquito C6/36.Esta curva de sobrevivência mostra dados obtidos de camundongos com quatro semanas de idade, deficientes nos receptores de interferon alfa, beta e gama, que foram inoculados com 1.000 PFU do vírus PRVABC59 ou do vírus derivado do clone infeccioso. Aedes aegypti foram dissecados 14 dias após uma refeição sanguínea contendo o vírus Zika. Ensaios de placa foram utilizados para avaliar a infecção nos corpos e pernas dos mosquitos, a fim de medir a disseminação, ou nas secreções salivares, para medir a transmissão do vírus infeccioso.As taxas são apresentadas como a porcentagem do total de mosquitos que foram testados. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de sequenciar todo o vírus. Também é importante lembrar-se de colher o vírus entre 50 e 75% de CPE para minimizar os ciclos de replicação viral.Essa técnica é importante para pesquisas na área de flavivirologia para explorar vacinas, patogênese e evolução viral no vírus Zika.

rescue-characterization-recombinant-virus-from-new-world-zika-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Resgate de vírus influenza A partir de DNA plasmídeo é uma técnica básica e essencial experimental que permite aos pesquisadores a gripe para gerar vírus recombinante para estudar os múltiplos aspectos da biologia do vírus da gripe, e para ser usado como vetores potenciais ou vacinas.

Geração de recombinante do vírus Influenza de DNA plasmidial

Este vídeo demonstra um procedimento para infectar células-tronco neurais fetais humanas com o vírus Zika. As células infectadas podem ser usadas para estudos adicionais.

Infecção pelo vírus Zika de células-tronco neurais fetais

Resgate de arenavírus recombinantes a partir de ADNc clonados, uma abordagem designada por genética reversa, permite aos investigadores para investigar o papel dos produtos de genes virais específicos, bem como a contribuição dos seus vários domínios e resíduos específicos, de diferentes aspectos da biologia do arenavírus . Da mesma forma, inverter técnicas de genética em linhas de células aprovadas pela FDA (Vero) para o desenvolvimento da vacina proporciona novas possibilidades para a...

Geração de Arenavirus recombinante de Desenvolvimento de Vacinas no FDA-approved células Vero

O vírus Zika (ZIKV), um patógeno emergente, está ligado a anormalidades no desenvolvimento fetal e microcefalia. O estabelecimento de um sistema eficaz de cultura de células infecciosas é crucial para estudos de replicação do ZIKV, bem como para o desenvolvimento de vacinas e medicamentos. Neste estudo, vários ensaios virológicos relativos ao ZIKV são ilustrados e discutidos.

Virus Zika sistema de cultura celular Infecciosas e do<em&gt; In Vitro</em&gt; Efeito profilático de interferões

Aqui nós descrevemos um método para estabelecer um modelo de Zika a microcefalia induzida por vírus no mouse. Este protocolo inclui métodos para inoculação intracerebral embrionária, neonatal e adulto-fase do vírus Zika.

Estabelecer modelos de Mouse para doenças neurológicas induzida por vírus Zika usando estratégias de injeção Intracerebral: embrionárias, Neonatal e adulto

Um protocolo para avaliar as respostas de células T antígeno-específicas nos órgãos immunoprivileged do Ifnar1- / - modelo murino para a infecção de vírus (ZIKV) Zika é descrito. Este método é essencial para investigar os mecanismos celulares da proteção e imunopatogênese das vacinas ZIKV e também é valioso para sua avaliação de eficácia.

Avaliação das respostas de células T Zika vírus específicos em órgãos Immunoprivileged de infectados Ifnar1- / - ratos

Nós descrevemos um método para avaliar o efeito da imunidade pré-existente contra vírus da dengue sobre a infecção pelo vírus Zika usando soro humano, células humanas primárias e quantificação de infecção por reação em cadeia da polimerase em tempo real quantitativa.

Quantificação de realce dependente de anticorpo do vírus nas células humanas primárias Zika

A recente epidemia do vírus Zika destaca a importância de estabelecer abordagens genéticas inversas para desenvolver vacinas e/ou estratégias terapêuticas. Aqui, nós descrevemos o protocolo para resgatar um vírus de recombinação contagioso do Zika de um clone full-length do cDNA montado em um cromossoma artificial bacteriano o controle do promotor imediato-adiantado humano do citomegalovírus.

Resgate do vírus Zika recombinante de um clone de cDNA de cromossomo artificial bacteriano

O objetivo do protocolo é demonstrar as técnicas utilizadas para investigar a doença viral, isolando e quantificando o vírus Zika, de múltiplos órgãos em um camundongo após a infecção.

Isolamento e quantificação do vírus Zika de múltiplos órgãos em um mouse

O protocolo apresentado pode determinar a competência vetorial das populações do mosquito Aedes aegypti para um determinado vírus, como o Zika, em um ambiente de contenção.

Análises de competência vetorial sobre mosquitos Aedes aegypti que usam zika vírus

Neste trabalho, descrevemos os protocolos usados em ensaios baseados em enzimas cílicas e virais para triagem de inibidores da replicação do vírus Zika em um formato de triagem de alto rendimento.

Ensaios antivirais de alta produtividade para tela para inibidores da replicação do vírus Zika

Aprenda a recuperar o vírus Zika infeccioso a partir de um clone de cDNA em duas partes. Este método oferece vantagens de estabilidade para pesquisas em flavivirologia e pode ser aplicado a outros sistemas virais difíceis de clonar.

Salvamento e Caracterização do Vírus Recombinante de um Clone Infeccioso do Vírus do Novo Mundo Zika

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